一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂及富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂及富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)，是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，由L-谷氨酸经过谷氨酸脱羧酶催化转化而来，经研究表明γ-氨基丁酸具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，促进长期记忆，能补充人体抑制性神经递质，特别是在改善神经性睡眠和神经性高血压问题上有着很大的作用。γ-氨基丁酸作为一种功能性配料在日本市场和欧美市场应用范围广泛，虽然我国卫生部2009年第12号公告批准其为新食品原料，但是我国食品和保健品市场相关产业增长缓慢，主要原因是γ-氨基丁酸食品级原料价格较贵，生产商受成本制约产品中添加量较少，很难达到功效量，消费者对其功能感受不显著。由此可见，γ-氨基丁酸的生产力低下限制了γ-氨基丁酸在食品中的应用。
现有技术中，额外添加化学合成的γ-氨基丁酸到食品中，不仅增加生产成本，而且合成的γ-氨基丁酸不能被人体吸收利用。天然γ-氨基丁酸的合成依赖于微生物菌种的发酵性能。虽然现有技术中公开了采用单种微生物发酵在一定程度上提高γ-氨基丁酸的含量，但是存在发酵时间过长并且酸度低，容易杂菌污染。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂及富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法，所述发酵剂在增加产品中γ-氨基丁酸含量的同时缩短发酵时间，降低发酵产品中杂菌污染风险。
本发明提供了一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂，包括主发酵菌和协同共生菌；
所述主发酵菌满足以下条件：在谷氨酸钠在原料乳中的终浓度为10g/L、主发酵菌的接种量为1×106CFU/mL时，37℃发酵72h后发酵产物中γ-氨基丁酸的浓度≥2g/L；
所述协同共生菌满足以下条件：具有产酸能力，在发酵16h后使发酵产物的pH值低于4.0和滴定酸度大于120°T，且随着发酵时间的延长，pH值和滴定酸度继续降低；
所述主发酵菌和协同共生菌的活菌数比为(1:0.5)～(1:2)。
优选的，所述主发酵菌包括以下微生物中的一种或几种：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus breris)；
所述协同共生菌包括乳杆菌，所述乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)中的一种或几种。
优选的，所述主发酵菌为嗜热链球菌，所述协同共生菌为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。
优选的，所述主发酵菌为乳酸乳球菌，所述所述协同共生菌为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。
优选的，所述主发酵菌为发酵乳杆菌，所述协同共生菌为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。
优选的，所述主发酵菌为植物乳杆菌，所述协同共生菌为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌；
所述主发酵菌为短乳杆菌；所述协同共生菌为干酪乳杆菌。
优选的，所述主发酵菌为嗜热链球菌和发酵乳杆菌，所述协同共生菌为鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌。
本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法，包括以下步骤：
将谷氨酸钠溶解于原料乳中，谷氨酸钠的终浓度不低于10g/L，杀菌后接种所述发酵剂进行发酵，所述发酵剂中主发酵菌的接种量为5×105～5×106CFU/mL；所述协同共生菌的接种量为2.5×105～1×107CFU/mL；所述发酵的时间为48h～72h。
优选的，所述谷氨酸钠的终浓度为12～30g/L。
本发明提供了所述制备方法制备得到的发酵产品，所述发酵产品中天然γ-氨基丁酸的浓度为6.5～18g/L。
本发明提供了所述发酵产物在制备富含γ-氨基丁酸的食品中的应用。
本发明提供的提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂，属于混菌发酵剂，包括主发酵菌和协同共生菌，其中主发酵菌能够利用谷氨酸钠代谢合成γ-氨基丁酸，大幅提高发酵产物中γ-氨基丁酸的含量，协同共生菌可以促进主发酵菌的生长，进而提高γ-氨基丁酸的产量，同时缩短发酵时间，并且加速酸奶的酸化，降低发酵产物的pH值，从而解决发酵时间过长，单菌发酵pH值不够低导致产品容易污染杂菌的问题。
进一步的，本发明具体限定了主发酵菌和协同共生菌的具体菌种，以及具体菌种的复配方案，实验表明，本发明提供的发酵剂不仅能够较大程度提高发酵产物中γ-氨基丁酸的产量而且缩短了发酵周期，降低污染风险，提高发酵产物的品质。
本发明提供了所述制备方法制备得到的发酵产品，所述发酵产品中天然γ-氨基丁酸的浓度为6.5～18g/L。高产量γ-氨基丁酸的发酵产物作为初始原料可以满足γ-氨基丁酸应用于多种延伸产品的开发中，满足消费者的健康诉求。因此所述发酵产物在制备富含γ-氨基丁酸的食品中的应用，例如发酵乳、奶粉、饼干、溶豆或饮料等。
附图说明
图1为γ-氨基丁酸标准样品色谱图，其中8.5min处为GABA，峰高由小到大依次为0.25g/L、0.5g/L、1g/L和2g/L。
具体实施方式
本发明提供了一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂，包括主发酵菌和协同共生菌；所述主发酵菌满足以下条件：在谷氨酸钠在原料乳中的终浓度为10g/L、主发酵菌的接种量为1×106CFU/mL时，37℃发酵72h后发酵产物中γ-氨基丁酸的浓度≥2g/L；所述协同共生菌满足以下条件：具有产酸能力，在发酵16h后使发酵产物的pH值低于4.0和滴定酸度大于120°T，且随着发酵时间的延长，pH值和滴定酸度继续降低；所述主发酵菌和协同共生菌的活菌数比为(1:0.5)～(1:2)。
在本发明中，所述主发酵菌包括以下微生物中的一种或几种：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus breris)。本发明对所述主发酵菌的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的主发酵菌的来源即可，例如采用常见的商品购买途径购买。
在本发明中，所述协同共生菌优选包括包括乳杆菌。所述乳杆菌优选为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)中的一种或几种。本发明对所述协同共生菌的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的主发酵菌的来源即可，例如采用常见的商品购买途径获得。
在本发明中，所述主发酵菌和协同共生菌的活菌数比优选为1:1～2，更优选为1:1。当所述主发酵菌优选为嗜热链球菌时，所述协同共生菌优选为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。当所述主发酵菌优选为乳酸乳球菌时，所述所述协同共生菌优选为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。当所述主发酵菌优选为发酵乳杆菌时，所述协同共生菌优选为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。所述主发酵菌优选为植物乳杆菌，所述协同共生菌优选为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。当所述主发酵菌优选为短乳杆菌；所述协同共生菌优选为干酪乳杆菌。当主发酵菌为两种时，所述主发酵菌优选为嗜热链球菌和发酵乳杆菌，所述协同共生菌优选为鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌；所述嗜热链球菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌的活菌数比优选为1:1:1:1。本发明对所述主发酵菌和协同共生菌的菌种生产方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规培养方法即可。
在本发明中，所述发酵剂优选还包括辅料。本发明对所述辅料的种类和用量没有特殊限制，采用本领域所熟知的辅料的种类和用量制备即可。本发明对所述发酵剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的发酵剂的制备方法即可。
本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法，包括以下步骤：
将谷氨酸钠溶解于原料乳中，谷氨酸钠的终浓度不低于10g/L，杀菌后接种所述发酵剂进行发酵，所述发酵剂中主发酵菌的接种量为5×105～5×106CFU/mL；所述协同共生菌的接种量为2.5×105～1×107CFU/mL；所述发酵的时间为48h～72h。
在本发明中，所述原料乳优选为新鲜全脂牛奶或者脱脂牛奶或者质量分数≥10％的复原全脂牛奶或者上述牛奶的混合物，同时本发明提供的方法对山羊乳、绵羊乳、驼乳、牦牛奶和马乳同样适用。所述原料乳还优选包括添加有本领域常用配料的原料乳，所述配料包括甜味物质；所述甜味物质为蔗糖、葡萄糖和果糖中的一种或多种。所述的甜味物质的质量占原料乳总质量的4％～10％，更优选为5％～8％，更优选为6％。
在本发明中，谷氨酸钠溶解于原料乳的方法优选先将原料乳加热后再添加谷氨酸钠。所述加热的温度优选为40～50℃，更优选为42～48℃，最优选为45℃。谷氨酸钠溶解后优选包括预热和均质。所述预热的温度优选为50～65℃。所述均质的压力优选为20MPa。
在本发明中，所述谷氨酸钠的终浓度优选为12～30g/L，更优选为15～28g/L，最优选为20g/L。所述发酵的温度优选为30～42℃，更优选为32～40℃，最优选为37℃。
在本发明中，所述杀菌为低温长时灭菌或者高温度瞬时灭菌。所述杀菌的条件优选为温度90℃～95℃灭菌30～60min或121～137℃灭菌5～20s。本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的接种方法即可。
在本发明中，在所述接种前，将灭菌后的原料乳优选降温至40℃以下。所述发酵剂中主发酵菌的接种量优选为5×105～5×106CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL；所述协同共生菌的接种量优选为5×105～5×106CFU/mL，更优选为1×106CFU/mL～2×106CFU/mL。所述发酵的时间为48h～72h，优选为50～64h，更优选为56h。
本发明提供了所述制备方法制备得到的发酵产品，所述发酵产品中天然γ-氨基丁酸的浓度为6.5～18g/L。所述发酵产品随着发酵时间的延长，γ-氨基丁酸的浓度逐渐提高。
本发明提供了所述发酵产物在制备富含γ-氨基丁酸的食品中的应用。所述食品包括奶粉、饼干、溶豆和饮料等。
所述奶粉的制备方法，优选将上述发酵后的高富含γ-氨基丁酸的发酵产物，与糖水调配，或者不调配，均质、喷雾干燥制成。
所述饼干的制备方法，优选将上述发酵后的高富含γ-氨基丁酸发酵产物，按照添加到饼干制作过程中，制备高富含γ-氨基丁酸饼干。
所述溶豆的制备方法，优选将上述发酵后的高富含γ-氨基丁酸发酵产物与糖、稳定剂混合，加压成型，或者磨具成型，冻干后获得富含γ-氨基丁酸溶豆产品。
所述饮料的制备方法，优选将上述发酵后的高富含γ-氨基丁酸发酵产物与糖、稳定剂混合，均质、灭菌或者不灭菌，罐装即可制备成高富含γ-氨基丁酸的死菌型或者活菌型乳酸菌饮料。
下面结合实施例对本发明提供的一种提高发酵乳中γ-氨基丁酸含量的发酵剂及富含γ-氨基丁酸的发酵乳的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
菌种来源说明：本发明中涉及的所有乳酸菌购自于丹尼斯克、科汉森和江苏微康生物有限公司。
实施例1
1)新鲜牛乳(购自光明乳业股份有限公司，蛋白质3.0％，脂肪3.1％)
将新鲜牛乳加热到40℃，与谷氨酸钠混合，使谷氨酸钠的终浓度为11g/L；预热到60℃，95℃，30min杀菌；冷却到37℃，接种主发酵菌嗜热链球菌和协同共生发酵干酪乳杆菌各1×106CFU/mL，在37℃保温发酵48h时，停止发酵。
2)发酵产物中γ-氨基丁酸产量的检查方法
(1)试剂的配制
1)0.1mol/L NaHCO3(pH＝9.8)溶液的配制：取0.42g碳酸氢钠溶于25mL超纯水中，用氢氧化钠调节pH至9.8，最后定容至50mL。
2)Dabsyl Chloride衍生化试剂的配制：取50mg的Dabsyl Chloride试剂，溶于50mL丙酮中。
3)流动相：流动相A：称取醋酸钠试剂4.10g，加入900mL超纯水，用乙酸调节pH至4.0，最后定容至1000mL。流动相B：甲醇。
(2)样品衍生化处理
将上述制备发酵乳在6000r/min下离心10min，取上清液100μL，随后加入200μL的0.1mol/L碳酸氢钠溶液，500μL的Dabsyl Chloride衍生化试剂，200μL超纯水，摇匀后在65℃下进行避光反应20min，最后进行冰浴5min以停止反应，发酵乳需稀释到合适的范围内，使其衍生化完的峰面积在标准曲线内。
(3)HPLC分析条件
高效液相色谱的分离条件：色谱柱：美国安捷伦公司ZORBAX SB-C18型色谱柱(4.6×250mm，5μm)；色谱柱温度为35℃；流动相A：流动相B＝35：65；流动相流速为1.0mL/min；进样量为20μL，每一个样品的进样时间为15min；检测器为紫外检测器，波长425nm，使用前将衍生化后的样品经0.22μm微孔滤膜过滤，并确定进样前微量进样器中无气泡，并将微量进样器的针头外壁擦干再进行进样。结果见图1。
经检测得到γ-氨基丁酸产量为6.5g/L。
实施例2
新鲜脱脂乳(购自光明乳业股份有限公司)，脱脂奶粉(蛋白质3.0％，脂肪3.1％)
将新鲜脱脂乳加热到50℃，与体积占新鲜脱脂乳总体积的3％的脱脂奶粉和体积占新鲜脱脂乳总体积的7％果葡糖浆以及谷氨酸钠混合，使谷氨酸钠的终浓度为20g/L；预热到65℃，在20MPa条件下均质；均质液在137℃，5s杀菌；冷却到40℃，接种主发酵菌嗜热链球菌和协同共生发酵菌鼠李糖乳杆菌各5×106CFU/mL，40℃保温发酵64h，采用实施例1的方法检测得到γ-氨基丁酸产量为12g/L。
实施例3
新鲜牛乳(光明乳业股份有限公司，蛋白质3.0％，脂肪3.1％)
将新鲜牛乳加热到45℃，与占新鲜牛乳总质量的5％量加入蔗糖，加入谷氨酸钠使其终浓度为30g/L；预热到60℃，20MPa均质；121℃，20s杀菌；冷却到32℃，接种主发酵菌嗜热链球菌和协同共生菌发酵乳杆菌各5×105CFU/mL，同时接种鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌各5×105CFU/mL，32℃保温发酵72h时，采用实施例1的方法检测得到γ-氨基丁酸产量18g/L。
实施例4
脱脂奶粉(新西兰恒天然集团)，脱脂奶粉(蛋白质34％)。
脱脂奶粉与水按1：7的质量比混合，得到复原乳，加热到42℃，加入谷氨酸钠，使谷氨酸钠的终浓度为15g/L；预热到63℃，在20MPa条件下均质；在90℃下杀菌90min；冷却到42℃，接种主发酵菌嗜热链球菌，接种量为1×106CFU/mL，同时接入协同共生菌副干酪乳杆菌，接种量为2×106CFU/mL，保温发酵50h时，采用实施例1的方法检测得到γ-氨基丁酸产量为7g/L。
实施例5
新鲜牛乳(光明乳业股份有限公司，蛋白质3.0％，脂肪3.1％)
将新鲜牛乳加热到48℃，加入谷氨酸钠，使谷氨酸钠的终浓度为12g/L；预热到64℃，95℃，30min杀菌；冷却到30℃，接种主发酵菌发酵乳杆菌和协同共生发酵菌干酪乳杆菌各2×106CFU/mL，30℃保温发酵72h时，采用实施例1的方法检测得到γ-氨基丁酸产量为7g/L。
实施例6
新鲜脱脂牛奶(光明乳业股份有限公司)
将新鲜牛乳加热到45℃，加入谷氨酸钠，使谷氨酸钠的终浓度为12g/L；预热到65℃，在95℃条件下杀菌30min；冷却到30℃，接种主发酵菌乳酸乳球菌和协同共生菌鼠李糖乳杆菌各2×106CFU/mL，30℃保温发酵72h时，采用实施例1的方法检测得到γ-氨基丁酸产量8g/L。
实施例7
单菌发酵与混菌发酵所得γ-氨基丁酸产量比较
以全脂鲜牛奶为原料乳，谷氨酸钠添加量30g/L，接种量每种菌均为1×106CFU/mL，接种发酵菌的种类见表1，37℃发酵，其他操作与实施例1相同。发酵48h和72h后，发酵产物中γ-氨基丁酸产量见表1。
表1不同发酵菌发酵48h和72h时发酵产物中γ-氨基丁酸产量
从表1中可以看出，混菌发酵可以大大提高γ-氨基丁酸产量，缩短发酵时间。
实施例8
单菌发酵与混菌发酵得到的发酵产品涨包情况比较
以全脂鲜牛奶为原料乳，谷氨酸钠添加量为30g/L，在95℃条件下灭菌30min，冷却到37℃，接种量每种菌均为1×106CFU/mL，各组接种发酵菌的种类见表2，发酵72h后，罐装50瓶，每瓶150g发酵乳，30℃培养，通过瓶子底部是否突出影响瓶子的站立，观察涨包并测定发酵产品的pH值，计算涨包率(涨包发酵产品与测定发酵产品的比值乘以100％)。结果见表2。
表2不同发酵菌得到发酵产物的终点pH值和涨包率
嗜热链球菌1、嗜热链球菌2表示不同公司购买来源的嗜热链球菌菌株；发酵乳杆菌1和发酵乳杆菌2表示不同公司购买来源的发酵乳杆菌菌株。
从表2中可以看出，混菌发酵因为持续快速的产酸，可以使积累γ-氨基丁酸的发酵过程中维持在较低pH值，抑制霉菌、酵母和产气细菌的繁殖，保证产品稳定性，让长时间发酵产品的产业化成为现实。混菌发酵优良的产品保质期稳定性还可能是因为混菌发酵过程中促进了抗菌肽或者其他抑菌活性物质的积累，后续有待继续研究。
实施例9
单菌发酵与混菌发酵所得γ-氨基丁酸产量比较
以全脂鲜牛奶为原料乳，谷氨酸钠添加量30g/L，接种量每种菌均为1×106CFU/mL，各组发酵菌的种类见表3，37℃发酵，分别发酵48h、72h测定发酵产物中γ-氨基丁酸产量。结果见表3。
表3发酵48h、72h测定发酵产物中γ-氨基丁酸产量
注：保加利亚乳杆菌1、保加利亚乳杆菌2、保加利亚乳杆菌3分别表示从不同的公司购买得到三种不同保加利亚乳杆菌菌株。
从表3中可以看出，传统发酵乳采用嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌复配，虽然两种菌有公认的协同共生关系，可以加快发酵的进行，但是对γ-氨基丁酸的积累并没有显著的提高，瑞士乳杆菌虽然产酸快，但是对γ-氨基丁酸产量的提高也并没有本申请中举例的乳杆菌显著，所以本发明的显著效果并不是凭借常规生产经验可以获得的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
