IL1R1基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL1R1基因改造非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
IL1R1，白介素受体I型，又称CD121a，属于白介素1(IL1)受体家族成员。IL1几乎影响所有的细胞和器官，是炎症反应、自身免疫性反应、感染性疾病、退行性疾病的主要致病因子。IL1亚家族成员包括白介素1α(IL1α)、白介素1β(IL1β)和IL1受体拮抗剂(IL1Ra)，它们的受体是IL1R1和白介素1受体II型(IL1R2)。IL1R1是IL1亚家族的功能受体，负责信号转导，而IL1R2属于诱饵受体，与配体结合后不传导信号。当IL1α、IL1β、IL1Ra与IL1R1结合后，IL1R辅助蛋白(IL1RAcP)被募集到受体处，形成异源二聚体结构，进而激活下游NF-κB、MAPK等信号通路，促使炎症发生。IL1R1主要表达于内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、肝细胞、成纤维细胞、表皮细胞、表皮树突状细胞和T淋巴细胞。大量研究表明，IL1R1在轻度和重度哮喘发病机制中具有重要作用。此外，还有研究发现IL1R1与肿瘤、心血管疾病、睡眠调节等相关。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于IL1R1在肿瘤免疫治疗领域的巨大应用价值和其目前信号通路及生物学功能研究现状，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IL1R1相关信号通路的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种IL1R1基因人源化改造的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包含人IL1R1核苷酸序列的4号外显子的部分、5号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，进一步优选的，包含4-5号内含子和/或8-9号内含子，更优选的，包含4-9号外显子之间的任一内含子;其中，所述人IL1R1核苷酸序列的4号外显子的部分至少包含编码4号外显子第1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至4号外显子最后一个核苷酸为止，9号外显子的部分至少包含从9号外显子第一个核苷酸开始至编码9号外显子最后1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列为止。
优选的，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括插入、翻转、敲除或替换。优选为原位替换。
优选的，所述的构建方法包括用包含人IL1R1核苷酸序列的4号至9号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物IL1R1基因座上，进一步优选的，用包含人IL1R1核苷酸序列的4号外显子的部分、5号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，更优选的，包含4-5号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含4-9号外显子之间的任一内含子，插入或替换到非人动物IL1R1基因座上;其中，所述人IL1R1基因的4号外显子的部分至少包含编码4号外显子第1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至4号外显子最后一个核苷酸为止，9号外显子的部分至少包含从9号外显子第一个核苷酸开始至编码9号外显子最后1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列为止。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列替换至非人动物IL1R1基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列替换至非人动物IL1R1基因的相应区域。
优选的，所述的构建方法包括用包含人IL1R1核苷酸序列的4号至9号外显子全部或部分替换非人动物IL1R1核苷酸序列的3号至8号外显子的全部或部分;其中，所述非人动物IL1R1核苷酸序列包含编码非人动物3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部、8号外显子的部分核苷酸序列，优选的，包含3-4号内含子和/或7-8号内含子，进一步优选的，包含3-8号外显子之间的任一内含子，其中，所述非人动物IL1R1核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含编码3号外显子第1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至编码8号外显子最后1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列为止。
优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化IL1R1基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物IL1R1基因座上。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化IL1R1蛋白的核苷酸序列插入或替换到非人动物IL1R1基因座上。
优选的，所述的插入或替换位点为IL1R1基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL1R1基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可在内源IL1R1基因处造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
优选的，所述的非人动物中人源化IL7R基因是纯合或杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL1R1基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化IL1R1蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行IL1R1基因人源化改造的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
本发明所述的非人动物为啮齿类动物;优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，使用靶向载体进行IL1R1基因人源化改造的非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人IL1R1的4号至9号外显子的全部或部分核苷酸序列;进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，更进一步优选的，包含4-5号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含4-9号外显子之间的任一内含子，其中，所述人IL1R1的核苷酸序列的4号外显子的部分至少包含编码4号外显子第1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至4号外显子最后一个核苷酸为止，9号外显子的部分至少包含从9号外显子第一个核苷酸开始至编码9号外显子最后1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列为止，更进一步优选的，所述靶向载体包含编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL1R1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸;优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90%同源性的核苷酸;进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO.3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL1R1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸;优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90%同源性的核苷酸;进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO.4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1R1基因座上。进一步优选的，位于非人动物IL1R1基因的3号外显子至8号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得非人动物模型。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL1R1蛋白,同时内源IL1R1蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化IL1R1蛋白包含人IL1R1蛋白的胞外区的部分，进一步优选的，所述的胞外区的部分包含C端和N端分别去除0-15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的人IL1R1蛋白胞外区，更优选的，包含与SEQ ID NO.2第24至325位或SEQ ID NO.10具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO.2第24至325位或SEQ ID NO.10所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1R1蛋白还包含非人动物IL1R1蛋白的部分，优选为非人动物IL1R1蛋白的信号肽、胞质区、跨膜区和/或胞外区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1R1蛋白包含下列组中的一种：
a)SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示氨基酸序列的部分或全部;
b)与SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)与SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸;
d)具有SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL1R1基因，所述的人源化IL1R1基因编码人源化IL1R1蛋白。
优选的，所述的人源化IL1R1基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列,进一步优选的，所述的非人动物中包含的IL1R1基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1R1基因包含下列组中的一种：
a)人源化IL1R1基因的mRNA序列为SEQ ID NO.9所示的序列的部分或全部;
b)人源化IL1R1基因的mRNA序列与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)人源化IL1R1基因的mRNA序列与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;
d)人源化IL1R1基因的mRNA序列具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种IL1R1基因人源化改造的非人动物，所述的非人动物采用上述构建方法获得。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人IL1R1核苷酸序列的部分。
优选的，所述的人IL1R1核苷酸序列的部分包含人IL1R1的4号至9号外显子的全部或部分核苷酸序列;进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至8号外显子的全部和9号外显子的部分，更优选的，包含4-5号内含子和/或8-9号内含子，更进一步优选的，包含4-9号外显子之间的任一内含子，其中，所述人IL1R1的核苷酸序列的4号外显子的部分至少包含编码4号外显子第1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至4号外显子最后一个核苷酸为止，9号外显子的部分至少包含从9号外显子第一个核苷酸开始至编码9号外显子最后1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列为止。
优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列或者SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL1R1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸;优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90%同源性的核苷酸;进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO.3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL1R1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸;优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90%同源性的核苷酸;进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO.4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1R1基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL1R1基因3号至8号外显子上。
本发明所述的非人动物为啮齿类动物;优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在IL1R1基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于翻转、敲除、插入或替换。
本发明的第六方面，涉及一种IL1R1基因改造的人源化细胞，所述的人源化IL1R1基因改造细胞的基因组中包括人IL1R1基因的4号外显子至9号外显子。
优选的，所述的人IL1R1基因编码SEQ ID NO.2第24至325位氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，其通过内源性IL1R1调控元件调控;该人源化IL1R1基因改造细胞体内表达人或人源化IL1R1蛋白，同时内源IL1R1蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的人IL1R1基因通过内源性IL1R1调控元件调控。
本发明的第七方面，涉及一种IL1R1基因缺失的细胞，所述的IL1R1基因缺失的细胞缺失内源IL1R1基因的3号外显子至8号外显子。
本发明的第八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
(a)应用上述的构建方法制备获得非人动物模型;
(b)将步骤(a)制备获得的非人动物与除IL1R1外的人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化改造动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因CD3、PD-1、PD-L1、IL-1β、ST2人源化的非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
优选的，所述的其他基因优选为CD3、PD-1、PD-L1、IL-1β、ST2。
本发明的第九方面，涉及上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因修饰非人动物或其后代。
本发明的第十方面，涉及一种疾病动物模型，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的人源化IL1R1基因改造非人动物或上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备动物的步骤，优选的，所述的疾病包括心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、退行性疾病、睡眠疾病、肿瘤或炎症。
优选的，所述的疾病动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的人源化基因改造动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十一方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或者上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物在制备疾病动物模型中的应用，优选的，所述的疾病包括心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、退行性疾病、睡眠疾病、肿瘤或炎症。
本发明的第十二方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法获得的IL1R1基因人源化改造的非人动物、上述的IL1R1基因人源化改造的非人动物、上述的构建方法制备获得的多基因修饰非人动物、上述的多基因修饰非人动物或其后代或上述的疾病动物模型。
本发明的第十三方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法获得的IL1R1基因人源化改造的非人动物、上述的IL1R1基因人源化改造的非人动物、上述的构建方法制备获得的多基因修饰非人动物、上述的多基因修饰非人动物或其后代或上述的疾病动物模型。
优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第十四方面，提供了一种人源化IL1R1蛋白，所述的人源化IL1R1蛋白包含人IL1R1蛋白的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IL1R1蛋白包含人IL1R1蛋白的胞外区的部分，更优选的，所述的胞外区的部分包含C端和N端分别去除0-15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的人IL1R1蛋白胞外区。
优选的，所述的人源化IL1R1蛋白包含与SEQ ID NO.2第24至325位或SEQ IDNO.10具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ IDNO.2第24至325位或SEQ ID NO.10所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL1R1蛋白还包含非人动物IL1R1蛋白的部分，优选为非人动物IL1R1蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区。
优选的，所述的人源化IL1R1蛋白包含人IL1R1基因的4号外显子至9号外显子编码的氨基酸序列，和非人动物IL1R1蛋白的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1R1蛋白包含下列组中的一种：
a)SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示氨基酸序列的部分或全部;
b)与SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)与SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸;
d)具有SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.2第24至325位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十五方面，提供了一种编码上述人源化IL1R1蛋白的人源化IL1R1基因，所述的人源化IL1R1基因包含人IL1R1基因的4号外显子至9号外显子，和非人动物IL1R1基因的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1R1基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL1R1基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1R1基因中包含的人IL1R1核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
(A)包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的全部或部分;
(B)包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列;
(C)包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列;
(D)具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL1R1基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
(a)包含SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的全部或部分;
(b)包含与SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列;
(c)包含与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列;或
(d)包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明的第十六方面，涉及一种表达上述的人源化IL1R1蛋白的构建体。
本发明的第十七方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第十八方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
本发明的第十九方面，涉及了一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化IL1R1蛋白或上述的人源化IL1R1基因在制备治疗或预防心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、退行性疾病、睡眠疾病、肿瘤或炎症的药物中的应用。
本发明的第二十方面，涉及一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化IL1R1蛋白或上述的人源化IL1R1基因在IL1R1基因或蛋白中相关研究中的应用，所述的应用包括：
A)涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用;
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用;
C)涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发诊断策略或用于开发治疗策略中的应用;
D)在体内研究人IL1R1信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价;或者，
E)研究IL1R1基因功能，研究人IL1R1抗体，研究针对人IL1R1靶位点的药物、药效，研究心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、退行性疾病、睡眠疾病、肿瘤或炎症相关疾病药物方面的用途。
优选的，所述应用包括在制备药物组合物或者检测试剂盒中的用途。
优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病;所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症;所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌。
本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中，述的免疫相关疾病为哮喘。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
本发明所述的“心血管疾病”包括但不限于冠状动脉症候群、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、动脉瘤、心肌病变、心房颤动、先天性心脏病、心内膜炎、以及周边动脉阻塞性疾病等。
本发明所述的“感染性疾病”包括但不限于鼠疫、霍乱、艾滋病、非典型肺炎、甲流、肺结核、禽流感、病毒性肝炎、狂犬病、脊髓灰质炎、麻疹、流行性脑脊髓膜炎、流行性乙型脑炎、流行性出血热、钩端螺旋体病、伤寒以及血吸虫病等。
本发明所述的“退行性疾病”包括但不限于阿兹海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、动脉粥样硬化、进行性神经性腓骨肌萎缩症、慢性创伤性脑病变、埃勒斯-当洛二氏症候群、原发性震颤、弗里德赖希氏共济失调、心血管疾病 、亨丁顿舞蹈症、老年黄斑变性、马凡氏症候群、多发性硬化症、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、尼曼匹克症、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森氏症、进行性核上性麻痹、前列腺炎、视网膜色素变性、Tay-sachs、小脑萎缩症等。
本发明所述的“睡眠疾病”包括但不限于失眠、睡眠相关呼吸障碍、中枢性睡眠增多、昼夜节律睡眠觉醒障碍、异态睡眠、睡眠相关运动障碍、独立症候群、其他睡眠障碍等。
本发明所述的IL1R1基因人源化的非人动物体内可以正常表达人或人源化IL1R1蛋白。可用于针对人IL1R1靶位点的药物筛选、药效评估、心血管疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、退行性疾病、睡眠疾病、肿瘤或炎症相关疾病治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究IL1R1蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化IL1R1蛋白”，包含来源于人IL1R1蛋白的部分和非人IL1R1蛋白的部分。其中，所述的“人IL1R1蛋白”同“人IL1R1蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人IL1R1蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IL1R1蛋白的部分”，为连续或间隔的5-569个(优选为10-302个)氨基酸序列与人IL1R1蛋白的氨基酸序列一致或与人IL1R1蛋白的氨基酸序列具有70%以上同源性。
本发明所述的“人IL1R1蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5-319个(优选为5-302个)氨基酸序列与人IL1R1蛋白的胞外区氨基酸序列一致，或与人IL1R1蛋白的胞外区氨基酸序列具有70%以上同源性。
本发明所述的“人源化IL1R1基因”，包含来源于人IL1R1核苷酸序列的部分和非人IL1R1基因的部分。其中，所述的“人IL1R1核苷酸序列”同“人IL1R1核苷酸序列的全部”，即其核苷酸序列与人IL1R1核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人IL1R1核苷酸序列的部分”为连续或间隔的20-93722bp(优选为20-8041bp)个核苷酸序列与人IL1R1核苷酸序列一致或与人IL1R1核苷酸序列具有70%以上同源性。
本发明所述的“x号外显子至xx号外显子”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列。例如“4号外显子至9号外显子”包含4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子和9号外显子的核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如所述的“4-5号内含子”表示4号外显子与5号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人IL1R1核苷酸序列的4号外显子的部分，包含连续或间隔的5-79bp个，优选10-76bp个核苷酸序列与人IL1R1核苷酸序列的4号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化IL1R1基因”中包含的“4号外显子的部分”至少包括4号外显子去除编码前第4个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL1R1基因座”表示IL1R1基因上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IL1R1基因座可以是IL1R1基因3号外显子至8号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989);DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985);Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984);Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984);Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986);B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984);the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987);Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir andC.C.Blackwell，eds.，1986);and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠IL1R1基因和人IL1R1基因座对比示意图(非按比例);
图2：小鼠IL1R1基因人源化改造示意图其中，chiExon1对应mExon1，chiExon2对应mExon2，chiExon3-5对应mExon3部分、hExon4部分和hExon5-6，chiExon6对应hExon7，chiExon7-8对应hExon8、hExon9部分和mExon8，chiExon11对应mExon11(非按比例);
图3：IL1R1基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例);
图4：IL1R1重组后细胞Southern Blot结果，其中WT为野生型对照;
图5：IL1R1人源化小鼠F1代鼠尾基因型鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC1、PC2均为阳性对照;
图6：IL1R1基因人源化小鼠杂合子RT-PCR检测结果，其中，图6A为使用mIL1R1-F1和mIL1R1-R1引物对的结果，图6B为使用mIL1R1-F2和mIL1R1-R2引物对的结果, 图6C为使用hIL1R1-F1和hIL1R1-R1引物对的结果, 图6D为使用hIL1R1-F2和hIL1R1-R2引物对的结果,图6E为使用作为内参的GAPDH-F和GAPDH-R引物对的结果，+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/+为IL1R1基因人源化杂合子小鼠，H2O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
NcoI、HindIII、KpnI酶购自NEB，货号分别为R0193M、R3104M、R0142M;
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心。
实施例1 IL1R1基因人源化小鼠
本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化IL1R1蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化IL1R1蛋白。小鼠IL1R1基因(NCBI Gene ID：16177，Primary source：MGI：96545，UniProt：P13504，位于1号染色体NC_000067.6的第40222480至40316201位，基于转录本NM_008362.2及其编码蛋白NP_032388.1(SEQ ID NO.1))和人IL1R1基因(NCBI Gene ID：3554，Primary source：HGNC:5993，UniProt ID：P14778，位于2号染色体NC_000002.12的第102069638至102179874位，基于转录本NM_000877.4及其编码蛋白NP_000868.1(SEQ ID NO.2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL1R1基因座引入编码人IL1R1蛋白的核苷酸序列(DNA序列、cDNA序列等)，使得该小鼠表达人或人源化IL1R1蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术将小鼠IL1R1基因的3号外显子部分序列至8号外显子部分序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL1R1基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠IL1R1基因的人源化改造。
如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠IL1R1基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL1R1 DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO.3)与NCBI登录号为NC_000067.6的第40288525至40293127位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO.4)与NCBI登录号为NC_000067.6的第40303047至40308363位核苷酸序列相同;A片段上包含人IL1R1基因的4号外显子部分序列至9号外显子部分序列的基因组DNA序列(SEQ ID NO.5)，该DNA序列与NCBI登录号为NC_000002.12的第102164782至102172822位核苷酸序列相同;A片段中人IL1R1 DNA序列下游与小鼠IL1R1基因的连接设计为5’-ttttgccaagaatacacatggtatagatgcagcatatatccagttaatatacccaggtaagtatcaaaggcttacttaaa-3’(SEQ ID NO.6)，其中序列“atatc”中的 “c”是人序列的最后一个核苷酸，序列“cagtt”中的“c”是小鼠序列的第一个核苷酸。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为5’-ctaaacaatactaaagctgactaagaaaagcaggacatagAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAG-3’(SEQ ID NO.7)，其中序列“catag”中的 “g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“AAGCT”中的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸;Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为5’-ATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATTAGGTGGATCCgaggagagagttggaatcttctggatggagatagtgtgagt-3’(SEQ ID NO.8)，其中序列“GATCC”中的最后一个 “C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“gagga”中的第一个 “g”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠IL1R1的mRNA序列如SEQ IDNO.9所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO.10所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用NcoI或HindIII或KpnI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果见如图4所示，检测结果表明5个经PCR验证为阳性的克隆均无随机插入，经测序进一步验证这5个克隆均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1-E02、1-E11、1-F01、1-G09、2-D04。
表1：具体探针及目的片段长度
其中，PCR测定包括下述引物：
F1：5’-gattgaccacttccactcgttgtg-3’(SEQ ID NO.11)，
R1：5’-gcagatacattctattgtccaggg-3’(SEQ ID NO.12);
F2：5’-AGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTC-3’(SEQ ID NO.13)，
R2：5’-AACGTCATGTCGAGCTGGTATCGG-3’(SEQ ID NO.14);
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
5’Probe-F：5’-CCATCCCATCCCTCCTCCTCTGTTT-3’(SEQ ID NO.15)，
5’Probe-R：5’-gaagcaggcagtggcaacagtgaca-3’(SEQ ID NO.16);
3’探针(3’Probe)：
3’Probe-F：5’-ccctggttgctacccatatcttggc-3’(SEQ ID NO.17)，
3’Probe-R：5’-ccagagcaggagtccctgtaccaaa-3’(SEQ ID NO.18);
Neo探针(Neo Probe)：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO.19)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO.20)。
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到人源化IL1R1基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图5，其中，编号为F1-01到F1-10的10只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化IL1R1基因工程小鼠。
表2：引物名称及具体序列
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人IL1R1的 mRNA和蛋白表达情况，例如可以使用RT-PCR检测IL1R1人源化小鼠体内IL1R1 mRNA的表达。具体来说，分别选取野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的IL1R1基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏细胞，设计如表3所示引物序列对C57BL/6小鼠和IL1R1基因人源化杂合子小鼠脾脏细胞的mRNA表达情况进行检测。图6A、6C显示鼠IL1R1 mRNA的表达的表达情况， 图6B、6D显示人IL1R1 mRNA的表达的表达情况,图6E显示GAPDH内参结果,综合图6结果显示，在C57BL/6小鼠脾脏细胞中仅检测到鼠IL1R1 mRNA的表达;在IL1R1基因人源化杂合子小鼠脾脏细胞中不仅检测到鼠IL1R1 mRNA的表达，也检测到了人IL1R1 mRNA的表达。
表3：RT-PCR引物名称及具体序列
实施例2 双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的IL1R1基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有CD3、PD-1、PD-L1、IL-1β、ST2等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在IL1R1基因人源化小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得IL1R1与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的IL1R1小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IL1R1与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人IL1R1和其它基因调节剂的体内药效验证等。
实施例3 动物模型体内药效验证
利用本发明公开的IL1R1基因人源化小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括哮喘、过敏等模型，用于测试人特异性抗体的体内药效。以哮喘模型为例，选取本发明制备的IL1R1基因人源化小鼠，采用卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝腹腔注射致敏3次，首次注射3周后使用2% OVA连续雾化5天激发可诱导制作哮喘模型，对照组用PBS替换OVA，在第26天获得样品用于分析。通过检测血清IgE水平、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞等指标评价模型构建成功。使用抗人IL1R1抗体进行治疗，实验结束时可以通过常规方法，如气道反应性检测、苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin，HE)或免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)病理检测、炎症细胞和IgE检测评估抗人抗体的药效。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> IL1R1基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
<130> 1
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 576
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
Met Glu Asn Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ile Cys Leu Met Val Pro
1 5 1015
Leu Leu Ser Leu Glu Ile Asp Val Cys Thr Glu Tyr Pro Asn Gln Ile
202530
Val Leu Phe Leu Ser Val Asn Glu Ile Asp Ile Arg Lys Cys Pro Leu
354045
Thr Pro Asn Lys Met His Gly Asp Thr Ile Ile Trp Tyr Lys Asn Asp
505560
Ser Lys Thr Pro Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ser Arg Ile His Gln Gln
65707580
Asn Glu His Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly Tyr
859095
Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Asn Ser Thr Tyr Cys Leu Lys Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Thr Val Leu Glu Asn Asp Pro Gly Leu Cys Tyr Ser Thr Gln
115 120 125
Ala Thr Phe Pro Gln Arg Leu His Ile Ala Gly Asp Gly Ser Leu Val
130 135 140
Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Glu
145 150 155 160
Val Gln Trp Tyr Lys Asn Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Val Ser
165 170 175
Phe Phe Gly Val Lys Asp Lys Leu Leu Val Arg Asn Val Ala Glu Glu
180 185 190
His Arg Gly Asp Tyr Ile Cys Arg Met Ser Tyr Thr Phe Arg Gly Lys
195 200 205
Gln Tyr Pro Val Thr Arg Val Ile Gln Phe Ile Thr Ile Asp Glu Asn
210 215 220
Lys Arg Asp Arg Pro Val Ile Leu Ser Pro Arg Asn Glu Thr Ile Glu
225 230 235 240
Ala Asp Pro Gly Ser Met Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln
245 250 255
Phe Ser Asp Leu Val Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Glu Ile Glu Trp
260 265 270
Asn Asp Pro Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Gln Phe Val Glu His Pro Ser
275 280 285
Thr Lys Arg Lys Tyr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Asn Ile Ser Glu Val
290 295 300
Lys Ser Gln Phe Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys Val Val Lys Asn Thr
305 310 315 320
Asn Ile Phe Glu Ser Ala His Val Gln Leu Ile Tyr Pro Val Pro Asp
325 330 335
Phe Lys Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Phe Ile Ile Leu Thr Ala Thr Ile
340 345 350
Val Cys Cys Val Cys Ile Tyr Lys Val Phe Lys Val Asp Ile Val Leu
355 360 365
Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Ser Gly Phe Leu Pro Ser Lys Ala Ser Asp
370 375 380
Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Gly Glu
385 390 395 400
Gly Ser Phe Ser Asp Leu Asp Thr Phe Val Phe Lys Leu Leu Pro Glu
405 410 415
Val Leu Glu Gly Gln Phe Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp
420 425 430
Asp Tyr Val Gly Glu Asp Thr Ile Glu Val Thr Asn Glu Asn Val Lys
435 440 445
Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Asp Met Gly Gly Phe
450 455 460
Ser Trp Leu Gly Gln Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Ile Tyr Asn Ala
465 470 475 480
Leu Ile Gln Glu Gly Ile Lys Ile Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile
485 490 495
Gln Asp Tyr Glu Lys Met Pro Asp Ser Ile Gln Phe Ile Lys Gln Lys
500 505 510
His Gly Val Ile Cys Trp Ser Gly Asp Phe Gln Glu Arg Pro Gln Ser
515 520 525
Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Leu Arg Tyr Gln Met Pro Ala Gln
530 535 540
Arg Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu Thr Leu Asp Pro Val
545 550 555 560
Arg Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala Thr His Leu Pro Leu Gly
565 570 575
<210> 2
<211> 569
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser
1 5 1015
Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu
202530
Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro
354045
Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr
505560
Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys
65707580
Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys
859095
Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys
100 105 110
Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe
115 120 125
Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr
130 135 140
Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp
145 150 155 160
Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly
165 170 175
Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly
180 185 190
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro
195 200 205
Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr
210 215 220
Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu
225 230 235 240
Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg
275 280 285
Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg
290 295 300
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys
325 330 335
His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser
340 345 350
Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg
355 360 365
Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr
370 375 380
Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr
385 390 395 400
Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu
405 410 415
Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val
420 425 430
Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg
435 440 445
Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu
450 455 460
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln
465 470 475 480
Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr
485 490 495
Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala
500 505 510
Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr
515 520 525
Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser
530 535 540
Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu
545 550 555 560
Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly
565
<210> 3
<211> 4603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactttctg aaccagcctt gtagagtcta tgtctattga agtcactggt aaatgtagtg 60
actggctaat gattagaaga cctgtggccc tgtattctct accttttgct gaggggcaac 120
atgtgagctg tttacagctc tgccttagcc tttccttcct gcctgtagat gacctcagat 180
gtgagtctga acccttttct ggatctgttg gacagctgtg catgtgtgag tctgatcctc 240
ctttcccagg aataggccag agcattcagg tctctcttag gctatggctc ttgtgttctg 300
actgaggtag cttcagtaaa cacttgctgc cttattaaat agttgacact gagtttgttc 360
cctgaacacc ttgaggatag ggctcttctg aagaatctga gtcaggtcag taacctggat 420
atttgagaac ctccagacct gctctgcttg tgcaaagctg cttgttttca gagacattat 480
atttgcacag gtcctggttt gaatattagg gatctgagga gaagggtgtg gtagctaatt 540
cacaaagcaa taaaacatgc tgttccattt ttatcaacaa cttcctgagt cttcctcctt 600
ctccttctgt tctttctcct tgtctccctc ctcctcttcc taataaatgt ttctctgagt 660
gtcggatgcc tttgacttag gggaaaccca gacaaacctg aaccccacct tggccttacc 720
ctgcttttag ggatgaacga gttacagaga ctaagttatg tttctgtaga acatgcaagt 780
tgacaagatg gctgtttctt ctaatttact ttgtattttt ttcaaaaacc acttcaatat 840
atttgtgtgt attatgtctg agtcttgatg ctaatcgagt gacacatgct gatgctattc 900
tgacttagtt gtgacaactt tataaagctt tataggttta taagattttg gtaatgagtt 960
ttggggtgct cagagataag aacccaaatg cctcgtttgt caatttgtat gaaatgttct 1020
gatcatattt tgattgagat taaattgaat ataaatgtgt ttggaatata tttaacagga 1080
acagcttaac aagagcaatt ctgtttttac aaataaatca tttatctact tgtttgtaac 1140
ttatctaact tactgaagtg aaattttcca actttcagtc tataatttta ttttatacat 1200
ttaactttag tttttaatac cttttggtac tactgtaatg tgatttctaa aaatcacagt 1260
ttgctgagag ttttattgaa ttttaattaa atgcctcttt ctgcatctgt tgagattttt 1320
gtataattaa aaaagctctt agtatatgga tatttaaagt tttaatgttt ttcaaatata 1380
aatttataat acattatctt tttaacatat atcctgtagg attcaattag gtaaaatatt 1440
tgaaagagac acatctgtat ttataagaga gtttggtttg tggtttcgtt gtaatgaaat 1500
tggtttgggt aacagattga tgctgatgtc acatgtaagt ttggaggcat cactgtctcc 1560
ttaatatttg ggagggtttg atcagaattg acaatcatgt ctttgctacc aggaaagacc 1620
tgaatgtgaa gccatccaga cttgacatgg tctctggtag gatcttttac tacaagttct 1680
cttagaaggc acaggacagt ttaggctatc tctccctgag gatgttttga tagcttgtgt 1740
ctttcagaaa tctttgccat tttatttatg acattggatt tattacatta aggctgttca 1800
tgatactcct cttacccttt caaggtccct ttaatgagac atcttttttc tcctgattag 1860
aaatttattt attggaggtt tagttttcct ctaccagatc tttattaatt ttatgaaaga 1920
tgtatctatt ctggaatctt taattgctct tccttttctc tttttatttc aaccatgtct 1980
tcccagtcat tgtttactat cagcttacac tgctgctgga ttaatcaagt ttggtatttt 2040
ctaaaaggta tgattgcttc atatttcgag gagctgttca cagctggtaa ggctgtgccc 2100
gcaaggccta gtcatttctg aggtttgtgg gcagtttgcg gcctagagcc tgcttctcat 2160
gtgtcgtctg accccggctc tgcttccaca cccctcagga ttgatcagcc tttcacacac 2220
aaacccagcc tttcttcctc ctgctgggag tgagtgcaca gccagggggc gatcacccat 2280
gagtaagctc ctatcacctg gatgctctgc cgcccatgtg gatcctgaaa ttgctgagct 2340
ggcctctgct gatttcaatc catgagctaa aacaagggtt tcattcgttt aaattgtttc 2400
agtcacaaca ataagtaaaa aagatggatc caggagccat tagtatcacg ttctggcgaa 2460
gaagatgtct agtgttatct gtgtctggaa actatgcatg agctgacttt agaggtgacg 2520
ggcagttagt tgtatgtagg ggatttcaag gcagtccaac attcaggcta tggcagggtt 2580
gttgctggct gtgctcagtc aagtttatag tgaggttagg gatcacactg tggagcagag 2640
gagttcaaaa cttgcccttt ggtcagaaga agccagggta aagctgaggc taagaagatg 2700
tgatgtctga agatagcggt gccttttaaa agaagttgag tgcttcacaa ggtcgtctca 2760
agggtatgaa agcacctctg gggtgcccat ctcatcatgg agggccacct gcccaaggaa 2820
aaggcactgt ttcagttact tgagtcctcc aggggctcag aggccataca gcaatggtcc 2880
aaggaggtag agctaacatt gaagctagca gaagacctta gtatcagcca tacaatgcca 2940
tcattcatga taaaaaaaat gtgaattttc aaaggaattc ctgagagtac aggcactgca 3000
acaggcttgg aagtcctgta agcagtcaag agaggtcatt tagagaaact tgaccctgtg 3060
gtgtgtttcc ctgattagtt cttgatatgc ccagcccact gtgagtgata taagttgttt 3120
tgttgttgta caggtgccca tagtaagaga tggtcttgag tctcagtaga gacatgggct 3180
tagagttccc agtactgtta gaactttaag gaccttcttg cgtattctta cagatgggat 3240
ggcctacaag cagtttttat attgtaagca atcatgagcc tttgagggcc agggtttgaa 3300
tgttggggtt tgaagattaa atttcctcca taggctcatc cttacgttaa ctacctgcaa 3360
ctgtgaagtt tcactatgag tgaagtatta tttaacagga cattttgtct gatagtgttt 3420
tcttctttgt gaaggaattc ttggacagtt tctcgagagt acagatctcc agaggatgga 3480
ttcttagagc ttttaacatc ctctcggtga tttggaaagt cattttcact ggaatgacgg 3540
ctggataata tttttactcc ctagaagaat ggttgtaact aacccctttt ggttttgttt 3600
cttaacagat gtacttaaaa atgaaaaagt agccaggtgg tggtggcaca tgcctttaat 3660
cccagagttt aggaggctga ggcatgtgga tctctataag ttcaaggcca gtctggtcta 3720
caaagctagt tctaagacag ccaagactat acacagaaac tgtgtcttga aaaaaataac 3780
aaaataaaca aatacattta aaaaaagcat ctctggctac ttaagatttt cttgtcactg 3840
gtgttaacag tcttatttta gacagttggc gtggttccct ttttcctttt cttggtgttc 3900
attgtgtctt tggggctcag gctcattata acttcttaag aaatttcagc atgtgtttcc 3960
acactccctc agcagttcat agtcaacatg atccagctgc cccagctatc tcttaatctc 4020
agatattttc taaagttgca tcttcaggtt ttcttagttt ttcttcccag tatattttca 4080
acttggcgat gcattttttt tttttttttg agtactagaa gtcttttctt tttaattgtt 4140
ttatgtctct gttgcctgtc tcttccatct cttttagcat cttgagcaag tagaagacaa 4200
tattacggca agccttgaac agtcttgtgt cctatgggtg tccaaataag ttgttcaagt 4260
gggagggcgt atattcagtc ttctcttctc ctttgtacag aagtcactgt ttccccttca 4320
ttattcctcc ctttagaaga atagggagaa agtaagaggg gatagtaacc tgcccggggt 4380
acagcccaca gggaacatgt gacaaagcag gaactgactg taaatgattc aaactctgaa 4440
gaccacggtc ttgaacgcac aactggagag tgtacacatg gcaggagctg gtgtctttac 4500
taaccaatga tgctaaatta gttcagatgt gtaagtcaca ttaagaaaca ctggaaactc 4560
ttcttgacat tgcttctcct ttctctcttt taaagacgta tgt 4603
<210> 4
<211> 5317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggagagag ttggaatctt ctggatggag atagtgtgag tacaagacat agctactagt 60
gtctcccagc ttatggccaa tctgccagga ttcaccatag gagaaattag atttaataag 120
gcttacaaga tgaggattct agttgttgtt cccagagatt gagttaccat tgtttctgaa 180
ctaagtttgt gtggtgtttt tcttctttta atgacttggc tgggtttcag agagaaaggt 240
acaacagcaa agtgtgggtt tgcctgatgt gcatcacaaa ggccatgggg gattggaagc 300
atggggccag catgataaca accgccagtg ggaacttagt gtgctgggtg gagagacttt 360
ggagttttga gtcagagagt ctccaggaga taagaacagg ccgtgccacc agttcatagc 420
tggccagccc gccagggcaa agagtagctg ggtatagcat gggaacttgc cagtcctttt 480
taatatttcc tgcaccaggt ggtaaaccaa agtgttgggt acgaatccac tagaaattta 540
agattagtag cctgagagtt aaagtttcat cttctaagtg agagaaaggt agcactagat 600
tagtcacatg atccaagcgc ggggtggggg ggtaaggggt ggggacactg aaactaagca 660
ggccctgagg ttccccgctg tggggaattg caagctgcct tgagttagat agaagaatga 720
agttgcctac attgtaaggc agagggattg aactgtgaat ttaaaattgg gagtatttgc 780
ttttaggata gatttatata cagattctgt ccaaatcaca tggggaattt cgtctgtggt 840
ttggaactag gatagggaaa attagtcaca gtagagagag cagtgataat cattgcctgc 900
tttgatcagg tattaattat caatgtctgt ggctccaggt agagagagca acagatagat 960
attatacatt atattatagg tattaataat gtctatggct ctaggcagcg agctgaacag 1020
aaagatggta ttgctctaat acgtctaata cgtcttacag gatactcaaa ttctgtctta 1080
catgggctcc acgggaattc tgggtataaa ttctgctttg actagctgcc tgcttataag 1140
cagaaacaag tgtgaattga ttgttttaaa gatggtataa acacacattg ctctaatatg 1200
cctcacagga tactcaaatt ctgtctaacg tgggctccat gggaattctt ggttattatg 1260
ctgcctggca aaatagaaaa ggcctaagaa taggcacata cagtatttta gtttacttca 1320
tgtgttttgg attgttttaa ctttcaaaat gggtgtgatg agttttgtgg ttattttact 1380
cctctgggag agaggtcgat ataaaggatt ttctggttac tggctcaagg atatgctgat 1440
ttgggagaaa ggtcttgtct ttgtgttttt agaaaaggtg attagtgctg ggcgtggtag 1500
cacacgcctt taatcccagc actcgggagg caaaagcaag tggatttctg aggccagcct 1560
ggtctacaaa gtgagttcca ggacagccag ggctacacag agaaactctg tctcaaaaaa 1620
accaaccccc cccccccaaa aaaaaaggtg attagtgtct atataccttc cagagtaatt 1680
tggatcagat ttgatagagg gaaacctcca gagaactaga ttccagagaa tcaaacaaaa 1740
aagttatctt gatgatgcta aattttgttt tgagatttgt atattacagc cttggtgagt 1800
ctcctcatcg gacatgatga actgacctgc ttgaactcct gatgtcttga acttaaagct 1860
gaatctattc aggacacaga catcagagac taatacaatc attggtgtgg ctttcttaag 1920
gccaacaaac tcccccattt tccctcccct ccccccaccc ctttcaaaaa tatctcaatg 1980
cccatattca gcttgaagaa gttataaaaa gtctttgtcc cagttccctg ggctttagga 2040
ctggatgtgg ttattctaag gttgcctttc tagggaatga agaaatggtc ataattggaa 2100
caaggaggaa atagctagaa ttgattgtat agccataatc tcatttggta gaaattttta 2160
taattgttac taagttgaag tcatactttc ttattttggt acagaattaa ttttgataga 2220
aaattaaggt tttcattggt ataaatttct tctattgata caaaaatttt aaaaagtata 2280
gggcttagac gcagtccttc tataactatt attataaact gatctgagat gaagcctgtg 2340
agttaagggc cagataacaa attcacgact ctgagcttat tgttagggtg ctttcaagat 2400
atttagttag aaatatctga gagtagttaa tggacaacag tccagattac tttacataga 2460
gagttggctt tcaaaaacgc cagatatcca cagaatgtga cgtttaatgt tatttattca 2520
cttgttgaga caaatctgct cctaacagct tcctattcat ggattcaaag aagaaactga 2580
gcatcactgg agttgctcca gttgtgttga gacagccact tggcagaaat tgcctcattt 2640
catctacaga cataatactg tccagaaaaa gaacacagtt tacaggttag gacagcttag 2700
ttctgctgag acagaatagg ctagtcctta acttcctact tctctaggac tgtcagatga 2760
tcctgggcca gaaggctgaa gacagatgga tactccagct tactgacgta ctggggctgg 2820
ataggtaggc agctgtctct ataatttgtc tcagttctgg aagctgtgtt aggcttccta 2880
tatattttca gttaatgttg gtcattctca gatttctgat ggggttgaaa aactacctac 2940
agtctcatag ccaacccagg ctatttactg tgagaaagta gatttgagag gatggttttc 3000
aaatgacata ctatctaaag caaagatata actcaaggta gaataataac tcttttaatt 3060
taggatagat gacaaagttc tatctaaata acataaatga tggactgggt gttagttcta 3120
tcttatactt tataaattac aaaatggtag tagttgtgtt ctatttatac atgagagaaa 3180
gtttgttatt agaacagaaa gggggaagtg gccctggtgc tgtttgtatt ttgatgctaa 3240
ttccgctccc cagggagggg atgaggacaa ggagtgagtc atgtagccag gtgacttctt 3300
gtgaaccaat cccttaatga ataaaggagt caatcactgg gtgagtaggc aggacttctg 3360
ggttggaccg aggaagagaa ggaggaagag agagttagag ttttttggac agggatatca 3420
tgaggacaag atgtagctaa tagtgtctcc tggcttatgg agaatcctag tggattcacc 3480
actggagaaa ttagatttaa tatggcgtac aagattaggg ttctagttca tatttggtct 3540
tgcaaacttt atatgcccca gtacagggga atgccagggc caaggaagtg ggagtgagtg 3600
cataggggag cagggcgggg ggcggggggg gggggaagta tagggaactt tctggatagc 3660
atttgaaatg taaataaagt aaatatctaa taaaaaaaga agaagaagaa gaaaaaagat 3720
taggattcta gttgttgtgc ccagagattg ggtcaccatt gtttttgaaa ataaaaataa 3780
aaataaaaag aacagcaggg catgtgtaca aatgcgaagt attgattaat gtggggagcg 3840
ggtgtggcgg cagtcctaaa ggcgccaggg actgcagcta agtcatatga cttgcacctg 3900
acttcctcat ataagacaca aacatcttga gtgctgcgca ggtgtaccag gatacaggtg 3960
aatccaattt gatggagatt tgcccctgct gccctgatta gctgaagctg cgtgcctggt 4020
gaggtggcgt ggcctgctgt gtgtggatgg gaactgagag tataaaagag tgagaggccc 4080
agggttcagg ggagatataa acaggggaga tataaaaaca agggagatat aaaaacaagg 4140
gagatataaa aacaagggag agatttaaac aggggagata taaacagggg agatataaac 4200
aagaagaaac aggactgaat aaacgtgtgc agaaggatcc tgtagcagcg tcgttcttcc 4260
tggccagttg agcgcgcgca agaagtggtg ctgaaacccg ggaaaagaaa catcttcagt 4320
cacgagcgaa gaccccctgc tacagggagg attcagaact gcatcacggg gaagaagggg 4380
ttaataaaag ttcccgtaaa acagactgtt gagaaggatc cggcgtggat tcagaactct 4440
tcagctgggg aacggtactg atgaagagaa agaagaaaga tgaagacgga ataaactgct 4500
gttagaagga ctggtggtca cgtcgttctt gctggtcgag agcaggcgcg acaattggtg 4560
gcccgtacgg ggaaccgact cccccaccaa gttcagaact ttcagcagtc agtggttgcc 4620
ggcaggcagg gtaagttcac ggtgagtgaa acttgcgacc ccaggagttt gggaaggacc 4680
tcggataaaa tagaggtgag cataaagttg ccaggaagta ggcacaaagt aacccaggag 4740
tttgggaagg accttggata aaatagaggc gaatataacg ttgccaggaa gcaggtacaa 4800
ggtaactaaa ggttcccggc tttgggacaa gttaaggttc cctgtttggg gacaagttaa 4860
ggaactatga taacctcagt gtagtgatca atagatcctc gctgtgtagt tatgcttttt 4920
tctcccattg accctttgtg ggtaggtctg atagttttgg tcttgtttgt tctgatatat 4980
ggactctgtt actgtttgaa actgtgtgta gaggcagtca agacaggtca gaaaatcctt 5040
acagagcaac aagaaagtat gttggaaaag aagggcttaa aaagaaaaaa gaaaaagaaa 5100
ggagacacag tgttatcagg tggacagaaa ggacaaaaca aaagagccga ggtggaggag 5160
gaaggcgaat tagcttttgt gccgcctccc tatgcctcct cagcagccac ctgtaggtgg 5220
accttctgtc cggagatttg gagaggatca accagattca gtgttgatgt gggcgagagg 5280
gtctgtttgt gtgtttccac aggaccagac ggaacct 5317
<210> 5
<211> 8041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggaacgtg aagaaaaaat aattttagtg tcatctgcaa atgaaattga tgttcgtccc 60
tgtcctctta acccaaatga acacaaaggc actataactt ggtataaaga tgacagcaag 120
acacctgtat ctacagaaca agcctccagg attcatcaac acaaagagaa actttggttt 180
gttcctgcta aggtggagga ttcaggacat tactattgcg tggtaaggta agagaggaat 240
tagtatgtta caaacatgtt ctagtttcct gcagttgtta aggacagaaa tacttttaat 300
aatgcttaac ttacctattt tattttattt tagaaattca tcttactgcc tcagaattaa 360
aataagtgca aaatttgtgg agaatgagcc taacttatgt tataatgcac aagccatatt 420
taagcagaaa ctacccgttg caggagacgg aggacttgtg tgcccttata tggagttttt 480
taaaaatgaa aataatgagt tacctaaatt acagtggtat aaggtaattt tattttaaat 540
atgacatttc acttttccag aaaataaaat agttccctgg acaatagaat gtatctgcaa 600
agtacctttt tattttgtat attgttttct ctttaatggt gaaacttgat agggaaccta 660
aaaagaattg taagactgca ttcacttaat ttgaagctta actagaaatt tgtttgctgt 720
tgtttttatt taatttaata agatgtaatt gagaaaagta ctagaaatag atgtttaaag 780
agaaggctga ttataagctt aaggtattga agatgtaact atttattaca aaacatacta 840
tgtgtgtttt attgaagata tggtcttcaa ataacctgct agtttccata actgtctgaa 900
aagtgggttg actagctttc catggaacac cccatgtttt ggtaacttta atctacctag 960
tctgatggaa cttaaatggg gaatcatctt gtagagctta agacgtacta aatacgtaat 1020
atcaatgaag tgcagtattg ttaagaaact atatagtgtt aacatttttt tcaaacatgt 1080
ttttcttgca aaataaattg gccttcactt catagtacaa gtctcataga cttgaaaact 1140
taatgtcata ggaatatagt taactgtttc caaaaagcca gtattaaaac ttactatatg 1200
taaggaactt ttccagtcac tttctaaaaa tataacattt gctaaggtga aaaaaatgga 1260
gctcctttgg cggtagattg gggaaagtta ttggttattg gttttcaatg cttctctctc 1320
cctttatcta ggattgcaaa cctctacttc ttgacaatat acactttagt ggagtcaaag 1380
ataggctcat cgtgatgaat gtggctgaaa agcatagagg gaactatact tgtcatgcat 1440
cctacacata cttgggcaag caatatccta ttacccgggt aatagaattt attactctag 1500
gtgagtcata gctccagccc taaaaggttt agatctggga aggtccagag actgtgattc 1560
taatactact ttcattatcc atgaagaaac caaatccaag acgacctcaa tgataccaca 1620
aaagtcacat ggctttagtt ttgttttttt gttactaaat actatgtaat gtttttccat 1680
tcctgcttca gatgtagttc taattaaata gagacattat gagctgtgtt ttccaactga 1740
tttaagaggg ttgttctttg gcatggctaa aaatggttct tactgaaagc tctggggctc 1800
cctctggctg gtatatggga atgttctgag agcctgcacc tggggaatct cagtgagtgt 1860
cagtgtctag cagcaagcat cggtgtggac actaatgagc tttggaataa gtcacatttc 1920
cagaatctac ctcctgttca ttctgtgtta ggtgttaacc tctctaaccc tgtttcctct 1980
tctgtaacaa gatgatgcaa tctcccaagg ttattgggaa gattagagat atggggtaca 2040
cgaaacttgt gtacctggtg caaagaaatg cttggtgcaa aacagctatg caattaatag 2100
gtgtaggatg attgttcttg ttaattttct tgtgtctttc aattctgcgt taaccatgtt 2160
tcatattgaa aactatatca cagcaaaatg aaacaaaatg cacaaattgc caggggatag 2220
tcagaatgct caaacttttt gtaaatattg agattttgta agatttatgt aataaaataa 2280
gagttattcc aatcagaact tttttgcagg ttataggggt gactattagt agttatgctg 2340
ggacaacagg tataaattgg gactatccca agcaaactca gaatatgatc accctataaa 2400
tagcttcact tttccagtta tataatactt tattttccta aaaatatttt tattaaataa 2460
aagttaattc cttgccatgg tcccacaggc atcagtgaat cccaattttc aatggtcttt 2520
gtatcaaacc atgttcttga gtttttagca gcctgtcatt gggtagctct ggtctgtctt 2580
tcctgaaaca tagtaaccta accagcaagt agaacttgag agagaactgg gcactgggga 2640
ctatttaagc taggttaagt gttttttttt tttttttttt ttttgagatg gagtctcgct 2700
ctgtcaccca ggctggagtg cagtggtgcg atctccgctc actgcaagct ctgcctcccg 2760
ggttcatgcc attcttctgc ctcagcctcc cgagtagctg gaactacagg cgcccgccac 2820
cacgcccggc taattttttt gtatttttag tagagatggg gtttcaccgt gttagccagg 2880
atggtctcga tctcctgacc tcgtgatccg cccacctctg cctccttaag tgctgggatt 2940
acaggtgtga gccaccgcgc ccggccaggt taagtgtgtt tttgatattc tctgtttcct 3000
tttctgatcc catttgtaga aacaatatac tctactcgga gtgaggtaat attttgtttt 3060
ctttccaagg cccacaccaa tgatgcctag cactttttgt tcactcaagg attcaaaaat 3120
atttattgag catttactat gtttcaggaa ctgtaatagg tatacattag ggaaaaaaac 3180
agagaatatc ctaccttcat ggtgttcact ttttttttga ttgggggaat accgagtgct 3240
caattttata gtttctcata gtttcttcat ggccacagat aaacccctga aaccaatctt 3300
ttcataaata agtcagatta atttctgggg cttcttgata cttttttgcc tattttaata 3360
aattacagca ttattccata accctgtagt tctcactatt gggtcattaa cacagtcatt 3420
aaatgcaagc aggtctagta ttgactagcc cttctggcca ataacaccca attcaaggaa 3480
gtgactttcc actactctcg cctttgctga catgctttca cttaagagag gcatttgtct 3540
ggggacccag ggtcctggtg atgtgtgtgt ttttcagtag caccccactc tatgaattcg 3600
gaaggtctag ctctaccccg ggattcacag tgtgctgtgg cctctgcctc agctttcttc 3660
cttcactttc tgcctcctgt ctcctggcat atgtgctttg aacacttgat ggaatatctg 3720
gccagaagtc atttagtatg ttttgctaag tgttgtcgtc acttgagatt ctgatctata 3780
agagactgac aaaccttatg gatgtttttc tttcagagga aaacaaaccc acaaggcctg 3840
tgattgtgag cccagctaat gagacaatgg aagtagactt gggtaagtgg gcttcagtga 3900
gggtatgctg gaatcggttt ttttttttta aaacataaga gtaagataaa ttgtatcttt 3960
actatatata atctaagcca tttactgtat aaatctatca atggagggaa agtgagacaa 4020
attatatctt aattttttgt atttcttgcc tctatggcaa acatcttgcc atgtctgata 4080
tctccagccc tacttttctg tgaacactta ttaccatgaa aacaccaacc agacaccaag 4140
gtcaaaaggc ctaggaacca gcaatgccat tgactggtac aggattggat ttctttcttt 4200
tttttttttt cacagagtta aaatatttaa tgacaaaaat agggtttgct gtaaaagtga 4260
atcaatacag taggtgttac ttatctctga attaaacaaa aattatattt gacatcttaa 4320
agaacttctg aagaattgat cattgtacga cagacatcag cagtgttaca atttcaggac 4380
tggatttctc atgaccagat ccaagctttg agtcggaaga gtaaggctac aggccccaaa 4440
gatggtagtc attctagaaa agtatttttc caagttagtg aacatttttt attcaagagt 4500
aaagaaagaa ccccacaagc atctagctct gcactgttta gtgcagtagt tactaggcgc 4560
atggagttat ggacatgtac aattaaatta agtcaattga ttcatttagt taaattaaaa 4620
attagttcct ctgtcacatt agccatattt caagggctta atagccacat gtgacaagtg 4680
actactgtac agacaagcac aaatatagaa catttccaac atcactgaaa gttctattgg 4740
aaaccactga tcaagagaga aaaagtggtt ctttgtgtca gaggacccaa aataggttgg 4800
ccttggaatt gtcctctgta atagtaactg catgacagca gtcaagaacc atacagaggt 4860
tagaaggtat atgcttgtga tctgtgaatt ctgtacttgg ccaattctgt acttgttatt 4920
tatggtggaa ggtggtagaa agacattctt agacagaaac aaaaatgtca aaactcaaaa 4980
ttaaatatgg gccaataggc tctagaacaa tgtttctcaa ccatcttttt ttgttttaaa 5040
ttgttcccct ttagagtcta aaaagtcttc ttccacctaa ttctctttcc tgtctttaaa 5100
tttcagtacc acagttatct tttatatttg ctgatatact gtggcccttt ggagtaccac 5160
aaaccatgta atatctaagg ttttcttgcc tcttccccaa gaaccagttt ttgccctgct 5220
ggccacagcc cctgttgaaa atgcctgccc tagaagtgtg taattgagag ctctgatgcc 5280
taggctgcat tgatctctca atctacaaaa aaaagcttca aattaggaaa taattatttt 5340
aatgtattat attgacagtg gatcagaagc atatagtacc ctgtcatagg attatcctga 5400
agggtgttaa acaggcaata agatccaata ccattactcc taaaatgact tagaaaaata 5460
gggattgaga gatatttcct taacttaata aataacatca gtgcaagcca atagtcacta 5520
atattcttca tggtgaaata ctatagacct tctcactaaa gccaagagca agacaaagat 5580
gcccatgtaa ccactattac tgagcacagt ctagaagtgc ctactaatgc aattgaagga 5640
aaaaaacaag gtatgcttac cacaagggaa aaaagacatt tttattattg tttcctgatc 5700
ataccaatcc caagaaaatt cccgggaaaa actagaatta attctgtata aattagtcag 5760
ataataaatt aacatttaga attaatgttc taaaatataa gacttgttta gcaataacca 5820
gctagaaaac ataataggaa acaaatgcca tttgcaccag taaatgtctt agaagtgtcc 5880
ataaaatatg ttagaaaaac tttgaaaata tgtggaattt ataagagagg aaaaaactaa 5940
aaaaaccaaa accctgaata ttaatctcag aaaaactgaa atttaaagca tgcatccagc 6000
caggcgtggt ggctcaagcc tgtaattcca gcactttggt aggccaaggt ggacagatca 6060
cttgaggcca ggtgtttgag accagcctgg ccaagatgtt gaaacaccat ctctactaaa 6120
aatacaaaaa ttagctgggt gtggtggtgc acacctgtag ttccagctgc tcaagaggct 6180
gaggcatgag agtcacttga acccaggagg agaaggttac agtgagccga gattgtgcca 6240
ctgcacttcc agcctgagtg acagagcgag actgtgtctc atttttaaaa atggaattaa 6300
ataatggata gagggataac agtttttaaa aaggaaggcc gatgagcacc aagctaatga 6360
aaagcatgtt gattcaccgt gaattcaaga aatgtagatg aaaacttaag tgacattttc 6420
ttctctcaaa aggcaatgtc taaccaaaaa cacttgttat ctggtggttt tggggaaaat 6480
cgtgctcaca tacactattg gagagagggt agactgacac agcctcacta aagagagggg 6540
gttagctttt aaaatatgtt tctttaattc aatcttgctt ctagatttta atacttcagg 6600
atgtgtacaa ataaggctat tcattaaaat attaatcata atagtgaaaa attaggaaat 6660
tgtgttcatc aataggaaat agttaatcat agtgtatatg tattatggaa tgctaagcag 6720
ccatgacaga gtctattttg gaagacaaat catgtgggcc caaattccca atccacagta 6780
attacaaaat agtaggcaaa aagaccccat ttcaaaaact gcacatgttc acagagaaga 6840
taaggaatga gacgcataag gttactaatg gtggttttct ctgggtggtg ggtttagggt 6900
aattttcctt tttctttgtg catttctata tctaaaattt taattcaata gccatttatt 6960
aatctagata gatcagaaaa aatcaattaa tgttaagatt aaaaatacat tctttgcagg 7020
atcccagata caattgatct gtaatgtcac cggccagttg agtgacattg cttactggaa 7080
gtggaatggg tcagtaattg atgaagatga cccagtgcta ggggaagact attacaggta 7140
tgtatgctaa gagttattca cattttggtg ttaaatccca cgtgatattt tatataacct 7200
tgtcggttca gtttaaaagc aagtgttagt tgctcctaac ctttgctgcc tttttttttt 7260
tttttttttt tttttgctaa gctaagtaga atttataaga tcttgtacat ttaaggtaaa 7320
aaatacttgt cattgtggtg caaattacag accacttaga agcctttctc ttacgttata 7380
catgttgcaa catttcaacg aagcaattat ctttcattat tcttcatatt cctcaagtag 7440
cttagaagag actcattaat gagctcaaga atcaggcaat ccactgctct cgaaagcctc 7500
tactggtttc ctactgctca tctatgggac aaggatctcc tggcttccca tgacctctcc 7560
ttcacaacac ctgcaaagca ctttgtcatc tgccccaatc tcctcttgtt tagtgtctcc 7620
tctgtgcccc atggagaaca caatgcattt gtctacattt ttcttcttgg aagtggtaat 7680
ttttttgctt tctctgctac tgagcctgtt actgacagtg gtcttggggt tataaaatct 7740
cagattagtg ttgccagcag tctgaatgtt gtgactgtga ttgggcaggg tgattatttc 7800
agtggcaatt ttgtcacaaa taaggaaata cacagggtat acaggtctta tttgtagttg 7860
atgcaattaa cttacacaag tttatttact ctctctctcg aatagtgtgg aaaatcctgc 7920
aaacaaaaga aggagtaccc tcatcacagt gcttaatata tcggaaattg aaagtagatt 7980
ttataaacat ccatttacct gttttgccaa gaatacacat ggtatagatg cagcatatat 8040
c 8041
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttttgccaag aatacacatg gtatagatgc agcatatatc cagttaatat acccaggtaa 60
gtatcaaagg cttacttaaa 80
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaaacaata ctaaagctga ctaagaaaag caggacatag aagcttgata tcgaattccg 60
aagttcctat tctctagaaa g 81
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ataggaactt catcagtcag gtacataatt aggtggatcc gaggagagag ttggaatctt 60
ctggatggag atagtgtgag t 81
<210> 9
<211> 4736
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtcgtct gactagaagt gagctgtctg tcattcttgt gcacgccagc ccagtaatca 60
tttggaggca aagcaaactg taagtaatgc tgtcctgggc tgacttgagg aggcagtttt 120
cgttttaaca gccagtgttt atttgctcag caaacgttgt ctcggggaga aatgtcgctg 180
gatgtcatca gagttcccag tgccccgaac cgtgaacaac acaaatggag aatatgaaag 240
tgctactggg gctcatttgt ctcatggtgc ctctgctgtc gctggagatt gacgtatgta 300
aggaacgtga agaaaaaata attttagtgt catctgcaaa tgaaattgat gttcgtccct 360
gtcctcttaa cccaaatgaa cacaaaggca ctataacttg gtataaagat gacagcaaga 420
cacctgtatc tacagaacaa gcctccagga ttcatcaaca caaagagaaa ctttggtttg 480
ttcctgctaa ggtggaggat tcaggacatt actattgcgt ggtaagaaat tcatcttact 540
gcctcagaat taaaataagt gcaaaatttg tggagaatga gcctaactta tgttataatg 600
cacaagccat atttaagcag aaactacccg ttgcaggaga cggaggactt gtgtgccctt 660
atatggagtt ttttaaaaat gaaaataatg agttacctaa attacagtgg tataaggatt 720
gcaaacctct acttcttgac aatatacact ttagtggagt caaagatagg ctcatcgtga 780
tgaatgtggc tgaaaagcat agagggaact atacttgtca tgcatcctac acatacttgg 840
gcaagcaata tcctattacc cgggtaatag aatttattac tctagaggaa aacaaaccca 900
caaggcctgt gattgtgagc ccagctaatg agacaatgga agtagacttg ggatcccaga 960
tacaattgat ctgtaatgtc accggccagt tgagtgacat tgcttactgg aagtggaatg 1020
ggtcagtaat tgatgaagat gacccagtgc taggggaaga ctattacagt gtggaaaatc 1080
ctgcaaacaa aagaaggagt accctcatca cagtgcttaa tatatcggaa attgaaagta 1140
gattttataa acatccattt acctgttttg ccaagaatac acatggtata gatgcagcat 1200
atatccagtt aatataccca gtccctgact tcaagaatta cctcatcggg ggctttatca 1260
tcctcacggc tacaattgta tgctgtgtgt gcatctataa agtcttcaag gttgacatag 1320
tgctttggta cagggactcc tgctctggtt ttcttccttc aaaagcttca gatggaaaga 1380
catacgatgc ctatattctt tatcccaaga ccctgggaga ggggtccttc tcagacttag 1440
atacttttgt ttttaaactg ttgcctgagg tcttggaggg acagtttgga tacaagctgt 1500
tcatttatgg aagggatgac tatgttggag aagataccat cgaggttact aatgaaaatg 1560
taaagaaaag caggaggctg attatcattc tagtgagaga tatgggaggc ttcagctggc 1620
tgggccagtc atctgaagag caaatagcca tatacaatgc tctcatccag gaaggaatta 1680
aaatcgtcct gcttgagttg gagaaaatcc aagactatga gaaaatgcca gattctattc 1740
agttcattaa gcagaaacac ggagtcattt gctggtcagg agactttcaa gaaagaccac 1800
agtctgcaaa gaccaggttc tggaaaaact taagatacca gatgccagcc caacggagat 1860
caccattgtc taaacaccgc ttactaaccc tggatcctgt gcgggacact aaggagaaac 1920
tgccggcagc aacacactta ccactcggct agcatggcaa aagtgggcag gccaagaact 1980
tcggaatatc tcccatcata agaggctgca gctgggctgt gcctcccagt aaaacagtca 2040
cgaaccaaac ctgtgcagtc ccttgttcca gatcacctgg aactggattg ggaagagaac 2100
aggacttggt ggccaggacc gctcagagag ccatggttgc tcagggatgc tgctccggga 2160
tgcttgacta acagtcgagg cagtgaactg ggtgtagaaa gcgtcaggaa atggccacat 2220
gtgtggatgg tttaattaga ttctgtggag tctcacagtg ggattgtggt tgtctgagga 2280
cactttgggg ggtcgctgtc caagaagtgg ctccccaaag tataagtgcg ggtgaggttt 2340
actgataccc cacagtggaa ggcatttctt ccagatattt tccagatacc ttggccgcca 2400
aacttcgttt tcaaacactg tgttttattg tgtagacctt gaaaaccacg gtttcagtga 2460
agaaggattc tgtagggttc actcttctgc agtcacttta gctttctgca gaagtctaga 2520
ttttaaatta actgtagaag gaagtcagac acccacaggt ttcttctaat caagcttcca 2580
ccctgcaatg gctgtcgtgc catcttcctt ctgtgtttta ctcggctcat tgcttctctg 2640
gagacaaatg caatgcttcc tacccccgtc ctgtcacagg cagtctgagg actcaccttc 2700
acacgtgaga cttcgctctt accccagccc ccaccgctgg aggggtttca atcccccacc 2760
ctggggctct tctgcgcaga agctgaagtc tacgctcctc ccaatctttg gtcccagtgc 2820
cgctgttcgc cttcctgctg gttgattgca gaaccacctc tgagacctct gtacctgctc 2880
ttggaatgtc tctgtctttg ccctgccgcc cacttcccgt gcctatgatt tgctctagca 2940
tttctgccac ctgacaagga gaggagcttg ctaaagttta aagtttattt caacgctaag 3000
atcccaacct tccgatctct gcctactctc agacttggcc agccctcttg cctgtcatcc 3060
caaccctgct gcttctctgt aaaaggttgt ttctttacta gcagaaatca gtctgcaggg 3120
aggggtagtg cgtgtatctc actgttttcc gtattgggaa cagatggtat agatttgcca 3180
aggcctttat tttaaagtgt tcttggaaaa tcgtatttaa atttgcaatt attctaattt 3240
gatatagaga gaaactgacc tatttaacaa atggactctc ttaattctac tggacccagg 3300
ccttgaactt tctggtttct gtctctgtgc tctgactttt tgatttcagg tctagccctg 3360
tgcacttacc tcagtactca gtacttactc agtactaact cagtactcgt gggaggacac 3420
ccgacccggg tgttctttga gaagcagctg agtgaggcat gttttgacag gaggaaccca 3480
gttcttttca ctgttggtat ttatagcacc taccttcaga tttttcagta tgatgtttct 3540
attttccaat actggttccc taacggtcaa catttcttct cccaactaaa aatgtaagaa 3600
gaaaaaaaaa tttttttctt tttctctttt tttttttttt tgtggtacag aagttttttg 3660
tttggttatt tgtttgtttg attttaacta gatgactgtc ttcagaataa tcctcacagt 3720
tctggaagat tgaaaaacca agttcacatg acaagaacaa acccggtttt aagggttgaa 3780
tgtaggggga taccattctg tcttttagac tttcaacatc tgctatggtg gagcacaaat 3840
gttatttaaa agcatcttct cacctacata gaagtaaaca aaacacacaa tttgggattt 3900
tgactcttca gttttgacct cacttctcct ggatccaacc tgacaggaga tgactggatt 3960
gctggggtag agaaggaaag gctgtccccg acagcagcca gaagtctgtg ggagtgaggt 4020
cattcctgac ccgtgatgct ttcaaggctt ggtttttctg ataattattt ttgcctgtca 4080
tcccaaaaac gtattgacat gcgtgtatat tacctgtgag tgagagttct tagaaacttg 4140
gccagagagg ataaagggga gagcagtgac agagaaccgc cgatcttgtg acaccggagt 4200
ctgaggtgga acagagccag tgtcaggaaa gcccctcagc aagaaagaag agtcattgct 4260
ggttcccagg ggcagtcaca gaggatgaaa taccacatca aggcagtggg aacttcctgc 4320
gacttctcct ggtcctcccc agaagtatct ggtgtcagct gaagaccatg tgtcccccaa 4380
tacttagatt tcaccgtact ttctgatggt gtttttaaaa ggccaagtgt tgcaaaagtt 4440
tgcacgtgca accgtatatt aatcgccagt gtttaaaact ggtttatcag aatttatatt 4500
tttgtctctc ctgccttttg aattttactt atgacagaga aagtattgag ccatgacttt 4560
ttaaaaataa tttatattta tactggtcaa taatgaaggt ttttttttat tattaaagaa 4620
cttgatttta taattctgca gcagatgcca aatgttatct atcacaaacc acaaaattta 4680
tgtacagtgc atattattga tcaataaact aaacttgttt tccaataaat tgttaa 4736
<210> 10
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Glu Asn Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ile Cys Leu Met Val Pro
1 5 1015
Leu Leu Ser Leu Glu Ile Asp Val Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile
202530
Ile Leu Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu
354045
Asn Pro Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser
505560
Lys Thr Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys
65707580
Glu Lys Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr
859095
Tyr Cys Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser
100 105 110
Ala Lys Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala
115 120 125
Ile Phe Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys
130 135 140
Pro Tyr Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu
145 150 155 160
Gln Trp Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe
165 170 175
Ser Gly Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His
180 185 190
Arg Gly Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln
195 200 205
Tyr Pro Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys
210 215 220
Pro Thr Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val
225 230 235 240
Asp Leu Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp
260 265 270
Asp Pro Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn
275 280 285
Lys Arg Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu
290 295 300
Ser Arg Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His
305 310 315 320
Gly Ile Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Pro Asp Phe
325 330 335
Lys Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Phe Ile Ile Leu Thr Ala Thr Ile Val
340 345 350
Cys Cys Val Cys Ile Tyr Lys Val Phe Lys Val Asp Ile Val Leu Trp
355 360 365
Tyr Arg Asp Ser Cys Ser Gly Phe Leu Pro Ser Lys Ala Ser Asp Gly
370 375 380
Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Gly Glu Gly
385 390 395 400
Ser Phe Ser Asp Leu Asp Thr Phe Val Phe Lys Leu Leu Pro Glu Val
405 410 415
Leu Glu Gly Gln Phe Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp
420 425 430
Tyr Val Gly Glu Asp Thr Ile Glu Val Thr Asn Glu Asn Val Lys Lys
435 440 445
Ser Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Asp Met Gly Gly Phe Ser
450 455 460
Trp Leu Gly Gln Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Ile Tyr Asn Ala Leu
465 470 475 480
Ile Gln Glu Gly Ile Lys Ile Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln
485 490 495
Asp Tyr Glu Lys Met Pro Asp Ser Ile Gln Phe Ile Lys Gln Lys His
500 505 510
Gly Val Ile Cys Trp Ser Gly Asp Phe Gln Glu Arg Pro Gln Ser Ala
515 520 525
Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Leu Arg Tyr Gln Met Pro Ala Gln Arg
530 535 540
Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu Thr Leu Asp Pro Val Arg
545 550 555 560
Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala Thr His Leu Pro Leu Gly
565 570 575
<210> 11
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gattgaccac ttccactcgt tgtg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcagatacat tctattgtcc aggg 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgcacgtc tgccgcgctg ttc 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacgtcatgt cgagctggta tcgg 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccatcccatc cctcctcctc tgttt 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaagcaggca gtggcaacag tgaca 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccctggttgc tacccatatc ttggc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccagagcagg agtccctgta ccaaa 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatcggcca ttgaacaaga t 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagaagaact cgtcaagaag gc 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cacatggcag gagctggtgt cttta 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgctgtaaca caagccaggg tcatt 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgaatcctgg aggcttgttc tgtag 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
actggggctc atttgtctca tggtg 25
<210> 25
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attaagcact gtgatgaggg tactcc 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagacacctg tatctacaga acaagc 26
<210> 27
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tatttgctct tcagatgact ggccc 25
<210> 28
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcttcttcgg agtaaaagat aaactgttg 29
<210> 29
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggaagaaaac cagagcagga gtccc 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
actggggctc atttgtctca tggtg 25
<210> 31
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccggaacgta taggacatac ggcata 26
<210> 32
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
