新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株新型溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的组合物及其应用。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，革兰氏阴性短杆菌，无荚膜、芽孢，为嗜盐嗜温、兼性厌氧海生弧菌，单独存在或尾端相连成“C”或“S”形。溶藻弧菌广泛存在于世界各地海水，河口处及海洋动物中，其数量居海洋中弧菌之首。
溶藻弧菌是条件性致病菌，可通过鱼类受损的皮肤和口腔感染多种海水养殖鱼类、虾类和贝类，引起鱼类溃疡病、腹水症、虾红体病或出血病等消化道疾病的发生与流行。由于溶藻弧菌繁殖的适宜温度为17～35℃，极易在夏季导致大面积发病给养殖业带来巨大的经济损失。溶藻弧菌主要还引起人类食源性疾病，食用含有该菌的食品可能会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和发烧等典型胃肠炎反应，另外该菌还可引起中耳炎、外耳炎、败血症、表面伤口感染和溃疡、蜂窝组织炎、坏死性筋膜炎、结膜炎、骨髓炎、脑膜炎等疾病。
近年来，溶藻弧菌在渔业上造成的损失越来越大。由于中国四大海域中海洋细菌中弧菌的分离率高达52.9％，溶藻弧菌更是占到四大海域共有菌株的62％。此外，溶藻弧菌在生长过程中极易在食品、加工器具的表面形成生物被膜，被膜内的细菌对常规保鲜剂、抑菌剂的抗逆性增强，很难去除，从而导致持续性污染。目前，渔业生产上通常采用传统的大量抗生素或消毒剂进行溶藻弧菌的预防和治疗。但是文献资料显示，随着药物过度使用和滥用，反而加剧了溶藻弧菌耐药菌株的产生，还造成了水产品中有害药物的残留等食品安全问题。例如，上海近海海域中分得的溶藻弧菌对四环素的耐药性高达100.0％，对氨苄青霉素和羧苄青霉素的耐药性可达97.0％和93.9％，部分分离到的菌株具有严重的多重耐药性。由此可见，传统的抗生素或消毒剂并不适合溶藻弧菌的有效防治，且带来环境污染。
噬菌体(bacteriophage或Phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，只能寄生生活，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体。利用噬菌体制剂在治疗细菌性水产养殖疾病方面有诸多优势：首先，噬菌体对细菌耐药性适应性强，虽然细菌也会对噬菌体产生抗性，然而噬菌体有更快的变异和复制速度，能够适应宿主生物的变异；其次，噬菌体的专一性强，只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群；再次，噬菌体具有使用无残留、无毒害的优点，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内，而且噬菌体的降解终产物为氨基酸和核苷酸对人和动物无影响。
但是，目前还没有出现有效的溶藻弧菌噬菌体，能用于防治由于溶藻弧菌感染导致的各类疾病，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株新型溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32、其噬菌体组合物及其应用，该噬菌体及组合物使用安全，在解决因溶藻弧菌造成的感染的同时，避免了因过度使用抗生素造成的抗生素残留、以及诱发耐药性溶藻弧菌的问题。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供了一株溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32，该噬菌体自取自城阳海鲜批发市场的污水样品中分离得到，该溶藻弧菌噬菌体已于2019年11月04日被保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18860。
溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32在双层琼脂培养基上可形成直径0.5mm、透亮的噬菌斑，噬菌斑呈规则圆形，边缘清晰。电镜下观测到：该噬菌体的头部呈二十面体结构，具有一条短而非收缩性的尾部，头部直径约为54nm，尾部长约为15nm，符合短尾噬菌体科的特征，属于短尾噬菌体。
第二方面，本申请还提供了上述溶藻弧菌噬菌体在制备预防和治疗水产养殖中的因溶藻弧菌感染导致疾病的药物中的应用。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
优选的，上述溶藻弧菌感染的疾病包括海水养殖品的消化道疾病，如鱼类溃疡病、腹水症、虾红体病或出血病等。
第三方面，本发明还提供一种噬菌体组合物，包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32。这种噬菌体组合物可通过溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32与其他溶藻弧菌噬菌体进行复配，用于制备防治水产品溶藻弧菌病的产品。其他噬菌体可选用其他溶藻弧菌噬菌体或其他导致海产品的消化道疾病的病原菌噬菌体。
优选地，上述噬菌体组合物还包括噬菌体vB_ValP_PJ32的突变体中的一种或多种；所述突变体与对应的噬菌体的同源性不小于90％。
由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地进行同源性的测定，vB_ValP_PJ32的突变体与该噬菌体的天然序列同源性至少达到90％；更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，vB_ValP_PJ32的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。上述噬菌体的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
第四方面，本发明还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分主要为上述的溶藻弧菌噬菌体或上述噬菌体组合物。优选地，所述噬菌体药物制剂还包括其他特定病原菌的噬菌体。
可选地，上述噬菌体药物制剂的剂型为口服给药剂型、外用剂型，如溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、洗剂、软膏剂、贴剂或霜剂。
可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如，水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。
第五方面，本申请还提供一种对虾饲料添加剂，其包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物，通过与对虾饲料进行混拌后，进行饲喂，达到预防或治疗溶藻弧菌病的效果。优选地，饲料中每种噬菌体的效价至少为1×109PFU/g。
第六方面，本申请还提供一种环境消毒剂，其有效成分主要为所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的效价为1×109PFU/ml以上。环境消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。
上述环境消毒剂可用于水产养殖场所的日常消毒、空塘消毒、水产市场的环境消毒和净化，可用于代替因“禁抗”或对环境造成负担的抗生素或传统消毒产品，且所述噬菌体及其环境消毒剂的代谢产物不会对人体或其他动物造成损害。所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡对养殖环境、饲养器具等进行全面的溶藻弧菌消毒。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述溶藻弧菌噬菌体或其噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的溶藻弧菌、或用于防控由其宿主溶藻弧菌侵染导致的疾病。
第九方面，本发明还提供用于水产品生鲜食品消毒的生物抑菌剂，其有效成分主要为上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。生物抑菌剂的使用方法为：对生鲜产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中溶藻弧菌的增殖。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供一种溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32及其噬菌体制剂，该制剂可以杀灭具有抗生素多重耐药的致病性溶藻弧菌，其裂解率达到90.30％，具有广谱杀菌效果，可用于防治溶藻弧菌引发的水产疾病；无毒副作用，安全性高，不会导致出现大量具有耐药性的溶藻弧菌。此外，且所述噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液或者注射液，对环境中的溶藻弧菌进行有效杀灭。
2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。
3、所述噬菌体具有较强的酸碱耐受能力，该噬菌体在pH4～11环境中作用3h效价基本未发生变化，在pH＝3和pH＝12的环境下具有一定的耐受度，该噬菌体可应用于较为严苛酸碱环境下的溶藻弧菌的杀菌工作。
4、本发明的溶藻弧菌噬菌体及其噬菌体组合物可广泛用于水产养殖过程中的容易因溶藻弧菌感染造成损失的各个环节、水产市场和养殖环境的日常消毒等，有益于水产养殖业的健康发展。
附图说明
图1为噬菌体vB_ValP_PJ32的噬菌斑照片；
图2为噬菌体vB_ValP_PJ32的电镜照片；
图3为噬菌体vB_ValP_PJ32的热稳定性检测结果；
图4为噬菌体vB_ValP_PJ32的pH稳定性检测结果；
图5为噬菌体vB_ValP_PJ32的一步生长曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实验材料：
1、本发明试验涉及的溶藻弧菌标准株：ATCC17749购自上海复祥有限公司，ATCC33787购自上海士锋生物技术有限公司。
2、本发明所述的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32已于2019年11月04日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.18860，命名为vB_ValP_PJ32。
实施例1：噬菌体的分离、纯化和扩增
取山东省青岛市城阳海鲜批发市场的污水样品，加入溶藻弧菌对数期菌液J20，并加入适量2216E培养基，置于37℃、170rpm摇床培养16h。取出5ml液体，11000rpm/min离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过后，得到噬菌体原液，置于4℃保存。
利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液10倍比稀释，分别取100μl稀释液与200μl相应的溶藻弧菌菌液混合，37℃孵育5min，混合入上层琼脂(琼脂浓度为0.8％)，均匀的铺在下层2216E琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，冷却后于37℃温箱倒置培养过夜。次日，观察成斑情况，挑取单个噬菌斑，重复纯化3次，得到单一的噬菌体。
分别挑取单个噬菌斑置于1ml的PBS溶液中，37℃，170rpm浸出30min，得到噬菌体浸出液。取100μl噬菌体浸出液与100μl溶藻弧菌宿主菌对数期菌液于5ml液体2216E培养基中，37℃、170rpm摇床中振荡培养。至液体变清亮，11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm细菌滤器过滤，得到噬菌体增殖液。
上述溶藻弧菌噬菌体可形成直径0.5mm、透亮的噬菌斑，噬菌斑呈规则圆形，边缘清晰，其成斑图片见图1。所述溶藻弧菌噬菌体使用宿主菌增殖，3h即可摇清，效价可达8.76×109PFU/ml。
实施例2噬菌体的电镜观察
将上述分离的噬菌体悬液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的铜网上，以2％磷钨酸染色5～10min，干燥后利用日立HT7700型透射电子显微镜观察。
在透射电镜下观察到，其形态如图2所示，该噬菌体头部呈二十面体结构，有一条短而非收缩性的尾部，头部直径约为54nm，尾部长约为15nm；根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的噬菌体形态符合短尾噬菌体科的特征，属于短尾噬菌体，将其命名为vB_ValP_PJ32。
实施例3噬菌体的基因组分析
提取铜绿假单胞菌噬菌体vB_ValP_PJ32的基因组，并进行全基因组测序，得到：
噬菌体vB_ValP_PJ32的全基因组长度为：80293bp；其中，与噬菌体宿主识别相关的尾部(tail protein)蛋白基因序列见序列表中序列1，高度保守的末端酶大亚基(terminase large subunit)基因序列见序列表中序列2，DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列3。上述基因的具体信息见下表1。
使用BLAST在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对噬菌体基因组进行序列相似性比对分析。与其同源性最高的噬菌体为Vibrio phage Ares1，噬菌体vB_ValP_PJ32与该噬菌体的同源性仅达到76.22％。上述结果说明噬菌体vB_ValP_PJ32是一株新的溶藻弧菌噬菌体，与现有的近缘噬菌体的亲缘关系较远。
表1噬菌体vB_ValP_PJ32的基因序列信息表
实施例4噬菌体裂解谱的测定
挑取实验室保存的养殖场和海鲜市场分离到的132株溶藻弧菌，132株溶藻弧菌分离自海南、江苏和山东等省的各市地区的养殖场或海鲜市场，以及2株溶藻弧菌标准株(ATCC17749和ATCC33787)的单菌落，将其分别接种于5ml的2216E液体培养基中，摇床中培养得到对数期菌液。取100μl菌液和100μl噬菌体混合入上层琼脂，均匀的铺在下层琼脂上。待凝固、干燥后于37℃温箱培养8～12h，观察并记录成斑结果。同时使用药敏纸片法测定132株临床分离菌株的耐药情况以及PCR鉴定132株临床分离菌株的毒力基因。
实验发现：上述132株临床分离株中，耐药菌株为128株，耐药率为96.97％，带有毒力基因的菌株为127株，毒力基因带有率为96.21％。对于132株溶藻弧菌，溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32能裂解119株临床分离株以及2株溶藻弧菌标准株ATCC17749和ATCC33787，裂解率90.30％。
由于溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32的能裂解的119株临床分离菌株中，除了J05、J13和J40不具有耐药性，其他116株菌都分别具有不同类型的耐药性能，由此可见，本发明的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32能有效裂解具有各种不同耐药性的致病宿主菌。
表2溶藻弧菌噬菌体对临床菌株的裂解情况
注：+：裂解，噬菌斑透亮；-：不裂解。
实施例5噬菌体效价及MOI的测定
按照实施例1所述方法增殖噬菌体和宿主菌，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体vB_ValP_PJ32和其宿主菌进行适当的稀释。分别按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的比例各取100μl噬菌体和宿主菌加入到2216E液体培养基中。于37℃、170rpm振荡培养至液体变清，记录液体变清时间。经11000rpm离心5min后，取上清用双层平板法测定噬菌体的效价。
通过实施例1增殖的溶藻弧菌噬菌体效价可达8.76×109PFU/ml，溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32在MOI＝0.01，效价最高可达3.43×1010PFU/ml。
实施例6噬菌体热稳定性的测定
各取500μl噬菌体增殖液分装于无菌EP管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后立即将样品置于冰浴中冷却，通过10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体热稳定性曲线。
如图3所示，噬菌体vB_ValP_PJ32在40℃、50℃、60℃环境中作用1h后，活性基本保持不变；在70℃和80℃作用20min就已完全失活。结合噬菌体及其组合物的实际应用环境和生产工艺流程，说明本发明涉及的噬菌体的热稳定性较好。
实施例7噬菌体pH稳定性的测定
于无菌试管分别加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的PBS溶液4.5ml，然后将上述试管置于37℃的水浴锅中，待温度平衡后各加入500μl噬菌体增殖液混匀，于37℃水浴作用1h、2h和3h。分别在不同pH作用的1h、2h和3h使用双层平板法测定噬菌体效价，测定前用中和液将pH中和至pH＝7。将实施例结果以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制噬菌体pH值稳定性曲线。
图4为溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32的pH稳定性曲线。图4的实验结果显示：噬菌体在pH＝4～11环境中作用3h效价基本未发生变化，在pH＝3和pH＝12的环境下效价下降3个滴度。综合实际应用环境，溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32有较强的耐酸碱能力，尤其是耐酸能力突出。
实施例8噬菌体一步生长曲线的测定
按照MOI＝0.01添加溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32增殖液和其宿主菌对数期菌液各1ml，充分混匀并开始计时，37℃温育5min，13000g离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用1ml2216E液体培养基洗涤1次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的2216E液体培养基混悬沉淀(总体积为5ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μl，10000rpm离心1min，吸取100μl的上清用生理盐水10倍倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体效价，做3个重复，结果取平均值。以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体的潜伏期、爆发期。
如图5的溶藻弧菌噬菌体vB_ValP_PJ32的一步生长曲线所示，噬菌体感染宿主菌后，30min内效价基本稳定，表明噬菌体潜伏期约为30min；噬菌体侵染宿主菌后的30-100min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的爆发期约为70min；在随后的30min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。
实施例9噬菌体制剂对感染溶藻弧菌的南美白对虾的预防保护试验实验方法：将体重5g左右健康的南美白对虾进行空腹过夜。设置3组(分别为空白对照组、试验组和对照组)，每组50只虾。其中，空白对照组不做处理；试验组按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂，噬菌体的含量为1×108PFU/ml；对照组按照同样剂量(5％的添加量)用2216E培养基浸泡饲料后对虾进行饲喂。
连续饲喂3d后，给所有对虾注射溶藻弧菌，剂量为5.3×107CFU/只。记录各组5d内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。
实现结果：攻毒对照组死亡率为56％，试验组死亡率为12％，噬菌体对南美白对虾的预防保护率可以达到88％。本实施例的结果说明，饲喂噬菌体vB_ValP_PJ32可有效预防溶藻弧菌对南美白对虾的感染。
实施例10噬菌体制剂对感染溶藻弧菌的南美白对虾的治疗保护试验
实验方法：体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。设置3组，每组50只虾，空白对照组不做处理，给所有对虾的第二与第三腹节间侧面肌肉约0.5～1mm深处进行肌肉注射溶藻弧菌，剂量为5.3×107CFU/只。攻毒1h后，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，阴干后以对虾体重3％的剂量饲喂。对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。记录各组5d内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。
实验结果：攻毒对照组的死亡率为54％，试验组的死亡率为18％，噬菌体对南美白对虾的治疗保护率可以达到82％。饲喂噬菌体vB_ValP_PJ32可以有效治疗感染溶藻弧菌的南美白对虾。
实施例11噬菌体制剂水体消毒试验
实验方法：每组的桶中加入3L无菌海水，每桶放入5尾南美白对虾，28℃水浴，小气泵通氧。向体系中加入一定体积的溶藻弧菌，调整终浓度至1×106CFU/ml；处理1h后，分别向每桶的海水中分别加入噬菌体vB_ValP_PJ32，使其终感染复数分别为1:1和0.1:1，每组设置平行，攻毒组加入等体积2216E培养基，详细分组情况见表3。分别于1h、7h、10h、25h后用涂布平板法检测水体中溶藻弧菌的数量。
表3水体消毒实验分组
表4水体消毒试验溶藻弧菌残留量CFU/ml
如图4的实验结果可得：作用7h以后噬菌体在养殖水体中能够显著降低溶藻弧菌的活菌数量，最多可降低4个数量级。本实施例的结果说明，噬菌体vB_ValP_PJ32可以作为水体消毒剂(或改良剂)有效杀灭溶藻弧菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司
<120> 新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 468
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_ValP_PJ32的尾部蛋白(tail-completion protein of vB_ValP_PJ32)
<400> 1
atgaacgtta aagatcgtaa ctttgattta gtagacgcac tagacgacat aaagaaacgc 60
gttaatgagt tagtagatga taacgccgta gtagtctaca accaaaacga cctagaaaaa 120
gcgcctagcg ttgattcacg actacaggat cctgatcagg gctttgtatc gatcatgtac 180
gcgggtatgc gaagcgagtc cggcaaggga accgcggcta atggtgttag cacgatcggc 240
cgctttgcta ttgccgtttc gtttaaaaat gacggtctac gtatggccgg gattgaagac 300
cctgtaagta tggttcgttt tatgagtgag ttacgccgcg cattagtagc acaaaaagcg 360
ccaaacaata aaacctatac ttttgtaagc gaaacccctt gggagattcc cgggaagggt 420
gacggttata tgcaagaatg gaacttgtca ctaagtgcct tttcttga 468
<210> 2
<211> 1998
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_ValP_PJ32的末端酶大亚基(terminase large subunit of vB_ValP_PJ32)
<400> 2
atgacgagta aagcagagaa accgaaaaag aaagagacgg caaaggatcg ccgtcttaaa 60
gcggcacgcc gtagaaaaga ggttatacca ccgatagacc caaacaaagg caagcccgct 120
aaggacctag acaagctaga aaagatatta gaggaagaac taggggcctt ccctgaaaag 180
caacgcgcgc cgctagtgca ttacatgaaa cagtatctag ccggggaagt taaactagat 240
atttcggact accacacaat cccggtagac ccgagaacct tcttattaga cgacttttat 300
ttaggtctaa aagatgatgt ctacccggct ctaatagatg agttttgcga aatgaacagc 360
gggaagtata tcgagatcgt tttaacgggc ggtatcggta caggtaagac gacgctagcc 420
gtttggaata ccgcttatca actttatcta ttatcgtgcc ttaaagaccc gcacaagcta 480
tttaagctag ataagagctc agagatatta atagttttcc agagtataac ggcggaccta 540
gcacgtaagc ttaactataa ccgatttaag gcacttatcg atcaatcacc gtattttcaa 600
acgcgtttcc cttatgaccg cagggtcgaa accgaactta aataccctaa ccggatctat 660
atccgcccgg tatccggtga agataccgcg gctatcggtc agaacgtgat cggcggcatc 720
atagacgaaa ttaactatat ggccgtaacc gaaaactcta aaaaagagga aggcggcggg 780
acctacgacc aagcagcaaa ggtctataac tcaatagctc gacgccgtaa atctcgattt 840
atgactaagg gtcagatcgc cgggttattg tgcctagtgt cctcgcgtaa gtacccgggt 900
cagtttacag accggaagga agaagaagcc aagaaagaca aaactatcta tatctatgat 960
aaaacgatct ggcagattaa acccaagggg acctatggca acgcccgttt taatgtgttt 1020
atcggggacg ttaagcgtaa gccgcgtata cttgatgaca acgaggaccc gcgcaagact 1080
tacaagccaa aggatcaaca cctaatcaga tccatccctg tagagtttaa aggcgagttt 1140
caaaccgata tggttaacgc gctgcgtgag gtagcgggcg tggctacgct tgcctcacac 1200
ccgtttattt tgaataccga cgcgatagac ccatgcttta cagagaaaac caaaagcatt 1260
ttcaaagagt ctatttgcaa ctttgatgat aagaaactac acgtacttaa gaagaatata 1320
tttgcgccgg atattccgcg ttttattcac ttggacttat catctacagg agataaaacg 1380
ggctttgcta tgggatgtat cccgaggttt acgacaatgg accgcggcga cgttaaagag 1440
gttcaccccg tatttagaat agacggtgca ttagctattg aggccccgtt gggtggggag 1500
atcctatact ggcggattcg aaagctaatc tatgctttgc gggatatggg ttacaatatc 1560
aaatggatca cattcgatac ataccaaagt actgacagta agcaaatact agcgcaaaac 1620
ggctttgtaa ccggggttca atccgttgat acttctacgc taccttatga gcttttgaag 1680
tccgctattt acgacgggcg actagtggca ccaccacacg acctattaca attggagtta 1740
gcacgattag agaaagacac taaaaacgat aaaatagacc acccgcccgg cttttctaaa 1800
gacgtttccg acgcggtagc cggggtatgt tatgggctta tgatgcgccg tgaaatatgg 1860
gttagccacg gtattaaccc tgataagatc gtaaacgcag atatagaagc catgaaacga 1920
agtgagaaga aactagaaga tgctaacaaa cgcattaacc gatctagctc aggagacggt 1980
tataacatag aggactaa 1998
<210> 3
<211> 2358
<212> DNA
<213> 噬菌体vB_ValP_PJ32的DNA聚合酶( DNA polymerase I of vB_ValP_PJ32)
<400> 3
atgctttatt tgatggttgg cgaacgcact acgctacatg acctaaaacg agttgtagcg 60
ccagtagtaa aagcgcaagg cataccgcac cggatcatga gatggaccga gggcgaaccg 120
acgctaggac agggcgacgt attattctca atgggaaaag cggcctttga tcacttaacg 180
cgcctaggcg tataccctaa aaatcgaacg gtaactagct ttagagaaaa gccgcagtta 240
cgcggccaag ggcatgtact atgttcttat gacgctgcta taggacgcgt taagccagag 300
catgaagcat ttttgcagat tgatatcatg caagcgtgta gaatgcacca aaccgggacc 360
attaaaccgc agttaggatc ctaccgttgg gttgacgact tcagcgaaat gatcgaggaa 420
atagagcaga cgtataccga gacgggtaaa cccgtccgcg tagcgggaga cttggaaacc 480
gtaggctttg attatgtcgc taaagataag tttatcgtat ccgcgcaatt ctcgcataag 540
gaaggcatgg ccgatttagt gcgattctac agccctgaaa agcagcctaa gccgggggac 600
ttgttacacg atcaaataac ttggctactt aacagcgaaa aagttatcct atgtggggct 660
aactttaagt acgatcttaa ctggataaaa tacaagtggg ggatcgagtg taccaacttt 720
aaactagaca ctacgctagt aggctcactt ctaaacgaaa accgcagtaa tagcctaaat 780
acccacgcga agctattcac gcacctaggc ggctacgatg atgatttaaa tactacgttt 840
gataagggtc gcatggactt gatccctaac gagaacttat taccgtatgc ggggggcgat 900
acagacgcaa ccttaagagt tagaaacgtt ttcgcccgtg aactacagca agaccgttta 960
ttaactaact tctatgttaa tctacttcac ccggctagcc gagcctttga gaaaatggag 1020
caaaacgggg ttaaggttaa cgccgagaaa ttagaaaagt tgggcgaaga actagaacaa 1080
gagaagaacc aatatctggc ggaaatgttc gcaatgatgc caagaccgct agccctgaaa 1140
taccgcggcg aaacccgtat taaatcggct atcgttaaag attatctttt tggcgcgcgt 1200
ggcctaggtc taaagcccgt aatgttcagc gagaagaatc acgaaccgct aacaaacaaa 1260
agccacttga ataactttga cgacccggaa aagtacccgg aggcacacaa atttattcaa 1320
ttggttaaca agtggaacca agcggataag gcacagggga cctattgccg tggattcctt 1380
aagcaccgcc gggaggatgg atatttccac ccttcctata tgttgtttaa gggtgccttt 1440
gaaaacgcta gcggtacaga cgacagcggg accgttaccg ggcgactagc agctaaagac 1500
ccggcgatac aaaccttacc taagaaaacg agcctagcga aaagattgcg tgcatgttac 1560
gagccgccgg aaggttatag cattgttgag atagacttct cacagggtga gttaagggtt 1620
tgtgcggtta tggctaatga acccgctatg aaacaagcgt acaacgaagg cttagacttg 1680
cacgttatct caggcggcgc gacggcgggc ctaacctacg agcaaatgat cgagttagag 1740
aaaaccgacg cggcgcttta taaaaagtac cgtaactatg gtaaaccgca gaacttcggc 1800
cttttgtatg gtatgagttg gggaggcttc caaacgtatg ccaaggacca atacgggatc 1860
ttactatcgg accgtgaagc acaaaacatg cgctttaact tctttgatac atacgcccgc 1920
ttaccggatt ggcacgaaga aacaaaagag tttgctagac agtacggtta cattagatca 1980
cctttaggcc gtgtgcgaca cttaccactg attaattcac gggataattt cctacgaagt 2040
caggccgagc gccaagcggt taacagtggc gtgcagtcca cactatcgga cctacttatt 2100
tacggtatgg cccgcttcag agcacaatac ggcgaccctg acgaagttag atttatggca 2160
atgatccacg atgcgctagt gagctacatc aaaacggacc aattaagtta ttggattcca 2220
attttgcaag ctataatgca agacaccgaa attttatata aagtgtttgg ttgggaggtt 2280
gacatcccat ttatagcaga cgcggaacat tcagaaacta actttgcaga aatgcgagaa 2340
tacaaagagg cagcttaa 2358
