一种改善鱼肠道病理损伤的制剂
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种改善鱼肠道病理损伤的制剂。
背景技术
组胺作为一种重要的炎症因子，与机体免疫、炎症抵抗等生理活动密切相关。水产饲料中富含组氨酸的动物性原料(如鱼粉)，在生产和储藏过程中易受到产组氨酸脱羧酶细菌(如摩根氏变形杆菌、组胺无色杆菌、埃希氏大肠杆菌、链球菌、葡萄糖球菌等)的污染，使游离组氨酸发生脱羧反应生成组胺。组胺作为生理毒性最强的一种生物胺，通过和特定组胺受体结合，可对水产动物肠道健康造成严重危害。肠道不仅是机体重要的消化吸收器官，同时也是体内最大的免疫器官，是机体防御的第一道屏障，因此肠道健康很大程度上也决定着养殖动物机体的健康状况及生理活动的正常运转。研究表明，组胺会引起鱼肠道黏膜通透性增加，免疫屏障功能降低。饲料中高浓度组胺会引起养殖鱼类的肠道损伤，包括肠绒毛高度降低、数目减少，肠固有层出血和炎症细胞浸润等等。肠黏膜形态结构的完整性被破坏，一方面使得肠道通透性增加，组胺更容易进入鱼体中，引起组织器官损伤;另一方面养殖环境中病原菌也更易侵入，未被完全消化的食物残渣经肠道病原菌的发酵，产生更多的胺类物质，也会进一步损害鱼体健康。除此，鱼肠道的损伤往往会使机体营养物质的吸收受阻，进而影响鱼体营养代谢和抗病能力。
山竹提取物，富含大量的氧杂蒽酮类化合物，其中尤以α-倒捻子素(α-mangostin)含量最为丰富。甜菊叶又名斑鸠菊，其叶的提取物通常被用作甜味剂。
发明内容
本发明针对现有技术中高浓度组胺饲料会引起养殖鱼类的肠道损伤的问题，提供一种对组胺引起的养殖鱼类肠道损伤有显著修复效果的改善鱼肠道病理损伤的制剂。
本发明的第一个目的是提供一种改善鱼肠道病理损伤的制剂，其包含有效量的山竹提取物和甜菊叶提取物。
优选，所述的制剂，按重量份计，由1份山竹提取物和3份甜菊叶提取物组成。
本发明的第二个目的是提供一种改善鱼肠道病理损伤的制剂的制备方法，包括以下步骤：
将山竹提取物、甜菊叶提取物粉碎后过60目筛，按重量份计，将1份山竹提取物和3份甜菊叶提取物混匀，得到改善鱼肠道病理损伤的制剂。
本发明制剂制备方法简单、易行。
本发明的第三个目的是提供所述的改善鱼肠道病理损伤的制剂在水产养殖中的应用。
优选，所述的应用，是在鱼类养殖中的应用。
优选，所述的应用，按饲料重量1‰-3‰的比例向饲料中添加所述的改善鱼肠道病理损伤的制剂。
优选，所述的鱼类为黄颡鱼或黄鳝。
将本发明的改善鱼肠道病理损伤的制剂按比例加入饲料中或者拌料使用，均对养殖动物损伤的肠道有显著修复、改善作用，且对水产动物生产性能无不良影响。本发明还提供该制剂在饲料中添加的参考剂量或拌料使用量。在饲料中按1‰比例添加该制剂，可显著修复组胺引起的黄颡鱼肠道损伤;按3‰比例拌喂该制剂可显著改善冰鲜鱼(组胺含量2626.5mg/kg，GB/T 5009.45-2003/4.4)饲喂黄鳝肠道健康状况。本发明的制剂可按1‰比例和饲料中其他原料逐级混均，制成颗粒饲料，也可与搅碎后的冰鲜鱼鱼泥或商品饲料等拌料投喂使用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明制剂是在全面系统的研究基础上形成，具有广泛的实验基础和科学依据，养殖实践中修复有毒有害物质(如组胺)引起的鱼肠道损伤效果显著;
2.制备该制剂用提取物的制备原材料来源广泛，采购便易、易获取，成本低廉;
3.该制剂制备操作简单，无需特殊仪器设备;
4.该制剂使用方式简单易行，适用性强，且使用后无残留，对环境友好。
附图说明
图1是不同配方饲料对黄颡鱼肝脏损伤修复的影响;C组饲喂基础饲料C，H组饲喂含高浓度组胺的饲料H，HM组饲喂在饲料H配方中添加1‰山竹提取物的饲料，HSE组饲喂在饲料H配方中添加1‰甜叶菊提取物的饲料，HD组饲喂在饲料H中添加1‰(重量比)改善鱼肠道病理损伤的制剂的饲料HD，具体饲料组分见表2(下同);
图2是改善鱼肠道病理损伤的制剂对黄颡鱼血清及肝脏生化指标的影响;
图3是改善鱼肠道病理损伤的制剂对黄颡鱼肠道组织显微结构的影响;
图4是改善鱼肠道病理损伤的制剂对黄颡鱼肠道中炎症因子过表达量的影响;
图5是改善鱼肠道病理损伤的制剂对黄颡鱼感染裂头病感染率的影响;
图6是改善鱼肠道病理损伤的制剂在冰鲜鱼养殖黄鳝中的应用效果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中所用的山竹提取物购买自成都市三禾田生物技术有限公司，主要组成成分为α-倒捻子素，其含量≥90%，为淡黄色，具有山竹特有的香味。以下实施例中所用的甜菊叶提取物购买自成都市三禾田生物技术有限公司，主要组成成分为莱鲍迪苷A，其含量≥98%)为白色粉末，具有甜菊叶特有的气味。
以下实施例中所用的改善鱼肠道病理损伤的制剂，其按以下方法制备得到：
将山竹提取物、甜菊叶提取物粉碎后过60目筛，按质量比为1：3比例混匀制得，装袋，密封、干燥保存。
本发明的改善鱼肠道病理损伤的制剂，山竹提取物和甜叶菊提取物按1：3比例混合，是基于实验结果：
在实施例饲料H配方中添加1‰山竹提取物对组胺引起的黄颡鱼肝脏充血、肠道损伤均有显著修复效果(图1.HM组);饲料H配方中添加1‰甜叶菊提取物对组胺引起的黄颡鱼肠道损伤修复效果显著，但对组胺引起的肝脏充血修复效果不显著(图1.HSE组);饲料H配方中添加1‰山竹提取物和甜叶菊提取物混合物(质量比1:3)，对组胺引起黄颡鱼的肝肠损伤均有一定程度的修复效果(图1.HD组)。同时考虑到市售山竹提取物(含量≥90%规格产品)约8000元/公斤，甜叶菊提取物(含量≥98%规格产品)约700元/公斤，甜叶菊价格远低于山竹提取物。本发明采用山竹提取物和甜叶菊提取物1：3比例混匀，制备得一种改善鱼肠道病理损伤的制剂，以期在较高性价比的前提下，改善肠道病理损伤的同时，兼顾可能的肝脏病理损伤修复效果。
实施例1：
实验以白鱼粉(组胺含量107.6mg/kg)和豆粕为主要蛋白源，制成黄颡鱼实验鱼用基础饲料C，在基础饲料C中添加1000mg/kg的外源组胺，制成含高浓度组胺的饲料H，并用饲料H饲喂实验鱼30天，建立实验鱼肠道损伤模型(饲料C、饲料H详细的配方组成见表1，其中饲料营养组成成分分析按照GB/T-5009的系列方法进行，组胺含量测定按GB/T 5009.45-2003/4.4方法进行)。实验鱼病理损伤模型建立成功与否的评判方法为：H组实验鱼中有≥80%的样本(肠道)出现明显病理损伤和肠道损伤指示酶的活力出现显著变化。
表1建立实验鱼肠道损伤模型饲料配方及营养组成
病理损伤模型成功建立后，从饲喂饲料H的黄颡鱼中挑选活力、规格相近的实验鱼，分批次分配至6个玻璃纤维缸中，使最终各试验缸中鱼体总重相近，每缸35尾(初始鱼重35.41±0.22g)。6个玻璃纤维缸随机分为2组，分别饲喂含高浓度组胺的饲料H(H组)或在饲料H中添加1‰(重量比)改善鱼肠道病理损伤的制剂的饲料HD(HD组)。从饲喂基础饲料C的实验鱼中挑选健康、规格相近的实验鱼105尾，平均分配至3个实验缸中，投喂基础饲料C，作为阳性对照(C组)。详细的饲料配方及营养组成见表2。养殖试验周期为56天，每天投喂2次(9:00和15:30)，日投喂量为鱼体总重的3%。养殖试验在广东省微生物研究所养殖实验室进行。实验采用静水、非循环养殖系统，养殖缸中有效水体约为缸体积的3/4。整个试验周期水温为23-30℃，pH为7.2-7.8，溶氧>6.0mg/L，光照(12h光照，12h黑暗)。每次投喂前5min停水、停气，人工少量多次投喂，以确保投到缸中饲料被完全摄食。投喂结束2h后用虹吸法对缸底进行吸污。每两周进行一次鱼体称重，调整日投喂量，称重前一天禁食。
表2饲料C、H、HD配方及营养组成
为期56天的养殖实验结束后，将各缸实验鱼分别称重、取样，实验鱼增重率(WG,g/尾)、饲料系数[FCR,g/(g增重)]、特定生长率(SGR,%/d)、肝体比(HSI,%)、肥满度(CF,g/cm3)的计算公式分别为：
WG(%)=100×(FBW-IBW)/IBW;
SGR(%/d)=100×[ln(FBW)-ln(IBW)]×d-1;
FCR=FI/(FBW-IBW);
HSI(%)=100×WL/FBW;
CF=100×FBW/L3。
注：FBW为实验鱼终末体重(g);IBW为实验鱼初始体重(g);FI为试验期间每条鱼的摄食量(g);d为试验天数;L为试验鱼的体长(cm);WL为对应试验鱼肝脏的重量(g)。
表3结果显示，各组饲料对实验鱼鱼体增重率(WG，%)、特定生长率(SGR)、饲料系数差异不显著(P>0.05)，实验结束时增重率为102%～109%，饲料系数为1.27～1.42。各实验组黄颡鱼的形态学指标HSI(肝体比)和CF(肥满度)差异不显著(P>0.05)。
表3饲料中添加改善鱼肠道病理损伤的制剂对实验鱼生长性状及形态指标的影响
实施例2：
按照实施例1的实验设计，进行56天的养殖实验，实验结束时，禁食1d，用MS-222对试验鱼进行轻微麻醉，每缸取5条鱼尾静脉抽血。采集的血液置于盛有冰块的泡沫盒中，待完全凝固后，4000g离心10min(4℃)，制备得到的血清样品于液氮中暂存，-80℃保存至分析。
血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及二胺氧化酶(DAO)活力等生化指标，购买南京建成生物工程研究所试剂盒，使用Thermo全波长酶标仪测定。各饲料组对实验鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及二胺氧化酶(DAO)活力的影响见图2。结果显示，H组血清谷丙转氨酶(ALT)活力值为13.85U/L，显著高于C组血清谷丙转氨酶(ALT)活力(2.87U/L)(P<0.05);HD组谷丙转氨酶(ALT)活力显著低于H组，且与C组(对照组)无差异。各饲料处理组间黄颡鱼血清谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)有相同的变化趋势，即H组血清谷草转氨酶(AST)活力(365.5U/L)显著高于C组(97.33U/L)(P<0.05)，HD组谷草转氨酶(AST)活力显著低于H组(P<0.05)，且与C组对照组无差异(P>0.05)。H组血清二胺氧化酶(DAO)活力(8.85U/L)显著高于C组(3.36U/L)(P<0.05)。HD组二胺氧化酶(DAO)活力显著低于H组(P<0.05)。
实施例3：
按照实施例1的实验设计，采集56天养殖实验的实验鱼肠道组织样品(每缸5条鱼)，于中性福尔马林中固定48h。样品经酒精梯度脱水、二甲苯透明及石蜡包埋后切片，切片厚度为4μm。切片经二甲苯脱蜡、苏木精-伊红染色及中性树胶封片后，光学显微镜下(型号：OLYMPS CX31)观察，采集图像。
图3为HE染色后观察到的黄颡鱼肠道组织的显微结构。显微观察结果显示，C组前肠肠道组织褶皱排列紧密，细胞组织结构正常，上皮细胞排列整齐，微绒毛层相对齐整，核上空泡的大小相对均一;H组前肠肠道褶皱数目相对稀疏，中央乳糜结构弥散，但尚未形成脱落。H组中、后肠道褶皱数目显著减少。而HD组较C组肠道组织结构无显著差异，表明在饲料中添加改善鱼肠道病理损伤的制剂对黄颡鱼肠道损伤有显著修复效果。
实施例4：
按照实施例1的实验设计，采集56天养殖实验的实验鱼肠粘膜样品，提取RNA(Trizol法)，反转录为cDNA后，q-PCR结果显示，在饲料中添加改善鱼肠道病理损伤的制剂可以显著降低组胺引起的黄颡鱼肠道炎症因子表达，结果见图4。饲料中添加改善鱼肠道病理损伤的制剂的HD组黄颡鱼肠道促炎因子TNF、IL-1β和IL-6表达量，较H组显著降低;而HD组肠道抗炎因子IL-10的表达量较H组显著升高，表明在饲料中添加改善鱼肠道病理损伤的制剂可以显著改善组胺引起的黄颡鱼肠道炎症反应。
实施例5：
按照实施例1，采集56天养殖试验鱼样品后，通过升温系统将养殖水温升至30℃(不进行换水处理)，对每缸剩余实验鱼饥饿处理，3周后发现H组约40%(11/25，表示25尾鱼中有11尾出现裂头现象，下同)的实验鱼爆发裂头病(图5)，C组8%(2/25)的实验鱼爆发裂头病，HD组无实验鱼感染裂头病。
实施例6：
实验以黄鳝为养殖对象，设计两组实验，一组饲喂冰鲜鱼(记为FH组，组胺含量2626.5mg/kg，GB/T 5009.45-2003/4.4)，另一组饲喂冰鲜鱼同时按投喂量的3‰(重量比)拌喂(记为FHD组)。改善鱼肠道病理损伤的制剂。饲喂1个月后，每组随机采集10尾黄鳝，制备石蜡病理切片，HE染色后发现：摄食组胺含量较高冰鲜鱼黄鳝肠壁变薄，绒毛变短，出现异常增生，黏膜层有较多炎症细胞浸润(图6，黑色箭头)，摄食拌有3‰改善鱼肠道损伤的制剂的冰鲜鱼的黄鳝肠壁较厚，绒毛形态完整，炎症细胞浸润显著减少。
