一种芽孢杆菌菌液应用于刺参苗种培养的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其是一种芽孢杆菌菌液应用于刺参饲养的方法。
背景技术
益生菌目前在水产养殖中发挥着巨大的作用。益生菌本身含有丰富的营养物质，可直接为水产动物提供可利用的氨基酸和维生素等。而且，益生菌可产生多种有机酸，这些有机酸可促进水寒动物对钙、铁离子以及维生素D的吸收。益生菌能够维持水产动物胃、肠道内的菌群平衡，改善胃肠道功能，改善饲料品质，提高消化利用率，其在肠道内还可以合成宿主动物维持生命活动所需的多种氨基酸、维生素等供给宿主动物利用。益生菌在代谢过程中能产生各种酶类，这些酶类与水产动物体内的消化酶相互作用并能促进其活性，可以促进水产动物免疫器官的生长发育，并能激活机体的免疫反应，激发水产动物的体液免疫和细胞免疫，提高水产动物体液中各种酶活力。益生菌还有很好的抗病效果，一方面益生菌与病原菌之间，通过定殖部位、生存与繁殖空间以及营养物质的竞争来排斥与限制病原菌。另一方面益生菌通过分泌产生抗菌素等活性物质，来抑制病原菌。在水产养殖中，益生菌的作用不仅于此，它还能在养殖水体中存活，降解有机质，分解转化有害物质，稳定水体的pH，有效地改善养殖生态环境、维持生态平衡。
CN101028007A涉及一种专业水产养殖益生菌素消毒抑菌生物制剂，其主要成分是枯草杆菌芽孢素、地衣芽孢杆菌素、双歧杆菌素、乳酸菌素、饵料按比例混合经生物技术特殊工艺制成粉剂。枯草杆菌芽孢素、地衣芽孢杆菌素、双歧杆菌素、乳酸菌素是纯化种菌种的培养物，这些益生菌参与养殖环境和动物消化道有益菌群与致病菌之间生存和繁殖的空间、时间、定居部位、以及营养素的竞争，胁迫致病菌群的生存、繁殖、定居以及附着。有益菌群在代谢过程中产生挥发性脂肪酸和乳酸，降低生长环境内的ph和Eh，产生过氧化氢，抑制病原；其生长代谢菌素为抗生素和细菌素，能杀死病原菌。饵料为水藻几各种营养成分，为益生菌的载体。该发明适合于各类水产养殖业的各种养殖物种的抗菌消毒；效果好、对被消毒的人体和养殖物种无毒害，对水质和环境无污染；操作使用方法简便；特殊工艺制备的益生菌素，是水产养殖业更新换代的消毒灭菌产品。尤其是在抑制有害微生物，防止水产养殖物种弧菌病的发生；改善养殖物种的机体代谢，补充机体营养成分；刺激机体免疫系统，提高机体免疫力；参与生物降解，消除有机污染物等方面尤为突出。
CN105209596A涉及利用新型生物加工技术来生产鲍鱼益生微生物的工艺和培养基。目前并不存在用于生产鲍鱼益生菌的商业上可行的生物工艺。该发明促进了如下的鲍鱼益生菌的生物生产：从细菌益生菌Vibrio midae、或酵母益生菌汉逊德巴利酵母或者它们的组合的小体积低温培养物生产益生菌产物。该发明描述了接种程序、发酵工艺、生物质收集以及将生物质制成可掺入到鲍鱼饲料中的液体产品或干燥产品。
CN108208464A涉及一种水产养殖用益生菌饲料的制备方法。该发明的方法以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为原料，经过一次发酵熟化和去杂菌，然后利用生物发酵技术，进行二次发酵，制得富含三种不同习性益生菌的益生菌饲料，实现了农海产品加工下脚料的回收再利用，不仅有利于保护环境，而且将极大缓解我国面临的制作饲料用的原材料短缺问题，此外，用该发明方法制得的水产养殖用益生菌饲料还具有提高鱼类、贝类、虾蟹等养殖物种体质的作用，有效提高养殖产出。
综上所述，益生菌在水产养殖中已得到广泛应用，。但是水产行业的益生菌产业还存在诸多问题，如针对水产养殖特性开发的对口菌种较少、活菌制剂在保存和运输中容易失活、市场不规范水产益生菌剂产品质量参差不齐、养殖从业人员在对益生菌质量鉴别方面能力不足等，最主要的矛盾是：养殖户对高质量益生菌产品的需求和水产益生菌产品性价比低之间的矛盾。目前市售水产养殖用益生菌产品质量好的，售价高，养殖户大水面使用成本较大；而价格低的产品，活菌少，杂菌多，产品质量不能保证。益生菌产品从厂家到养殖一线，除却厂家生产成本，还有包装、物流、中间商差价等费用，这也决定了养殖企业和养殖户终端购买的益生菌产品价格偏高，时效性差，在运输和储存过程中活菌数降低。近年来，也有一些养殖户利用现有条件，购买菌种和培养基自己进行发酵操作，但是由于操作流程不规范，发酵出的菌液含菌数较少，杂菌多，影响使用效果，因此急需一种适用于养殖一线的简易益生菌培养方法，养殖企业和养殖户不需要使用发酵罐，就可通过该方法获得满足水产养殖用的高质量菌液，保证益生菌投放效果的同时降低养殖成本。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种芽孢杆菌菌液应用于刺参饲养的方法，刺参苗种单体质量1-10g，培养密度100-500g/m3，期间保持充气，海水温度15～25℃， pH7.8～8.2，盐度28～32。每日换水后投喂饲料，饲料日投量为刺参体重的3～10％。采用本发明方法培育的芽孢杆菌菌液，通过比浊法将菌液按照107或109cfu/g的浓度配比混合在饲料中用于投喂刺参。
通过本方法培养的芽孢杆菌对促进刺参幼参生长、提高消化酶活力、增强免疫防御功能具有显著的益生作用，且呈剂量依赖性，当饲料中芽孢杆菌的添加浓度为107、109cfu/g时，刺参的生长力、消化酶活性、免疫酶活性和抵抗灿烂弧菌的能力得到显著提高，这表明这种方法培养的芽孢杆菌可以作为一种安全有效的益生菌添加剂应用于刺参养殖。
进一步的，本发明还公开了一种适用于水产养殖的益生菌简易培养方法；
一种适用于水产养殖的益生菌简易培养方法，其方法操作如下：
步骤一：益生菌培养室内要求温度可控，根据房间空间安装紫外线灯，平均每立方米2～5w；
步骤二：使用敞口塑料桶作为益生菌培养容器，根据桶口大小裁剪透明塑料布用于封口，塑料布盖在桶口上，四周用绳扎紧。塑料布中央穿孔，以便于充气管通过，塑料布和气管接触处用绳扎紧，接种前所有物品用紫外线灯照射1～3小时消毒；
步骤三：扩培过程中所用烧杯、量筒等工具放入水中煮沸10～30分钟消毒；
步骤四：充气管道经过精密过滤系统过滤；
步骤五：将经过沉淀和砂滤的海水或淡水加入步骤1中的塑料桶中，加水量为桶容量的1/2～ 3/4。每升海水或者淡水加入5～10ml次氯酸钠(有效氯10～20％)，按照步骤1封口充气， 12～16个小时后，每升海水或淡水加入0.45～0.9g硫代硫酸钠中和，硫代硫酸钠在清水中烧开后加入桶中，充气半小时后用淀粉碘化钾测试有无余氯。用氢氧化钠或盐酸溶液将pH调至6.5～7.5。
步骤六：清水中加入培养基，烧开融化后倒入步骤5中的塑料桶中，随后加入益生菌种，接种量2～5％，按照步骤1封口，保温充气。
步骤七：培养3～5天后，桶中有益菌数15×108～40×108个/ml，直接投放至养殖池塘。
所述的三级精密过滤器使用一种纳米级空气过滤材料制备而成，其制备方法如下：
步骤一：按照质量份数，50-65份的长纤维木浆，28-36份的椴木木浆纤维，18-25份的丝光化针叶木浆纤维和10-18份的对位芳纶浆粕纤维混合均匀后进行打浆，然后加入300-400份的质量百分比浓度2-5％的硫酸，再加入3-7份的烯丙基二甲氧基硅烷，控温60-72℃，继续打浆混合1-5h后，再加入0.5-2份过硫酸铵，0.3-2.4份的D-烯丙基甘氨酸，控温50-68℃，继续打浆混合0.5-2.5h后，进行疏解、脱水、干燥后得到空气过滤原纸，空气过滤原纸定量为85-105g/m2；
步骤二：然后在100-200份的固含量为35％-45％的丙烯酸乳液中加入0.1-0.5份的羧基化碳纳米管，混合搅拌10-30min后超声处理30-60min，分散均匀后涂布在空气过滤原纸的表面，涂布量为4-10g/m2，然后在90-110℃下干燥120-180s，即可得到所述的一种纳米级空气过滤材料。
所述长纤维木浆，椴木木浆纤维，丝光化针叶木浆纤维引入烯丙基，与D-烯丙基甘氨酸共聚合，制得硅烷改性木浆纤维。木浆纤维成分主要为纤维素，其部分反应示意如下：
进一步的，硅烷改性木浆纤维与D-烯丙基甘氨酸进行接枝共聚，其其部分反应示意如下：
本发明的一种适用于水产养殖的益生菌简易培养方法，本发明养殖企业和养殖户不需要使用发酵罐，就可通过该方法获得满足水产养殖用的高质量菌液，本发明提供的一种纳米级空气过滤材料使用在三级精密空气过滤器中，能保证完全滤除空气中的杂菌，确保生产质量，保证益生菌投放效果的同时降低养殖成本。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
图1为PCR扩增结果鉴定胶图；
图2为细菌16S扩增产物电泳图；
图3为细菌16S基因样品的荧光定量PCR扩增曲线；
图4为细菌16S基因样品的荧光定量PCR熔解曲线；
图5为细菌16S基因标准品的荧光定量PCR扩增曲线；
图6为Illumina PE250测序实验流程；
图7为芽孢杆菌对刺参胰蛋白酶活性的影响；
图8为芽孢杆菌对刺参脂肪酶活性的影响；
图9为芽孢杆菌对刺参淀粉酶活性的影响；
图10为芽孢杆菌对刺参酸性磷酸酶活性的影响；
图11为芽孢杆菌对刺参碱性磷酸酶活性的影响；
图12为芽孢杆菌对刺参超氧化物歧化酶活性的影响；
图13为芽孢杆菌对刺参溶菌酶活性的影响；
图14为芽孢杆菌对攻毒刺参肠道灿烂弧菌的抑菌作用。
具体实施方式
以下检测方法如下：
1.PCR预实验
1.1引物设计
1.2 PCR扩增条件
PCR采用30μl反应体系：
qPCR Mix......................15μl
Mg2+(25mM).....................2μl
Forward Primer(10μM)..........0.5μl
Reverse Primer(10μM)..........0.5μl
Template DNA..................2μl
_____________________________________________________
补ddH2O至.....................30μl
细菌16S基因PCR反应参数：
a.1×(3min at 95℃)
b.30×(30s at 94℃；30s at*****℃；30s at 79℃)
1.3 PCR扩增结果鉴定胶图
1.3.1细菌16S扩增产物电泳图
1.4 PCR扩增结果
进行PCR扩增条件摸索后，PCR扩增结果统计如下：
1.5结果说明
1.6.标准品制备
构建好的质粒经线性化处理后，纯化定量并通过公式换算成拷贝数(copies/μl)，10倍梯度稀释构建好的标品，90μl稀释液+10μl质粒，一般做4-6个点，通过预实验分别选取标准品的10-2～10-6稀释液用于制备标准曲线。
*注：质粒起始拷贝数换算公式(copies/μl)＝浓度(ng/μl)*10-9*6.02*1023/(分子量*660)
1.7.荧光定量PCR检测
PCR采用30μl反应体系：
qPCR Mix......................15μl
Mg2+(25mM)....................2μl
Forward Primer(10μM)..........0.5μl
Reverse Primer(10μM)..........0.5μl
Template DNA..................2μl
染料..........................0.5μl
_____________________________________________________
补ddH2O至.....................30μl
细菌16S rDNA基因PCR反应参数：
a.1×(3min)at 95℃)
b.30×(30s)at 94℃；30s at 60℃；30s at 79℃)
2利用该方法培养的菌液高通量测序分析实验方法
2.1 Illumina PE250测序实验流程
2.1.1基因组DNA抽提
完成基因组DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
2.1.2 PCR扩增
按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。
为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。PCR采用TransGen AP221-02： TransStartFastpfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI
2.1.3荧光定量
参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司) 进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
2.1.4 Illumina PE250文库构建
1)连接“Y”字形接头；
2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；
3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；
4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。
2.1.5 Illumina PE250测序
1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
3)PCR扩增，产生DNA簇；
4)DNA扩增子线性化成为单链。
5)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基； 6)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
7)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
8)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
2.2生物信息分析流程
Illumina PE250测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。
下面通过具体实施例对该发明作进一步说明：
实施例1
步骤一：乳酸菌培养室内要求温度可控，根据房间空间安装紫外线灯，平均每立方米2w；
步骤二：使用敞口塑料桶作为乳酸菌培养容器，根据桶口大小裁剪透明塑料布用于封口，塑料布盖在桶口上，四周用绳扎紧。塑料布中央穿孔，以便于充气管通过，塑料布和气管接触处用绳扎紧，接种前所有物品用紫外线灯照射1小时消毒；
步骤三：扩培过程中所用烧杯、量筒等工具放入水中煮沸10分钟消毒；
步骤四：充气管道经过精密过滤系统过滤；
步骤五：将经过沉淀和砂滤的海水或淡水加入步骤1中的塑料桶中，加水量为桶容量的3/4。每升海水或者淡水加入5ml次氯酸钠(有效氯10)，按照步骤1封口充气，12个小时后，每升海水或淡水加入0.45g硫代硫酸钠中和，硫代硫酸钠在清水中烧开后加入桶中，充气半小时后用淀粉碘化钾测试有无余氯。用氢氧化钠或盐酸溶液将pH调至7.5。
步骤六：清水中加入培养基，烧开融化后倒入步骤5中的塑料桶中，随后加入乳酸菌种，接种量5％，按照步骤1封口，保温充气。
步骤七：培养5天后，桶中有益菌数40×108个/ml，直接投放至养殖池塘。
取桶中菌液1ml，稀释100倍用血球计数板计数，定量乳酸菌数22.6×108个/ml，镜检未见杂菌。
所述的三级精密过滤器使用一种纳米级空气过滤材料制备而成，其制备方法如下：
步骤一：按照质量份数，50份的长纤维木浆，28份的椴木木浆纤维，18份的丝光化针叶木浆纤维和10份的对位芳纶浆粕纤维混合均匀后进行打浆，然后加入300份的质量百分比浓度 2％的硫酸，再加入3份的烯丙基二甲氧基硅烷，控温60℃，继续打浆混合1h后，再加入0.5 份过硫酸铵，0.3份的D-烯丙基甘氨酸，控温50℃，继续打浆混合0.5h后，进行疏解、脱水、干燥后得到空气过滤原纸，空气过滤原纸定量为85-105g/m2；
步骤二：然后在100份的固含量为35％的丙烯酸乳液中加入0.1份的羧基化碳纳米管，混合搅拌10min后超声处理30min，分散均匀后涂布在空气过滤原纸的表面，涂布量为4g/m2，然后在90℃下干燥120s，即可得到所述的一种纳米级空气过滤材料。
取本方法培养出的乳酸菌进行荧光定量PCR实验
表1：PCR预实验样品检测结果
PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，熔解曲线峰图与目标峰一致，定量值均大于500，定量值精确可靠，可进行后续实验。
表2：乳酸菌液多样性高通量测序结果
在属的水平上，通过该方法培养得到的乳酸菌液中乳杆菌属(Lactobacillus)含量最高，占细菌总数的比例高达99％以上，其余杂菌所占比例小于1％。
实施例2
一种适用于水产养殖的益生菌简易培养方法，其方法操作如下：
步骤一：枯草芽孢培养室内要求温度可控，根据房间空间安装紫外线灯，平均每立方米3w；
步骤二：使用敞口塑料桶作为枯草芽孢培养容器，根据桶口大小裁剪透明塑料布用于封口，塑料布盖在桶口上，四周用绳扎紧。塑料布中央穿孔，以便于充气管通过，塑料布和气管接触处用绳扎紧，接种前所有物品用紫外线灯照射2小时消毒；
步骤三：扩培过程中所用烧杯、量筒等工具放入水中煮沸15分钟消毒；
步骤四：充气管道经过精密过滤系统过滤；
步骤五：将经过沉淀和砂滤的海水或淡水加入步骤1中的塑料桶中，加水量为桶容量的3/5。每升海水或者淡水加入7ml次氯酸钠(有效氯14％)，按照步骤1封口充气，14个小时后，每升海水或淡水加入0.6g硫代硫酸钠中和，硫代硫酸钠在清水中烧开后加入桶中，充气半小时后用淀粉碘化钾测试有无余氯。用氢氧化钠或盐酸溶液将pH调至7。
步骤六：清水中加入培养基，烧开融化后倒入步骤5中的塑料桶中，随后加入地衣芽孢种，接种量4％，按照步骤1封口，保温充气。
步骤七：培养4天后，桶中枯草芽孢菌数22×108个/ml，直接投放至养殖池塘。
所述的三级精密过滤器使用一种纳米级空气过滤材料制备而成，其制备方法如下：
步骤一：按照质量份数，55份的长纤维木浆，31份的椴木木浆纤维，19份的丝光化针叶木浆纤维和15份的对位芳纶浆粕纤维混合均匀后进行打浆，然后加入380份的质量百分比浓度 3％的硫酸，再加入5份的烯丙基二甲氧基硅烷，控温65℃，继续打浆混合2h后，再加入1 份过硫酸铵，1.3份的D-烯丙基甘氨酸，控温55℃，继续打浆混合0.8h后，进行疏解、脱水、干燥后得到空气过滤原纸，空气过滤原纸定量为95g/m2；
步骤二：然后在120份的固含量为38％的丙烯酸乳液中加入0.3份的羧基化碳纳米管，混合搅拌15min后超声处理50min，分散均匀后涂布在空气过滤原纸的表面，涂布量为6g/m2，然后在90-110℃下干燥150s，即可得到所述的一种纳米级空气过滤材料。
取本方法培养出的乳酸菌进行荧光定量PCR实验
表3：PCR预实验样品检测结果
PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，熔解曲线峰图与目标峰一致，定量值均大于500，定量值精确可靠，可进行后续实验。
表4；芽孢杆菌菌液多样性高通量测序结果
在属的水平上，通过该方法培养得到的芽孢杆菌菌液中芽孢菌属(Bacillus)含量最高，占细菌总数的比例高达99％以上，其余杂菌所占比例小于1％。
实施例3
一种适用于水产养殖的益生菌简易培养方法，其方法操作如下：
步骤一：乳酸菌培养室内要求温度可控，根据房间空间安装紫外线灯，平均每立方米5w；
步骤二：使用敞口塑料桶作为益生菌培养容器，根据桶口大小裁剪透明塑料布用于封口，塑料布盖在桶口上，四周用绳扎紧。塑料布中央穿孔，以便于充气管通过，塑料布和气管接触处用绳扎紧，接种前所有物品用紫外线灯照射3小时消毒；
步骤三：扩培过程中所用烧杯、量筒等工具放入水中煮沸30分钟消毒；
步骤四：充气管道经过精密过滤系统过滤；
步骤五：将经过沉淀和砂滤的海水或淡水加入步骤1中的塑料桶中，加水量为桶容量的3/4。每升海水或者淡水加入10ml次氯酸钠(有效氯20％)，按照步骤1封口充气，16个小时后，每升海水或淡水加入0.9g硫代硫酸钠中和，硫代硫酸钠在清水中烧开后加入桶中，充气半小时后用淀粉碘化钾测试有无余氯。用氢氧化钠或盐酸溶液将pH调至7.5。
步骤六：清水中加入培养基，烧开融化后倒入步骤5中的塑料桶中，随后加入乳酸菌种，接种量5％，按照步骤1封口，保温充气。
步骤七：培养5天后，桶中乳酸菌数40×108个/ml，直接投放至养殖池塘。
所述的三级精密过滤器使用一种纳米级空气过滤材料制备而成，其制备方法如下：
步骤一：按照质量份数，65份的长纤维木浆，36份的椴木木浆纤维，25份的丝光化针叶木浆纤维和18份的对位芳纶浆粕纤维混合均匀后进行打浆，然后加入400份的质量百分比浓度 5％的硫酸，再加入7份的烯丙基二甲氧基硅烷，控温72℃，继续打浆混合5h后，再加入2 份过硫酸铵，2.4份的D-烯丙基甘氨酸，控温68℃，继续打浆混合2.5h后，进行疏解、脱水、干燥后得到空气过滤原纸，空气过滤原纸定量为105g/m2；
步骤二：然后在200份的固含量为45％的丙烯酸乳液中加入0.5份的羧基化碳纳米管，混合搅拌30min后超声处理60min，分散均匀后涂布在空气过滤原纸的表面，涂布量为10g/m2，然后在110℃下干燥180s，即可得到所述的一种纳米级空气过滤材料。
取本方法培养出的乳酸菌进行荧光定量PCR实验。
表5：PCR预实验样品检测结果
PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，熔解曲线峰图与目标峰一致，定量值均大于500，定量值精确可靠，可进行后续实验。
表6：乳酸菌液多样性高通量测序结果
在属的水平上，通过该方法培养得到的乳酸菌液中乳杆菌属(Lactobacillus)含量最高，占细菌总数的比例高达99％以上，其余杂菌所占比例小于％。
实施例4
一种芽孢杆菌菌液应用于刺参饲养的方法:
1材料与方法
1.1材料
试验用刺参幼参、饲料由辽宁省海水养殖引育种中心提供。刺参幼参单体质量(7.17±0.86) g，鲜活样品取回后于人工育苗池常规条件下暂养一周。暂养期间保持充气，海水水温16℃，pH7.9，盐度29.3。每日换水后投喂饲料，饲料日投量为幼参体重的3～5％。试验用芽孢杆菌为本方法培养。攻毒试验所用病原菌为灿烂弧菌，分离自“腐皮综合症”刺参病灶部位。
1.2饲养方法
将暂养7d后的刺参随机分配至相同规格水族箱中，每箱200头。将菌株培养至对数生长期， 4℃、12000r/min离心10min，弃上清，加无菌海水重悬。采用比浊法将菌液按照105、107、 109、1011cfu/g的浓度配比分别混合在饲料中添加到不同组的养殖水体中。试验期间保持充气，饲养条件与暂养时期一致。试验共设5个处理，3次平行，每个处理3次重复。分别于试验第0、10、20、30、40d取样测定刺参生长、消化和免疫指标。
1.3刺参生长指标的测定
分别在投喂芽孢杆菌菌0、10、20、30、40d测定刺参体质量，并计算其质量增加率和特定生长率。质量增加率及特定生长率计算公式如下：
质量增加率计算公式①WGR/％＝(Wt-W0)/Wt；
特定生长率计算公式②SGR/％·d-1＝(lnWt-lnW0)/t。
式中，Wt为td时的刺参体质量，W0为刺参初始体质量，t为时间(d)。
1.4刺参肠道消化酶活性的测定
分别在投喂芽孢杆菌第0、10、20、30、40d从每个试验组随机取5头刺参，解剖刺参取肠组织，于冰盘上剔除肠道内容物及肠系膜，用磷酸缓冲液(pH7.5)冲洗后用滤纸吸干，以 10倍磷酸缓冲液匀浆。匀浆液于4℃、3000r/min离心20min，上清液即为粗酶液。
根据南京建成科技有限公司胰蛋白酶测试盒测定胰蛋白酶活性，定义在pH8.0，37℃条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活力单位。
根据南京建成科技有限公司脂肪酶测试盒测定脂肪酶活性，定义在37℃条件下，每毫克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1min，每消耗1umol底物为一个酶活力单位。
根据南京建成科技有限公司淀粉酶测试盒测定淀粉酶活性，定义组织中每毫克蛋白在 37℃与底物作用30min，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。
1.5刺参体腔液中免疫指标的测定
分别在投喂芽孢杆菌第0、10、20、30、40d从每个试验组随机取5头刺参，沥水10min后用无菌注射器从刺参腹部抽取体腔液0.5ml，置于预冷离心管中，合并体腔液。4℃、3000r/min离心20min，取上清液用于测定酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶及溶菌酶活性。采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测刺参的免疫酶活性。
酸性磷酸酶与碱性磷酸酶的测定原理均为其分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。酸性磷酸酶活力定义为100mL上清在37℃与基质作用30min产生1mg 酚为一个活力单位。碱性磷酸酶活力定义为100mL上清在37℃与基质作用15min产生1mg 酚为一个活力单位。
超氧化物歧化酶测定原理为通过黄嘌呤及其氧化酶反应系统产生(O2-)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品含超氧化物歧化酶时，则对照超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值。超氧化物歧化酶活力定义为每次反应中酶抑制率达50％时所对应的酶量为一个超氧化物歧化酶活力单位。
溶菌酶测定原理为在一定浓度的浑浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低，透光度增强，故可以根据透光度变化来推测溶菌酶的含量。溶菌酶的活性采用比浊法测定，根据37℃下，样品、标准品、蒸馏水与应用酶液反应时的透光度来计算样品中溶菌酶的活力。
1.6芽孢杆菌对刺参抵抗灿烂弧菌感染的影响
为了验证芽孢杆菌对刺参的免疫保护效果，在投喂试验结束后，每组随机抽取20头刺参用于灿烂弧菌攻毒试验。将二次活化的灿烂弧菌接种在2216E培养基上，28℃培养24h后用无菌生理盐水稀释到一系列浓度，通过预试验确定灿烂弧菌对刺参的半致死浓度为2×107 cfu/mL。每头刺参经腹腔注射100uL半致死浓度的灿烂弧菌，记录攻毒14d后各组刺参的生理反应及累积死亡率，并计算相对免疫保护率。攻毒14d后，从每个试验组随机取5头刺参，分别解剖切取肠组织(约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小)，合并切块组织放入50mL离心管中，加入30mLPBS缓冲液，放入组织匀浆机中处理10min，匀浆液于4℃、3000r/min离心10min，用无菌生理盐水将上清液稀释10倍，取200μL涂布至TCBS弧菌选择性培养基，28℃倒置培养，2d后统计各组刺参肠道弧菌数目。累积死亡率及相对免疫保护率计算公式如下：吐肠率计算公式①ER/％＝Ne/N0；
累积死亡率计算公式②CMR/％＝(N0-Nt)/N0；
相对免疫保护率计算公式③RPS/％＝1-(Mt/M0)。
式中，N0为刺参试验初始个体数，Ne为刺参排脏个体数，Nt为刺参试验终末存活个体数，Mt为攻毒组死亡率，M0为对照组死亡率。
1.7数据处理
数据用SPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA)以及Dunncan多重比较法，结果以平均值±标准差(X±SD)表示，当P<0.05时认为差异显著，结果中标有不同小写字母时表示差异显著。
2.结果与分析
2.1刺参生长指标的测定
投喂芽孢杆菌前，各试验组群中幼参个体平均湿重差别不大。到试验终止时，各试验组群幼参体质量均呈现增长趋势。其中芽孢杆菌添加浓度为109cfu/g的试验组的刺参的增重率及特定生长率相对最高。而芽孢杆菌添加浓度为105、1011cfu/g的试验组的刺参的增重率及特定生长率均低于对照组(表1)。
表7：芽孢杆菌对刺参幼参增重率和特定生长率的影响
注：数据表示为平均值±标准偏差.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间无显著性差异(P>0.05)。
2.2芽孢杆菌对刺参消化酶活性的影响
不同浓度芽孢杆菌对刺参肠道消化酶活性的影响见图7-图9。其中A、B、C、D组饲料中芽孢杆菌的活菌添加浓度分别为105、107、109、1011cfu/g，CK组为饲料中未添加芽孢杆菌的对照组。图7为芽孢杆菌对刺参肠道胰蛋白酶活性的影响。随着投喂时间的延长，试验组与对照组的胰蛋白酶活性均逐步增加。在投喂10d时，A组与B组的胰蛋白酶活性显著高于对照组(P<0.05)。在投喂20d后，A组的胰蛋白酶活性增长缓慢，而B组与C组的胰蛋白酶活性显著高于对照组(P<0.05)。
芽孢杆菌对刺参肠道脂肪酶活性的影响见图8。随着投喂时间的延长，试验组与对照组的脂肪酶活性均逐步增加。而B组的脂肪酶活性相对于对照组及其他试验组上升更快，其脂肪酶活性显著高于同时期的对照组及试验组(P<0.05)。
芽孢杆菌对刺参肠道淀粉酶活性的影响见图9。随着投喂时间的延长，试验组与对照组的淀粉酶活性呈现先升高后降低的趋势，在投喂30d时，对照组及各试验组的淀粉酶活性达到最高。其中D组的淀粉酶活性低于同一时期的对照组，而B组和C组的淀粉酶活性与对照组相比均表现出显著差异(P<0.05)。
2.3芽孢杆菌对刺参免疫酶活性的影响
不同浓度芽孢杆菌对刺参体腔液免疫酶活性的影响见图10-图13。其中A、B、C、D组饲料中芽孢杆菌的活菌添加浓度分别为105、107、109、1011cfu/g，CK组为饲料中未添加芽孢杆菌的对照组。图10为芽孢杆菌对刺参体腔液酸性磷酸酶活性的影响。随着投喂时间的延长，试验组酸性磷酸酶活性均高于对照组，在投喂30d后，B组与C组的酸性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，而A组与D组中酸性磷酸酶的活力与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
芽孢杆菌对刺参体腔液碱性磷酸酶活性的影响见图11。随着投喂时间的延长，各试验组的碱性磷酸酶活性均逐步增加且高于同时期的对照组。其中，C组碱性磷酸酶活性升高最多，B组次之。二者碱性磷酸酶活性均显著高于同时期的对照组(P<0.05)。
芽孢杆菌对刺参体腔液超氧化物歧化酶活性的影响见图12。试验组与对照组的超氧化物歧化酶活性均呈现先升高后降低的趋势，在投喂30d时，对照组及各试验组的超氧化物歧化酶活性达到最高。而在投喂30d后，B组与C组的超氧化物歧化酶活性显著高于对照组(P<0.05)，而A组与D组中超氧化物歧化酶的活力与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
芽孢杆菌对刺参体腔液溶菌酶活性的影响见图13。随着投喂时间的延长，试验组与对照组的溶菌酶活性均逐步增加，在投喂20d时，B组与D组的溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05)，而在投喂30d后，D组的溶菌酶活性增长缓慢，B组与C组的溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05)。
2.4芽孢杆菌对刺参抵抗灿烂弧菌感染的影响
注射灿烂弧菌后，试验组与对照组刺参均出现不同程度的肿嘴、摇头、吐肠等不良生理反应。芽孢杆菌的浓度为1011cfu/g时，刺参的累积死亡率、吐肠率较高，相对免疫保护率较低。芽孢杆菌的浓度为107cfu/g时，刺参的累积死亡率和吐肠率相对较低，而相对免疫保护率较高(表 2)。攻毒试验之后，取各组刺参肠道组织稀释液涂布至弧菌选择性培养基，其中A、B、C、 D组饲料中芽孢杆菌的活菌添加浓度分别为105、107、109、1011cfu/g，CK组为饲料中未添加芽孢杆菌的对照组。其中B组的灿烂弧菌数目最少，C组次之，二者的灿烂弧菌数目均明显少于对照组和其他处理组。
表8：芽孢杆菌对刺参抵抗灿烂弧菌感染的影响
实施例5
一种芽孢杆菌菌液应用于刺参饲养的方法:
试刺参单体质量(4.20±0.51)g，暂养密度385g/m3，期间保持充气，海水水温24℃，pH8，盐度30.5。每日换水后投喂饲料，饲料日投量为幼参体重的8％。采用比浊法将枯草芽孢菌液按照105、107、109、1011cfu/g的浓度配比分别混合在饲料中添加到不同组的养殖水体中。试验期间保持充气，饲养条件与暂养时期一致。试验共设5个处理，3次平行，即每个处理3 次重复。分别在投喂芽孢杆菌0、10、20、30、40d测定刺参体质量，每组每个平行取5个个体，并计算其质量增加率和特定生长率。质量增加率及特定生长率计算公式如下：
质量增加率计算公式①WGR/％＝(Wt-W0)/Wt；
特定生长率计算公式②SGR/％·d-1＝(lnWt-lnW0)/t。
式中，Wt为td时的刺参体质量，W0为刺参初始体质量，t为时间(d)
投喂芽孢杆菌前，各试验组群中幼参个体平均湿重差别不大。到试验终止时，各试验组群幼参体质量均呈现增长趋势。其中芽孢杆菌添加浓度为107和109cfu/g的试验组的刺参的增重率及特定生长率相对较高。(表9)。
表9：芽孢杆菌对刺参幼参增重率和特定生长率的影响
注：数据表示为平均值±标准偏差.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间无显著性差异(P>0.05)。
实施例6
一种芽孢杆菌菌液应用于刺参饲养的方法:
刺参单体质量(1.14±0.51)g，暂养密度200g/m3，期间保持充气，海水水温20℃，pH8.2，盐度28。每日换水后投喂饲料，饲料日投量为幼参体重的6％。采用比浊法将枯草芽孢菌液按照105、107、109、1011cfu/g的浓度配比分别混合在饲料中添加到不同组的养殖水体中。试验期间保持充气，饲养条件与暂养时期一致。试验共设5个处理，3次平行，即每个处理3 次重复。分别在投喂芽孢杆菌0、10、20、30、40d测定刺参体质量，每组每个平行取5个个体，并计算其质量增加率和特定生长率。质量增加率及特定生长率计算公式如下：
质量增加率计算公式①WGR/％＝(Wt-W0)/Wt；
特定生长率计算公式②SGR/％·d-1＝(lnWt-lnW0)/t。
式中，Wt为td时的刺参体质量，W0为刺参初始体质量，t为时间(d)
投喂芽孢杆菌前，各试验组群中幼参个体平均湿重差别不大。到试验终止时，各试验组群幼参体质量均呈现增长趋势。其中芽孢杆菌添加浓度为107和109cfu/g的试验组的刺参的增重率及特定生长率相对最高。(表10)。
表10：芽孢杆菌对刺参幼参增重率和特定生长率的影响
注：数据表示为平均值±标准偏差.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母表示组间无显著性差异(P>0.05)。
综上所述，通过本方法培养的芽孢杆菌对促进刺参幼参生长、提高消化酶活力、增强免疫防御功能具有显著的益生作用，且呈剂量依赖性。综合各项指标可以看出，当饲料中芽孢杆菌的添加浓度为107、109cfu/g时，刺参的生长力、消化酶活性、免疫酶活性和抵抗灿烂弧菌的能力得到显著提高，这表明这种方法培养的芽孢杆菌可以作为一种安全有效的益生菌添加剂应用于刺参养殖。
