家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用

　　家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种家蚕丝心蛋白重链表达系统(N端仅含信号 肽，C端含截短LBS)，还涉及该系统的制备方法和应用。

　　背景技术

　　家蚕茧丝的主要组成是丝素(fibroin)和丝胶(sericin)两种蛋白，其中丝素是茧丝的主 要成分，约占茧丝重的82%。丝素由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺(MSG) 细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺(ASG)被榨丝后而吐丝结茧。丝素 由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例 (H-chain：L-chain：fhx=6：6：1)形成丝素基本单元，然后丝素基本单位被分泌到丝腺腔。 其中丝素基本单位由6个通过二硫键结合的重链、轻链(H-L)二聚体和1个P25糖蛋白分子组成。H-L二聚体在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之间形成二硫键。一个P25糖蛋 白和六个H-L二聚体通过与重链的N端结构域(NTD)的非共价相互作用在内质网上形成丝 素基本单元。在丝素基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92%，并且是茧丝具有优良机械性能的原因所在，而轻链蛋白只占约7%，fhx约占1%。而丝素重链是由中间的12个结晶区域、11个非结晶区域和两端保守亲水的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)组成。

　　自从家蚕基因组框架图由中国家蚕基因组计划研究小组领导的率先完成后，它不但确立 了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的 契机。功能基因组时期的主要工作包括：主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子 机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕的丝腺能 在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白 一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。而目前对于成丝机理的研究仍有很多细节 需要科研工作者去解析，特别是在茧丝中占比最大且主要负责蚕丝机械性能的丝素重链其各 元件在丝形成过程中发挥着怎样的作用更加需要进一步探究。

　　利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成 功，而经过科研工作者的努力，我们也建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术， 为本研究的工作开展打下了良好的基础。在利用转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因 技术的研究报道中，有关利用家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含截短LBS) 表达外源蛋白的方法未见报道，这也将进一步探究了丝素重链元件N、C端的作用，为蚕丝 成丝机理的研究提供实验及理论基础。

　　发明内容

　　有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕丝心蛋白重链表达系统;本发明的目的 之二在于提供含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体;本发明的目的之三在于提供 所述重组载体的制备方法;本发明的目的之四在于提供所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所 述重组载体在表达目的蛋白中的应用。

　　为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

　　1、家蚕丝心蛋白重链表达系统，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框， 所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s);3’端为截短轻链结合位点LBS (s);所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)的核苷酸如SEQ ID NO.1所示;所述截 短轻链结合位点LBS(s)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

　　2、含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。

　　优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框通过BamHⅠ和HindⅢ 酶切位点连入pSLfa1180fa载体而得。

　　优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf] 载体的AscⅠ和FseⅠ酶切位点处。

　　3、所述重组载体的制备方法，所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载 体的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点处而得。

　　优选的，所述重组载体的制备方法如下：先将截短轻链结合位点LBS(s)通过BamHI和SalI 酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-LBS(s)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连入 pSL-LBS(s)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P (s)通过BamHI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统 pSL-LBS(s)-目的基因-Fib-H P(s)。

　　优选的，所述重组载体的制备方法如下：将所获得的重组载体利用限制性酶AscⅠ和Fse Ⅰ插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。

　　优选的，所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P(s)由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4 为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。

　　优选的，所述截短轻链结合位点LBS(s)由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物， 含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。

　　4、所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝素层表达目的蛋白中的应用。

　　本发明的有益效果在于：首次开发和利用了家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C 端含LBS(s))，将其用于表达目的蛋白，通过对转基因家蚕的鉴定及检测分析，获得与家蚕丝 素重链表达系统在丝腺及茧丝的丝素层表达，表明在C端截短后并不影响目的蛋白的表达及 分泌。通过丝素N端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用 的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。

　　附图说明

　　为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

　　图1为转基因载体结构图(A：含有多克隆位点的穿梭载体pSLfa1180fa;B：piggyBac 衍生载体pBac[3×P3DsRedaf];C：获得的最终注射载体pBac[3× P3-DsRed-SV40-LBS(s)-EGFP-Fib-H P(s)])

　　图2为获得的转基因家蚕荧光筛选(A：野生型和转基因家蚕复眼在白光和红色荧光下 观察结果，a为野生型白光，b为野生型红色荧光，c为转基因家蚕白光，d为转基因家蚕红 光;B：野生型和转基因家蚕蚕茧在白光和绿色荧光下观察，a为野生型白光，b为转基因家 蚕白光，c为野生型绿色荧光，d为转基因家蚕绿色荧光;WT：野生型;TS-H-GC：转基因 家蚕;White light：白光;RFP-fluorescent：红色荧光;GFP-fluorescent：绿色荧光;GFPstd： 绿色荧光蛋白标品)。

　　图3为目的基因EGFP的SDS-PAGE电泳图及Western blotting图(A：SDS-PAGE电泳;B：Western blotting图)。

　　图4为五龄家蚕2天丝腺整体荧光图(a：野生型丝腺白光图;b：转基因丝腺白光图;c： 野生型丝腺绿色荧光图;d：转基因丝腺绿色荧光图;e：转基因丝腺绿色荧光放大图)。

　　图5为五龄五天丝腺及茧丝冷冻切片图(A：丝腺冷冻切片图;a为野生型丝腺白光图; b为转基因丝腺白光图;c为野生型丝腺绿色荧光图;d为转基因丝腺绿色荧光图;B：茧丝 冷冻切片图;a为野生型丝腺白光图;b为转基因丝腺白光图;c为野生型丝腺绿色荧光图;d 为转基因丝腺绿色荧光图)。

　　具体实施方式

　　下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

　　本发明将家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，构建了一个在 家蚕丝腺中特异表达的家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含LBS(s))，N端序列 长度为1929bp，其核酸序列是(SEQ ID NO.1)：

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　　LBS(s)序列长度222bp，其核酸序列是(SEQ ID NO.2)：

　　tgtggaattcctagaagacaactagttgttaaattcagagcactgccttgtgtgaattgctaatttttaatataaaataacccttgtttcttacttcgtcct ggatacatctatgttttttttttcgttaataaatgagagcatttaagttattgtttttaattacttttttttagaaaacagatttcggattttttgtatgcattttatttgaatgtacta

　　本发明实施例将利用家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含LBS(s))表达外 源蛋白。

　　实施例1、载体的构建

　　利用前期获得的piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf](Aichun zhao.et al2010)作为 注射转座子载体，重组pBac[3×P3DsRedaf]注射转座子载体是利用pSLfa1180fa克隆穿梭载 体采用两步克隆法构建的，首先，复杂的构建都在含有所有可能识别6个碱基的限制性内切 酶的多克隆位点的pSLfa1180fa克隆穿梭载体中完成，然后，将构建好的重组pSLfa1180fa克 隆穿梭载体用识别10个碱基的限制性内切酶AscI和FseI消化，得到的重组目的基因部分最 后被克隆到piggyBac衍生载体pBac[3×P3-DsRedaf](通过限制性酶切位点AscⅠ和FseⅠ插 入)形成目的重组注射载体;

　　启动子元件的PCR扩增是用含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体(BAC)克隆 (下面简称H-chain BAC)为模板(DDBJ/EMBL/GenBank的序列号为：AF226688)，EGFP 基因是从pBS-A3EGFP质粒的中扩增得到，具体构建如下：

　　首先，不同元件片段的获得：

　　包含仅含信号肽N端的丝素重链启动子(简称为Fib-H P(s))由丝素重链基因5’-上游序 列，外显子1，内含子1和外显子2的部分5’端非重复序列组成，它是用 Fib-H-P(s)-f(61547-61564)：5'-aagcttgttgtacaaaactgcc-3'(SEQ ID NO.3)和 Fib-H-P(s)-r(63449-63471)：5'-gctatctagatgcatttgtataagcgacatact-3'(SEQ ID NO.4)引物对从 H-chainBAC扩增获得;

　　C端含LBS(s)(轻链结合位点)由包含C-端的倒数20个氨基酸(包含Cys-c20)的丝素重链基因的3’端和包含重链基因多聚腺嘌呤化信号序列的3’端下游序列组成，它是用含有一 个BamHI位点的LBS(s)-f(79138-79156)：5'-gtacggatccatgtggaattcctagaagac-3'(SEQID NO.5) 和含有一个SalI位点的LBS(s)-r(79359-79335)：5'-gcgcgtcgactagtacattcaaataaaatgcatac-3'(SEQ ID NO.6)从H-chain BAC扩增获得;

　　EGFP基因是用含有一个XbaI位点的EGFP-f：5'-ctagtctagaatggtgagcaagggcgagg-3'(SEQ ID NO.7)和含有一个BamHI位点的EGFP-r：5'-cagtggatccttgtacagctcgtccatgccg-3'(SEQ ID NO.8) 从pBS-A3EGFP质粒扩增获得。

　　其PCR扩增条件是94℃预变性5分钟，5个94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分30秒 的循环，然后是25个94℃1分钟，55℃1分钟;和72℃1分30秒的循环，接下来是72℃7 分钟和4℃保存。

　　将扩增元件按照下面的方法克隆到pSLfa1180fa(下面简称为pSL)穿梭载体(图1，A)： ①克隆LBS(s)片段通过BamHI和SalI酶切位点连入pSL穿梭载体获得pSL-LBS(s)质粒;②克 隆EGFP片段通过XbaI和BamHI连入pSL-LBS(s)质粒获得pSL-LBS(s)-EGFP质粒;③克隆Fib-H P(s)片段通过BamHI和HindⅢ连入pSL-LBS(s)-EGFP质粒获得pSL-LBS(s)-EGFP-Fib-HP(s)质粒;

　　最后，把获得的pSL-LBS(s)-EGFP-Fib-H P(s)质粒的重组目的基因表达框克隆进pBac[3× P3DsRedaf]载体(图1，B)，获得重组注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-LBS(s)-EGFP-Fib-H P(s)] (图1，C)。

　　实施例2、转基因家蚕的获得(转基因家蚕命名为TS-H-GC)

　　pHA3PIG(Tamura et al.,2000)被用作辅助质粒产生转位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit (Qiagen)试剂盒纯化注射质粒DNA，参照Kanda&Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显 微注射，注射后的蚕卵用无毒胶封口，在25℃条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的 蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因 个体;最后，获得的转基因个体饲养、传代，并进行EGFP表达的检测和荧光观察，结果如 图2所示。结果显示，TS-H-GC的蚕蛾在红色荧光下眼睛显示红色，蚕茧在绿色荧光条件下 显示绿色。结果表明，转基因阳性家蚕TS-H-GC成功获得。

　　启动子特异表达的检测和外源蛋白存在部位的观察如下：

　　获得的转基因家蚕进行基因组PCR、反向PCR、Western blotting以及荧光观察分析。

　　①基因组PCR分析：用酚-氯仿法从G1代的蛾或G2代7天的蛹抽提转基因家蚕及野生型的基因组DNA。利用引物对EGFP-f和EGFP-r对其进行PCR分析，后进行琼脂糖凝胶 电泳分析检测。结果显示，TS-H-GC相对于对照野生型有清晰单一的条带。

　　②反向PCR分析：利用逆转录聚合酶链反应(reverse PCR)技术测定了piggyBac载体在 染色体上的插入位点。10μg基因组DNA经HaeIII在37℃消化过夜，16℃过夜连接环状。以转座子特异性引物PLF/PLR(piggyBac左臂)和PRF/PRR(piggyBac右臂)扩增连接产物。PCR 片段克隆并测序。利用SilkMap应用程序(www.silkdb.org/silksoft/silkmap.html)完成了piggyBac 载体的蚕基因组插入位点的定位。结果显示，转基因成功插入到家蚕基因组内且拷贝数单一。

　　③Western blotting分析：去掉乱丝的茧碎片溶解于60%的LiSCN溶液中(按照约0.025g 的茧片/1ml的60%LiSCN比例进行溶解和处理)，然后离心取上清液，并用Tris缓冲液(10 mM Tris-HCl pH=7.0,2%SDS,5%β-巯基乙醇)稀释5倍后作为实验分析的样品。这些样品与 5×加样缓冲液混合并在100℃变性5分钟后上样于12%SDS-聚丙稀酰胺胶并进行Western blotting分析。Western blotting分析的抗体是GFP Rabbit MonoclonalAntibody(Beyotime, C.H.N.)，GFP的标准样品是Recombinant A.Victoria GFP protein(abcam,U.K.)。结果如图3所 示。结果显示，转基因家蚕能够检测到GFP蛋白表达。

　　④将G2代5龄幼虫第2天的转基因家蚕丝腺解剖，置于载玻片上，使用OlympusMacroViewMVX10-AUTO荧光立体显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)，检测并观察EGFP表达及存在位置，结果如图4所示。结果显示，在转基因家蚕的丝腺中能够观察到绿色荧光。

　　⑤冷冻切片的组织学检查：取G2代五龄五天的丝腺放于10vol.%福尔马林中固定，后 与茧丝分别包埋于Tissue-Tek O.C.T.化合物(Sakura Finetechnical Co.,Ltd.)中并切成10μm厚薄 片，利用荧光立体显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM或LSCM)对蚕丝和蚕丝单丝的冷冻 切片进行EGFF的检测及存在位置的观察，结果如图5所示。结果显示，在丝腺和茧丝中均 表达于丝素层中。

　　以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

　　序列表

　　<110> 西南大学;重庆西蚕生物技术研究院有限公司

　　<120> 家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用

　　<160> 8

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1929

　　<212> DNA

　　<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)

　　<400> 1

　　aagcttgttg tacaaaactg ccacacgcat ttttttctcc actgtaggtt gtagttacgc 60

　　gaaaacaaaa tcgttctgtg aaaattcaaa caaaaatatt ttttcgtaaa aacacttatc 120

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　　atacaatgtg tagatgttta ttctatcgaa agtaaatacg tcaaaactcg aaaattttca 840

　　gtataaaaag gttcaacttt ttcaaatcag catcagttcg gttccaactc tcaagatgag 900

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　　aacgccccag ctagaacatt caattattac tattaccact actaaggcag tatgtcctaa 1800

　　ctcgttccag atcagcgcta acttcgattg aatgtgcgaa atttatagct caatatttta 1860

　　gcacttatcg tattgattta agaaaaaatt gttaacattt tgtttcagta tgtcgcttat 1920

　　acaaatgca 1993

　　<210> 2

　　<211> 222

　　<212> DNA

　　<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)

　　<400> 2

　　tgtggaattc ctagaagaca actagttgtt aaattcagag cactgccttg tgtgaattgc 60

　　taatttttaa tataaaataa cccttgtttc ttacttcgtc ctggatacat ctatgttttt 120

　　tttttcgtta ataaatgaga gcatttaagt tattgttttt aattactttt ttttagaaaa 180

　　cagatttcgg attttttgta tgcattttat ttgaatgtac ta 228

　　<210> 3

　　<211> 22

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 3

　　aagcttgttg tacaaaactg cc 22

　　<210> 4

　　<211> 33

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 4

　　gctatctaga tgcatttgta taagcgacat act 33

　　<210> 5

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 5

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　　<210> 6

　　<211> 35

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 6

　　gcgcgtcgac tagtacattc aaataaaatg catac 35

　　<210> 7

　　<211> 29

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 7

　　ctagtctaga atggtgagca agggcgagg 29

　　<210> 8

　　<211> 31

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 8

　　cagtggatcc ttgtacagct cgtccatgcc g 31