一种猪饲料及投喂以增强免疫力的方法
技术领域
本发明涉及一种兽药产品技术领域，尤其涉及一种能够增强育肥猪免疫%20力的猪饲料。
背景技术
新生猪从母猪的初乳中能够获得对随后的发育过程中的必要营养素及对%20环境病原体具有抵抗力的免疫技能。初次育肥猪在育肥开始时投喂药剂会导%20致这个时期的感染症死亡率升高，此后的二次育肥开始的时期也容易发生肺%20炎的情况。猪的肺炎的对策是一直在探讨的问题。近年，呼吸道综合征及禽%20流感的对策也变得重要起来。
猪的白血球数在12,000～30,000/μl，发热时扩大2,000～8,000/μl的数值。%20白血球数量减少则感染症更会容易发生。白血球活动活泼的状态下猪的免疫%20性能将会上升。现有技术中，在人类的临床上有注射β-1,3-D-葡聚糖来获得免%20疫力增强的做法。绣球菌MH-3的β-1,3-D-葡聚糖具有简单的结构类型，世界%20上也开始有小鼠经口投喂以获得多种免疫增强作用的报告。
本文从绣球菌MH-3对5种白血球种类的平衡是否有促进作用的假设出%20发，对初次育肥猪进行绣球菌MH-3的自主经口摄食投喂，来进行包括猪的%20肺炎和流感的免疫增强作用效果的实验。
日本专利JP4183326B2公开了一种绣球菌提取物，其在对绣球菌的生理%20活性进行研究的过程中，发现该绣球菌提取物中所含的β-1,3-D-葡聚糖(6分%20歧)为绣球菌中主要的生理活性物质。
此外，OHNO等人(OHNO大野尚仁,Naohito宿前利郎,MIURA中岛三%20博,等.Antitumor%201,3-β-Glucan%20from%20Cultured%20Fruit%20Body%20of%20Sparassis%20crispa[J].Biological&Pharmaceutical%20Bulletin,2000,23(7):861-872.)通过建立白细胞减%20少症小鼠的实验模型，报道了绣球菌MH-3(保藏编号FERM%20P-17221)的干%20燥粉末具有免疫功能增强作用。
因此，目前仍无法提供一种含有活性成份β-1,3-D-葡聚糖的饲料用于提升%20育肥猪的免疫力。
发明内容
为此，需要提供一种含有高浓度的β-1,3-D-葡聚糖的绣球菌粉末的猪饲%20料，以及投喂方法，以增强育肥猪的免疫力，减少疾病的发生。
为实现上述目的，本发明提供了一种猪饲料，包括绣球菌干燥粉末；所%20述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-D-葡聚糖，且所述绣球菌干%20燥粉末由绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM%20BP-17221)制备得%20到。
具体地，所述绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
(1)第一培养工序：将所述绣球菌MH-3接种到含有营养成分的琼脂培%20养基中进行培养，得到第一代培养菌株；
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在第一蘑菇栽培用瓶%20内，将所述第一代培养菌株接种至所述第一蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到%20第二代培养菌株，所述培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营%20养素；
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第一真菌床袋内，%20将所述第二代培养菌株接种至所述第一真菌床袋内进行培养，得到第三代培%20养菌株；
(4)第四培养工序：将所述绣球菌MH-3，所述第二代培养菌株的菌丝、%20子实体，以及所述第三代培养菌株的菌丝、子实体的混合体，接种到含有营%20养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株；
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在第二蘑菇栽培用瓶%20内，将所述第一代配合菌接种至所述第二蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第%20二代配合菌株；
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，%20将所述第二代配合菌株接种至所述第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配%20合菌株；
(7)干燥工序：将所述第三代配合菌株进行干燥处理，得到所述绣球菌%20干燥粉末。
进一步地，还包括锯木屑。
进一步地，所述锯木屑为红松片。
一种猪饲料投喂以增强免疫力的方法，包括如下步骤，对初次育肥猪每%20头给饲400-600mg绣球菌干燥粉末，每天给饲2次；对二次育肥猪每头给饲%201000-1500mg绣球菌干燥粉末，每天给饲2次；所述绣球菌干燥粉末含有大于%20等于60重量％的β-1,3-D-葡聚糖，且所述绣球菌干燥粉末由绣球菌MH-3(国%20际特许微生物保藏编号FERM%20BP-17221)制备得到。
具体地，对初次育肥猪给饲500mg绣球菌干燥粉末，每天给饲2次，持%20续15天；对二次育肥猪每头给饲1000mg绣球菌干燥粉末，每天给饲2次，%20持续15天。
具体地，对育肥猪给饲的单次标准为每60kg体重投喂1g绣球菌干燥粉%20末。
区别于现有技术，上述技术方案提供的猪饲料绣球菌干燥粉末；绣球菌%20干燥粉末由绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM%20BP-17221)制备%20得到，且绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-D-葡聚糖。实验显示%20上述饲料能够有效提升猪血液中的白细胞含量，从而能够更好地提升猪的免%20疫力。
本文用词释义如下：
绣球菌，它是一种白色的花形蘑菇，夏天在山上的松树桩上生长。天然%20产品是罕见的蘑菇，在韩国或中国台湾很少发现，并且不能自然生长。它已%20在中国部分地区发现，但由于未注册为草药而广为人知。
β-葡聚糖，自然界中的食物中存在作为自然物质(多糖)的β(1,4)β(1,6)β(1，%203)葡聚糖。β-(1,4)表示纤维素(纸)，而β(1,6)没有作用，因为其作用未知。%20β(1,3)葡聚糖在临床上广泛用作免疫增强抗癌药。通常，β(1,3)葡聚糖称为%20β-葡聚糖。蘑菇中存在多种β-葡聚糖，但由于其含量很少，因此对其功能的测%20试很少。
常规上，由于其分子量大且不被消化道吸收而被用作注射剂，但由Mina%20HealthCo.Ltd。和东京药科大学共同研究证实，口服给药的机理和作用已被确%20认并发表在《自然》杂志上。
白细胞：细菌感染及炎症等情况下会增加的嗜中性粒细胞、病毒感染及%20淋巴瘤等情况下会增加的淋巴细胞、过敏及寄生虫等情况下会增加的嗜酸性%20粒细胞、白血病等情况下会增加的嗜碱性粒细胞、感染恢复期会增加的单核%20细胞共五个种类。我们认为白血球其5个种类的平衡及活泼性能够体现免疫%20增强作用，因此可以通过测量白细胞的比例(测量五种细胞)来了解免疫状%20态。
免疫增强饲料：为防止育肥猪感染而生产的饲料。可以使用在绣球菌制%20造过程中产生的红松碎片。包含功能成分β-葡聚糖并增强白细胞，从而增强%20猪的免疫功能的饲料。
松片：用于培养绣球菌的落叶松片(细碎的松木)。β-葡聚糖(绣球菌的%20功能成分)的生产能力是落叶松的1.4倍。但是，由于它具有很强的杀菌作用，%20并且由于松树树脂而难以腐蚀和发酵，因此即使返回土地也不能很好地使用。
初次育肥猪：体重约30KG±5kg的猪只。
二次育肥猪：体重约60KG±10kg的猪只。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下%20结合具体实施例详予说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，%20给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述%20的实施例。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途%20径获得。
本发明实施例中，使用的微生物——绣球菌MH-3菌株是属于绣球菌属%20的菌种，其已于1999年2月17日在日本通商产业省工业技术院生命工学工%20业技术研究所NIBH(现名称为独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生%20物保藏中心(NITE-IPOD))保藏，保藏登记号为FERM%20P-17221，并于2019%20年12月5日根据布达佩斯条约移送国际保藏，被赋予国际特许微生物保藏编%20号FERM%20BP-17221。当然，本发明提供的绣球菌的培养方法也可以应用于其%20它种类的绣球菌种的培养中，并不局限于绣球菌MH-3菌株。
一种猪饲料，包括绣球菌干燥粉末；所述绣球菌干燥粉末含有大于等于%2060重量％的β-1,3-D-葡聚糖，且所述绣球菌干燥粉末由绣球菌MH-3(国际特%20许微生物保藏编号FERMBP-17221)制备得到。
具体地，所述绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
(1)第一培养工序：将所述绣球菌MH-3接种到含有营养成分的琼脂培%20养基中进行培养，得到第一代培养菌株；
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在第一蘑菇栽培用瓶%20内，将所述第一代培养菌株接种至所述第一蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到%20第二代培养菌株，所述培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营%20养素；
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第一真菌床袋内，%20将所述第二代培养菌株接种至所述第一真菌床袋内进行培养，得到第三代培%20养菌株；
(4)第四培养工序：将所述绣球菌MH-3，所述第二代培养菌株的菌丝、%20子实体，以及所述第三代培养菌株的菌丝、子实体的混合体，接种到含有营%20养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株；
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在第二蘑菇栽培用瓶%20内，将所述第一代配合菌接种至所述第二蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第%20二代配合菌株；
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，%20将所述第二代配合菌株接种至所述第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配%20合菌株；
(7)干燥工序：将所述第三代配合菌株进行干燥处理，得到所述绣球菌%20干燥粉末。
在进行育肥时，我们进行如下实验，取40头初次育肥猪(平均体重30KG)%20进入养猪场时设置20头的对照组，其余20头每头饲喂含有β-葡聚糖500mg%20的以红松屑为主体的免疫强化饲料，每日2次连续15日由育肥猪自主经口取%20食。观察育肥猪的免疫增强作用。免疫增强作用的指标为免疫强化饲料投食%20前后从猪身抽取的血液的5个种类的白血球。
其次，还将二次育肥猪(平均体重60KG)每头饲喂含有β-葡聚糖1000mg%20的以红松屑为主体的免疫强化饲料，每日2次连续15日由育肥猪自主经口取%20食。通过上述同样方法测定白血球。
所述白血球包括细菌感染及炎症等情况下会增加的嗜中性粒细胞、病毒%20感染及淋巴瘤等情况下会增加的淋巴细胞、过敏及寄生虫等情况下会增加的%20嗜酸性粒细胞、白血病等情况下会增加的嗜碱性粒细胞、感染恢复期会增加%20的单核细胞共五个种类。此前的试验并未对白血球的具体分类进行比较实验，%20我们认为白血球其5个种类的平衡及活泼性能够体现免疫增强作用，因此白%20血球的分类测定显得很有必要。
若淋巴细胞和单核细胞增加则说明猪通过免疫强化饲料增强了猪的免疫%20功能。小鼠实验也证明了绣球菌的β-葡聚糖对5个种类的白细胞的平衡优化有%20积极作用。着眼于增强包括肺炎及流感的免疫增强作用的免疫强化饲料被猪%20自主经口取食后，通过实验证实了该免疫强化饲料增强了猪的免疫力，对疾%20病的抵抗力增强有助于养猪过程中降低育肥猪的死亡率。
用于饲喂的免疫增强物质及饲喂方法：
我们提供由绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM%20BP-17221)%20生产的绣球菌茶色干燥粉末，总β-葡聚糖含量达61.9g/100g；且所有的β-葡%20聚糖均为β-1,3-葡聚糖。实验猪从4栏每栏20头猪中每栏选取10头猪(去势%20雄性)，之中10×2头为对照组，另外10×2头为实验组。实验组饲料每头每%20次给饲1.5kg，每日给饲2次供自由取食。饲料中添加每头500mg的绣球菌干%20燥粉末。对照组则投食等量的传统饲料。各栏由于摄食时间及摄食量无法平%20均，实验采用的是各栏20头中任意选择10只进行测验。二次育肥猪则每头%20投喂1500mg的绣球菌干燥粉末。
绣球菌MH-3是特许微生物中心保藏的(国际特许微生物保藏编号FERM%20BP-17221)来生产的。生产方法为，在天界了各种成分的天然红松的大木屑%20上接种MH-3菌株，六个月后收获、温暖通风环境下干燥后粉末化制得。主%20要成分为β-1,3-葡聚糖，具有提高免疫力的作用。并获得了日本专利(JP特许%204183326号)。
此外，β-1,3-葡聚糖是一种安全的物质，几乎不从消化道或粘膜吸收，并%20且在与粘膜接触时会与受体(dectin-1)反应产生免疫物质(细胞因子)。在该测%20试中使用的是生产的绣球菌MH-3干粉(β-葡聚糖，61.9g/100g)。以每头%201g%20x%2015天的剂量给药，其浓度为对小鼠口服给药数据的十倍(体重30g，给%20药60μg)(β-葡聚糖60mg→600mg)。
猪的疾病和用于治疗和预防的药物的功效
传统上，已经对预防和治疗有效的传染病(肺炎)施用了各种抗生素。但%20是，到目前为止，还没有对病毒具有预防作用的材料，并且预防方法一直是%20一个问题。
关于免疫增强剂和佐剂的研究数据不足，也没有口服作用和安全性以及%20给药剂量和给药天数的研究结果。
绣球菌MH-3作为猪免疫增强饲料的潜力
本实验中猪场的状况，如育肥猪自主经口摄食会残留剩余食物、争吵以%20及先后顺序(考虑到同一栏中存在亲子关系的猪的等级制度将会影响进食顺%20序)。考虑到只有8个饲喂箱的情况下，可能没有对所有猪施用MH-3，并且%20考虑到在饲料中分散填料导致的减量问题，每头猪投放1g%20x%2015天，即浓度为%20小鼠口服给药数据的10倍(对体重30g的小鼠以60μg作为β-葡聚糖的形%20式给药)(在体重30kg的猪中为60mg→600mg作为β-葡聚糖的浓度)。计划在未来饲料中添加的含菌丝体的松木屑(松树粉)的浓度约为0.01。
本方案测试期为育肥猪迁居后的14天。从2009年4月3日至17日的14%20天内，对平均体重60公斤的初次育肥猪进行了二次育肥猪试验。对于40只%20初级育肥猪，在抵达时将20个作为对照组放在养猪场，其余20只初级育肥%20猪连续15天每天两次投食500mg“绣球菌干粉”。自由经口摄食后，观察对%20肥育猪的免疫增强作用。免疫增强作用指标是通过测量“绣球菌干粉”给药%20前后从猪中采集的血液中的白细胞来测定的。结果显示对初次育肥猪口服“绣%20球菌干粉”可增强猪的全身免疫功能，可安全地用于预防传染病。此后，允%20许二次育肥猪每天每头连续两次自由摄取1000毫克“绣球菌干粉”，并进行%20观察。
猪的白血球的数据如下表所示，
单位：×100/μL
表中的试验编号1-20为对照组猪只，21-40为实验组猪只，⊿均表示与 D1的差值。D1：2月19日；D2：3月4日；D3：4月3日；D4：4月17日。 可见D1-D2为初次育肥猪，D3-D4为二次育肥猪。从表中可以看到通过上述 育肥方法能够有效增强肥猪的免疫力。
绣球菌提取物被用作营养成分添加到日本红松中。除了常规方法之外， 还调节温度和湿度。作为栽培方法，我们设计了一种无需使用用于“香菇” 栽培的蒸汽且不直接接触空气的生产方法，并成功地大规模生产(是传统方 法的5倍)大型绣球菌。
与使用Mina Health Co.，Ltd.开发的赤松的盆栽栽培方法含有43.6g/100g 相比，作为功能成分的β-葡聚糖的活性成分含量为61.9g/100g，是43.6g/ 100g含量的1.42倍。然而，在收获大型绣球菌过程中会产生大量的红松真菌 床。到目前为止，真菌床已经还原回农田并用作肥料，而采用赤松的方法无 法返回农田作为肥料，只能将其焚烧并销毁，而不能在土壤中分解。可见我 们的方案从CO2排放的角度进行优化的再利用的方法。
绣球菌的真菌床的特征在于含有高浓度的β-葡聚糖(0.7g/100g)，这在 其他真菌床中没有观察到。通常，到目前为止，只需从一张真菌床上接种一 次即可收获数次人工生产的“蘑菇”(香菇为5次)。我们的绣球菌只能从带 有一个接种物的一个真菌床中收获一次。因此，需要的红松床数量是“香菇” 的5倍。因此，我们的绣球菌的一个特征，与其他香菇不同，即使在收获之 后，菌床也存在大量的绣球菌菌丝体，并且含水量很大，但可以在抑制霉菌 生成的同时在室温下保存数月，如果干燥则可以长期保存。
本发明实施例中，绣球菌的培养方法，包括以下步骤：
(1)第一培养工序：将绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代培养 菌株。
在第一培养工序中，添加至琼脂培养基中的营养成分可以为蛋白胨、爱 表斯锭(EBIOS，啤酒酵母片)、香蕉粉、蜂蜜粉、小麦粉、氯化钙、琼脂粉、 针叶树热水提取液等中的一种或多种。另外，还可以在琼脂培养基中添加小 麦、麸皮、大麦和玉米麸皮等菌丝体活性营养素。
其中，针叶树热水提取液的实例包括：通过用40℃至80℃的热水对诸 如落叶松和赤松之类的针叶树叶的碎片进行热水提取而获得的提取液。琼脂 培养基优选斜面培养基，以增加菌丝体的培养基面积。此外，琼脂培养基的 pH值的取值范围优选为6.0至7.0的范围。优选的，琼脂培养基在试管中以 倾斜的方式放置、灭菌、形成斜面固体培养基后，再接种绣球菌MH-3并培 养。
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内， 将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代培养菌株， 培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素。
在第二培养工序中，针叶树细粒状碎屑包括，例如，通过将针叶树(例 如，落叶松、赤松)的原木粉碎而获得的碎屑，并且优选的具有约0.1mm至 10mm的颗粒度。菌丝体活性营养素包括，例如，小麦、麸皮、大麦和玉米麸 皮等。优选的，菌丝体活性营养素的含量为整个培养基材的20重量％以下。
蘑菇栽培用瓶的具体结构不作限制，可以使用市面上销售的可容纳 400g～500g培养基材的耐热塑料瓶。在蘑菇栽培用瓶中，将针叶树细粒状碎 屑(150g～450g)、水和菌丝体活性营养素装填形成培养基材，加热灭菌后， 使用接种器将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养。
培养条件可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例如温度18～25℃、 湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为210,000ppm以上，并且培 养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外，可以适当地设定培养时 间，以菌丝体的产生为指标，例如，培养时间可以为60至90天。
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在真菌床袋内，将 第二代培养菌株接种至真菌床袋内进行培养，得到第三代培养菌株。
在第三培养工序中，培养基材可以使用和第二培养工序中相同的针叶树 细粒状碎屑和菌丝体活性营养素。真菌床袋的材料和形态没有特别限定，例 如可以使用市面上销售的可容纳2000g～3000g培养基材的真菌床袋。将针叶 树细粒状碎屑(例如1000～2000g)、水和菌丝体活性营养素装填到真菌床袋 中，作为培养基材料；加热灭菌后，使用接种器将第二代培养菌株接种至真 菌床袋中进行培养。
培养条件不作特别限定，可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例 如温度18～25℃、湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为 210,000ppm以上，并且培养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外， 可以适当地设定培养时间，以菌丝体和子实体原基的产生为指标，例如，可 以设定约60至130天的时间。
(4)第四培养工序：将绣球菌MH-3，第二代培养菌株的菌丝和/或子实 体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体的混合体，接种到含有营养成分 的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株。
在第四培养工序中，琼脂培养基的营养成分可以采用第一培养工序中的 相同，优选的，琼脂培养基是斜面琼脂培养基。在由绣球菌MH-3，第二代培 养菌株的菌丝和/或子实体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体组成的混 合体中，可以使用通过将子实体的内表面和外表面切割成2mm至10mm的正 方形并分解组织而获得的子实体。培养条件不作特别限制，培养温度可以设 为18～25℃，培养天数可设为约45至90天。
相比于绣球菌MH-3，上述各菌株的混合体中包含着更强大的突变菌株、 进化菌株和优良菌株。通过使用这样的混合体，可以稳定地获得包含高浓度 (60重量％以上)、高纯度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌。
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内， 将第一代配合菌接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株。
在第五培养工序中，关于构成培养基材的针叶树细粒状碎屑和菌丝体活 性营养素，可以使用与第二培养工序同样的方法制备。另外，蘑菇栽培用瓶 也可以使用与第二培养工序相同类型的培用瓶。此外，可以采用与第二培养 工序相同的方式设定培养条件和培养时间。
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内， 将第二代配合菌株接种至第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株。
在第六培养工序中，针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素，可以使用 与第三培养工序同样的方法制备。另外，真菌床袋也可以使用与第三培养工 序相同类型的真菌床袋。此外，可以采用与第三培养工序相同的方式设定培 养条件和培养时间。
本发明实施例中，绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
干燥工序：将上述培养方法培养得到的第三代配合菌株干燥，得到绣球 菌干燥粉末。
优选的，在干燥工序中，用于干燥的第三代配合菌株为第三代配合菌株 的子实体。干燥方法和条件可以适当设定，例如可以用在65℃～80℃的温度 下干燥的方法，或者用冷冻干燥的方法。通过这样的方法将干燥的绣球菌粉 碎成期望的尺寸，即可获得绣球菌干燥粉末。
本发明实施例制备的绣球菌干燥粉末含有60重量％以上的β-1,3-D-葡聚 糖(6分歧)。
本发明实施例中，可以通过溶剂萃取的方法从绣球菌干燥粉末中提取得 到含有β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌提取物。
在对绣球菌干燥粉末进行提取时，所用的溶剂可以使用水性溶剂或非水 性溶剂，优选的，使用水性溶剂。水性溶剂包括水或者通过向水中添加碱或 其他碱性物质而获得的碱性水、通过添加与醇相容的有机溶剂而获得的水性 溶剂、含有酸或酸性物质的酸性水等。另外，非水性溶剂的实例包括极性有 机溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。
当用水对绣球菌干燥粉末进行提取时，优选使用热水提取。这种情况下 的热水温度优选控制在80～125℃的范围内。
本发明的生理机能活性剂包括由绣球菌干燥粉末提取得到的绣球菌提取 物作为第一活性成分，所述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-D- 葡聚糖(6分歧)。
β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)已知具有癌症预防、治疗、糖尿病、高血压治 疗、抗癌(肿瘤)作用、降血糖作用、免疫刺激作用、抗高血压作用等生理 机能活性。
因此，本发明实施例的猪饲料可以直接使用其活性成分——绣球菌提取 物，也可以通过添加绣球菌粉末来制备。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂、填充 剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶解剂、溶解辅助剂、着色剂、除味除臭剂、 安定化剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化 剂、吸附载体等，可以根据常法进行适当地使用。
接着，通过具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限定于 以下的实施方式。
实施例1绣球菌干燥粉末的制备
(1)第一培养工序(试管培养)
主要器具采用了试管和斜面琼脂培养基(以下记载为“K-2”)。
具体来说，K-2的组成是纯净水1L，蛋白胨1.2g，爱表斯锭(EBIOS， 啤酒酵母片，购自日本朝日集团食品株式会社)3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂 15g，针叶树热水提取液(10mL)，菌丝体活性营养素(KN-1)3.0g，斜面培 养基的pH值为6.0～7.0。
将上述K-2保存在试管里。另外，K-2的灭菌条件设为110～115℃，压 力2气压；灭菌30分钟后，放置冷却。在该K-2里接种并培养绣球菌MH-3 (国际特许微生物保藏编号FERMBP-17221)，得到了第一代试管培养菌株 (以下记载为N-1)。
(2)第二培养工序(瓶装培养)
准备培养基的瓶容器和培养基材。瓶容器采用能容纳400g～500g培养基 材的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶(市面上销售的即可)。
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为150g～450g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-2)20％ 以下构成(总装填重量为400g～500g)。
该菌株培养基经过灭菌温度120～121℃、压力2气压3小时处理后，置 于18℃以下的环境12小时进行冷却。此后，在洁净室内使用接种器在菌株培 养基上接种N-1。培养室的温度保持在18～25℃、湿度55％～75％之间。另 外，培养室内的氧气浓度注意维持在210,000ppm以下，室内的二氧化碳浓度 不超过1,000ppm。在培养室培养N-1，经过培养期间60日～90日，即可产生 菌丝体。在下文中，第二培养工序得到的第二代培养菌株记为“MH-819”。
(3)第三培养工序(菌床培养)
为了培育绣球菌的菌体，准备了可以容纳2000g～3000g培养基材的菌床 袋。
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为1000g～2000g)，水65％，菌丝体活性营养素(KN-3)20％以 下组成(总装填重量2000g～3000g)。该菌床培养基先经过温度120～121℃、 压力2气压的灭菌处理3小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。
此后，在洁净室内使用接种器，将MH-819接种到菌床培养基。培养室 维持在温度18～25℃，湿度55％～75％中。另外，培养室内的氧气浓度注意 维持在210,000ppm以下，室内的二氧化氧浓度不超过1,000ppm。在培养室培 养MH-819，经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝体，菌丝体产生后 10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第三培养工序得到的第三代培 养菌株记为“MH-835”。
(4)第四培养工序(试管培养)
准备斜面琼脂培养基K-2(试管)。斜面琼脂培养基由纯净水1L，蛋白胨 1.2g，爱表斯锭3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂15g，针叶树热水提取液(10mL)， 菌丝体活性营养素(KN-1)3.0g。同时，试管的斜面琼脂培养基的pH值为 6.0～7.0。斜面琼脂培养基的灭菌环境设为110～115℃，压力2气压；灭菌 30分钟后，放置冷却。
将在第一培养工序中使用的绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号 FERM BP-17221)、MH-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及MH-835的 菌丝体和子实体(组织分解)的混合体，在清洁室内，使用接种器接种至斜 面琼脂培养基K-2(试管)中进行培养，得到第一代配合菌株。培养温度控制 在18℃～25℃之间。经过培养天数45日～90日，即可产生菌丝体。在下文 中，第四培养工序得到的第一代配合菌株记为“MH-78”。
(5)第五培养工序(瓶装培养)
准备培养基的瓶容器和培养基材。培养基的瓶容器使用蘑菇栽培用的耐 热塑料瓶。
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎屑 (装填重量为420g～480g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-4)20％ 以下组成。该菌株培养基经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3小 时后，置于18℃以下的环境12小时进行冷却。培养室温度保持在18～25℃、 湿度55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在210,000ppm以 下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
在清洁室里使用接种器，将MH-78接种到菌株培养基中进行培养，得到 第二代配合菌株。经过培养期间60日～90日，即产生菌丝。在下文中，第五 培养工序得到的第二代配合菌株记为“MH-78A”。
(6)第六培养工序(菌床培养)
准备用于培育绣球菌菌体的菌床袋。
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片 (装填重量为2.4kg～2.8kg)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-5)20％ 以下组成。该菌床培养基先经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3 小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。培养室温度保持在18～ 25℃、湿度55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在 210,000ppm以下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
此后，在洁净室内使用接种器，将MH-78A接种到菌床培养基中进行 培养，得到第三代配合菌株。经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝 体，菌丝体产生后10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第六培养 工序得到的第三代配合菌株记为“MH-78B”。
(7)粉末化工序
把MH-78B置于65℃～80℃环境中12小时～18小时使之干燥，通过100 目筛或200目筛，得到绣球菌干燥粉末，记载为MH-3-A。
实施例2绣球菌干燥粉末的成分分析
以实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)作为待测样品A、B， 在财团法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表1所示。
表1绣球菌干燥粉末(MH-3-A)的成分分析表
如表1所示，在实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)A和B中， 每100g包含60g以上(60重量％以上)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
实施例3绣球菌干燥粉末(MH-3-A)的溶媒提取
对绣球菌干燥粉末(MH-3-A)进行提取，并测定了糖蛋白比的成分量。
采用下述方法从绣球菌干燥粉末中提取绣球菌提取物，并测定其成分量。
1、“热水提取1倍”法：从绣球菌子实体，用温风干燥制得的，过100 目筛得到的干燥粉末50g。在50g干燥粉末中加入700mL EtOH(乙醇)，放 置2天进行脱脂处理，得到提取物和残渣组分(或沉淀组分)。然后，在残渣组 分中加入500mL热水(121℃)，自动高压灭菌处理2小时，得到提取物①和 残渣组分②。接着，将提取物①和残渣组分②分开。在提取物①中加入4L乙 醇，在4℃下，进行5分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入 400mL50％乙醇(200mL水+200mL乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟， 再加入丙酮，放置1天得到了热水提取物③。
2、“热水提取4倍”法：在提取物①中加入4L乙醇，在4℃下，进行5 分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入400mL 50％乙醇(200mL 水+200mL乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟，在得到的上清液中加入 800mL乙醇，并进行5分钟的3000rpm搅拌处理，接着加入丙酮放置1天， 得到热水提取物4倍。
3、“冷碱提取(1)”法：在残渣组分②加入500mL的10％NaOH/5％尿素, 在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取物(1) —④。
4、“冷碱提取(2)”法，在④的残渣组分加入500mL的10％NaOH/5％尿 素，在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取 物(2)—⑤。
5、“热碱提取”法：在⑤的残渣组分加入500mL的10％NaOH/5％尿素， 在65℃中处理1小时，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到热碱提取物 —⑥。
各组提取物成份量的测定：
采用把葡萄糖作为标准物质的苯酚-硫酸法测定糖含量，并采用把牛血清 白蛋白(BSA)作为标准物质的BCA法测定蛋白含量。同时，关于糖组成， 用2N-三氯乙酸完全加水分解、还原、乙酰化后，采用气相色谱法分析。测定 结果如表2所示。
表2各组提取物成份量的测定结果表
绣球菌干燥粉末(50g)，过100目筛
用糖蛋白比分析可知，采用实施例1制备得到的绣球菌干燥粉末是含糖 量为90％的高纯度多糖体。其中，“热水提取4倍”法得到的提取物的纯度尤 其的高，而在“冷碱提取(1)”法得到的提取物中β-1,3-D-葡聚糖(6分歧) 的含量高达8.97g/50g绣球菌干燥粉末。然而，OHNO等人(OHNO大野尚仁, Naohito宿前利郎,MIURA中岛三博,等.Antitumor 1,3-β-Glucan from Cultured Fruit Body of Sparassis crispa[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2000, 23(7):861-872.)对绣球菌干燥粉末进行提取，其得到的提取物中糖含量仅为 64～70％，蛋白含量仅为0.8～3.0％，β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)含量仅为0～ 3.68g/25g绣球菌干燥粉末，远低于本实施例制备得到的绣球菌提取物的糖含量。
对比例绣球菌干燥粉末的制备和成分分析
1、绣球菌干燥粉末的制备
本对比例中采用的微生物为从山上采集而来的天然绣球菌(以下记载为 “MH-1”)，通过下述两阶段的方法培养得到绣球菌的子实体。
(1)第1阶段，进行了MH-1的接种和培养。主要器具采用了试管和斜 面琼脂培养基。
试管内使用的琼脂培养基，由纯净水1L，蛋白胨1.2g，EBIOS 3.6g，氯 化钙0.6g，HYPONEX 0.6mL，香蕉粉末48g，蜂蜜粉末18g，琼脂粉末20g 调制而成，pH值6.0～7.0。同时，琼脂培养基的灭菌条件为：在110～115℃、 压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。在下文中，这种琼脂培养基记载为 “K-1”。
在上述方法制作的斜面琼脂培养基K-1中接种MH-1，开始菌株的培养。 MH-1在琼脂培养基中培育成长，在20℃中经过45日～90日的培养，若能产 生菌丝体，则可确认绣球菌(MH-1)完成培养。此后每65日～120日反复进 行MH-1接种。在下文中，这种试管培养菌株记载为“M-1”。
(2)第2阶段，准备制作绣球菌子实体培养基的瓶容器和培养基材。
主要器具使用市场上销售的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶。其次，为了实现 绣球菌子实体的生产，培养基材使用了锯末。
耐热塑料瓶内装填的培养基材，由落叶松锯末1kg、纯净水500mL、蛋 白胨1.0g、EBIOS 45g、氯化钙0.6g、香蕉粉末6g、蜂蜜粉末2g、小麦粉100g、 氯化镁0.5g制作而成。在下文中，这种瓶装培养基记载为“锯末培养基1”。 该锯末培养基1的pH值调制为6.0～7.0，锯末培养基1的灭菌条件为：在120～ 121℃、压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。
接着，在放冷后的锯末培养基1上接种M-1。在下文中，在锯末培养基1 上接种了M-1的培养基记载为“锯末培养基2”。
锯末培养基2的培养条件维持在温度18～25℃、湿度55％～75％，开始 培养绣球菌丝、子实体。M-1经过60日～90日的培养，促进菌丝成长，从而 绣球菌的子实体的原基逐渐产生。此后，通过在温度18～25℃、湿度75％～ 85％下20日～50日的培养，原基培养后产生了绣球菌子实体。在下文中，将 该绣球菌子实体记载为“M-2”。
接着，将获得的M-2，通过80℃～100℃、12小时～18小时用温风进行 干燥，得到绣球菌干燥体，过100目筛使之粉末化，获得绣球菌干燥粉末。 在下文中，将这种绣球菌干燥粉末记载为“M-3”。
2、绣球菌干燥粉末M-3的成分分析
绣球菌干燥粉末M-3的成分分析
以上述方法制备得到的绣球菌干燥粉末(M-3)作为待测样品C，在财团 法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表3所示。
表3绣球菌干燥粉末(M-3)的成分分析表
如表3所示，绣球菌干燥粉末(M-3)中含有43.6g/100g的β-1,3-D-葡聚 糖(6分歧)，蛋白质和糖分含量较少。与实施例1中制备得到的绣球菌干燥 粉末(MH-3-A)相比，绣球菌干燥粉末(M-3)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧) 的含量较少。
采用实施例1的绣球菌干燥粉末的制备方法，在第四培养工序中得到了 由绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)、该绣球菌MH-3 培育出的MH-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及MH-835的菌丝体和子 实体(组织分解)的混合体。该混合体中包含着更强大的变异株、进化株和 优良株菌种。虽然绣球菌的菌株对环境的适应性较弱，仅靠菌类的种族系的 保存和培养很难，但根据本发明的绣球菌干燥粉末的制备方法，可以稳定地 获得包含高浓度(60重量％以上)、高纯度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣 球菌干燥粉末。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非 因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所 述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等 效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均 包括在本发明的专利保护范围之内。
