一种高效的通过胚胎移植技术构建嵌合体性腺鸡胚的方法
技术领域
本发明属于家禽胚胎工程技术领域。具体涉及一种通过胚胎移植技术构建交叉性别的嵌合体性腺鸡胚，并以其作为模型研究鸡的性别决定机制的方法。可用于鸡的性别决定和胚胎发育。
背景技术
鸡是重要的经济和模式动物。它既可以作为易于获取的模型动物用于科研工作，又是人类主要的食物来源。全球的家禽行业如今都在寻找调控鸡的性别分化和发育的方法。尤其是在蛋鸡行业，由于只需要母鸡，公鸡通常都被直接淘汰，从而导致了严重的动物福利和经济损失问题。如果能够通过对性别的调控产生单一性别的鸡(例如母鸡)，将为家禽行业带来巨大的价值。而对性别的调控则依赖于对鸡正常性别决定和发育机制的深入理解。
与人类等哺乳动物不同，鸡和其他鸟类一样，具有ZZ/ZW的性染色体系统，其中雄性是同型配子性别。鸡的性别决定和发育机制目前仍不十分清楚。鸡的性腺分化发生在鸡胚发育的第6天左右，利用各种胚胎工程及分子生物学技术对此阶段的鸡胚进行研究，有助于深入探索鸡的性别决定和发育机制，为进一步的生产和应用奠定基础。“利用鸡胚胎移植技术构建嵌合体性腺的鸡胚”则是其中最为必要和有效的技术之一。
目前世界上掌握嵌合体性腺鸡胚构建技术的研究团队极少。关于该技术最近的报道来自于Debiao Zhao博士(专利申请人之一)在2010年发表于Nature杂志的文章。该技术的核心思路是将发育到特定阶段的带荧光标记的供体胚胎中胚层特定部位组织移植到野生型的供体胚胎对应位置中。不过，该文章中仅对胚胎移植的方法进行了简要的阐述，且胚胎移植的操作效率以及移植后得到嵌合体性腺鸡胚的成功率均比较低。鉴于此，本团队近年来一直致力于该技术的改良和完善工作，对胚胎移植过程中的操作细节以及所用试剂进行了多项优化，大大提高了胚胎移植的操作效率以及嵌合体性腺鸡胚的获得率。本发明专利即对此改良后的鸡胚移植方法进行系统和详尽的阐述。
发明内容
本发明旨在解决通过胚胎移植构建嵌合体性腺鸡胚时操作效率和成功率低的问题。鸡的胚胎移植技术操作难度较大，对胚胎发育阶段的把握以及操作过程中所用的试剂材料均有较高的要求，因此容易造成操作费时、效率低，移植后嵌合体胚胎获得率低等问题。本研究团队在前期掌握的胚胎移植技术的基础上，通过多年的研究，对胚胎移植材料的准备、供体组织的分离、移植技术的操作要点等多方面细节进行了优化，形成了一套完整高效的鸡胚移植技术，大大提高了构建嵌合体性腺鸡胚的操作效率和成功率。
为实现上述发明目的，所采取的的技术方案如下：
本发明提供一种构建嵌合体性腺鸡胚的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)鸡胚准备：将整个胚胎带绿色荧光蛋白(GFP)的受精蛋作为供体(GFP部位不包括蛋壳)，将正常受精蛋作为受体，将所述供体和受体孵化至鸡胚发育为13-15体节;
(2)供体组织分离：从供体中取出供体鸡胚，通过显微操作预测发育为供体鸡胚脊柱的第16-第23体节，并从预测发育为供体鸡胚脊柱第16-第23体节的左侧组织分离中胚层并切割为长宽各1-3体节的小段，从而获得供体组织;优选的，切割为长宽各2体节的小段;所述“预测(发育为)供体鸡胚脊柱的第16-第23体节”方法为：显微镜下观察到每个体节的大致长度，然后以此为准进行推算，如果已有13个体节，则往下推算10个体节(此时该位置处于脊柱尾部)，如果有14、15体节，则往下推算9或者8个体节。
(3)受体胚胎准备：去除受体鸡胚预测发育为脊柱第21～第23体节左侧组织的中胚层，保留剩余的受体胚胎待移植;预测方法同步骤(2)。
(4)胚胎移植：取供体组织按外胚层在上的朝向移植到受体中;封口后继续孵化至待测的胚龄或日龄(孵化21天出雏，如果待测时间在出雏前则为胚龄，待测时间在出雏后则为日龄);通过对供体和受体组织进行基因型测定，判定供体和受体的性别，根据需要的目标性别选择供体受体性别组合，从而获得目标交叉性别的嵌合体性腺鸡胚。(交叉性别即供体受体性别不同。实际操作时记录每个受体所用的供体，通过基因型测定确定供体和受体性别，根据需要选择供体受体性别不同的个体即可。)
进一步的，所述步骤(1)中，作为供体的受精蛋孵化时为钝端朝上放置;作为受体的受精蛋孵化时为水平放置;孵化完成后将供体和受体消毒。
进一步的，所述步骤(2)具体操作为：
(2-a)取出供体鸡胚：将供体的钝端开一个小窗，沿着血岛周围将胚胎剪下，取出供体鸡胚;
(2-b)分离供体组织条带：将供体鸡胚正面朝上，在立体显微镜下，从供体鸡胚脊柱左侧预测发育为第16-第23体节处的中胚层切割一条长8体节，宽2体节的供体组织条带，剩余的供体鸡胚进行性别测定;
(2-c)分离供体组织：将组织条带分割成长宽各2体节的小段，即为供体组织;将所述供体组织置于二氧化碳非依赖性培养基/10%鸡血清培养基中待用。
进一步的，所述步骤(3)具体操作为：
(3-a)胚蛋开窗：将受体水平放置，最顶部贴一块胶布，胶布的中间开一的小窗;贴胶布作用在于开口(剪蛋壳)时边缘更加齐整，不易产生碎片从而导致碎片进入鸡蛋内造成污染，从而提高操作成功率。
(3-b)显示胚胎：通过步骤(3-a)开的小窗，在受体鸡胚上方小心加入青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液，以保持胚胎的湿润，并使受体鸡胚略微上升靠近窗口;使用口吸管连接口径约50μm的微量吸液管(提前拉成90°直角)，吸取溶有印度墨水的青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液，注射到受体鸡胚的下方，使受体鸡胚清晰可见
(3-c)移除受体组织：使用显微操作针将供体组织预测发育为第16-第23体节的左侧组织的蛋黄膜小心掀开，暴露外胚层组织;将对应第21-第23体节处的外胚层组织用显微操作针切开并翻到一侧，暴露中胚层;去除受体鸡胚对应部位的中胚层，保留剩余的受体胚胎待移植。
进一步的，所述步骤(3-a)中所述小窗的直径为0.5-1cm。
进一步的，所述步骤(3-b)中所述青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液中，青霉素浓度为100U/ml链霉素浓度为100μg/ml。
进一步的，所述步骤(4)具体操作为：
(4-a)转移供体组织：将供体组织按照外胚层的方向在上的方向转移到经步骤(3)处理的受体胚胎中，将翻起的外胚层和蛋黄膜重新覆盖与供体组织之上;
(4-b)重新封口：从受体钝端的针孔中用注射器小心的吸取0.5-1.0ml的蛋白，使胚胎的位置下沉，低于蛋壳上的开口;在GFP显微镜下观察胚胎，确保供体组织仍然在对应的位置上后，用胶带紧密的封住受体蛋壳上的开口及钝端的针孔;
(4-c)重新孵化：将受体水平放置与孵化器中，温度37.5℃，湿度60%，重新孵化，直至孵化至待测的胚龄或日龄;通过对供体和受体进行基因型测定，判定供体和受体的性别，根据需要的目标性别选择供体受体性别组合，从而获得交叉性别的嵌合体性腺鸡胚。在重新孵化的第一天不进行翻蛋。在蛋的封口和孵化过程中尽量小心操作，以免造成供体组织与受体分离。
本发明技术方案相对于现有技术所实现的有益效果如下：
1)使用本发明所述方法有效提高交叉性别的嵌合体性腺鸡胚成功率，从2010年论文方法中成功率约12.5%，本发明所述方法成功率达到38%。
本发明方法通过将供体受精蛋钝端向上放置孵化，有效提高取供体的成功率，通过将受体受精蛋横向放置孵化并加PBS缓冲液使鸡胚更靠近顶端，方便供体植入，提高供体移植的成功率。开口前在受体受精蛋表面粘贴胶布，提高开口平整性，减少蛋壳碎片对鸡胚的污染，提高移植的成功率。明确了供体组织放入受体的方向，确保移植的成功(供体组织如果放反，将不能获得嵌合体性腺)
2)使用本发明所述方法可以获得交叉性别的嵌合体性腺鸡胚。以这种嵌合体性腺鸡胚为模型，可以研究相关基因在不同性别性腺中的表达规律，从而进一步研究鸡的性别决定和性腺发育机制。
3)通过嵌合体性腺鸡胚模型研究鸡的性别决定机制，从而实现对鸡的性别调控，在蛋鸡和肉鸡产业中均有巨大的市场效益。在肉鸡产业中，由于雄性比雌性生长速度更快，人们希望得到更多的雄性后代;而在蛋鸡中，由于只需要母鸡，小公鸡在出雏后往往被直接处死，在造成经济损失的同时也产生了严重的福利问题。如果通过鸡的性别调控使得肉鸡品种中产生更多(或全部)的雄性后代，而蛋鸡品种中产生更多(或全部)的雌性后代，则可以为产业带来巨大的经济效益，同时可以有效避免蛋鸡生产中小公鸡被直接处死所导致的福利问题。
附图说明
图1：鸡胚移植技术路线图
图2：供体组织准备流程图
图3：受体胚胎准备流程图
图4：组织移植流程图
图5：嵌合体鸡(胚)和嵌合体性腺检测图
图6：嵌合体性腺组织切片免疫染色图
具体实施方式
下面以一批鸡胚胎移植试验为例具体阐述本发明：
实施例1材料准备
(1)鸡胚准备
(1-1)供体胚胎准备：取带绿色荧光蛋白(GFP)的受精蛋8枚，钝端朝上放置，于上午11点开始孵化，温度37.5℃，湿度60%，每30分钟翻蛋一次，孵化至H&H(HamburgerHamilton Stages)阶段11/12，该阶段鸡胚发育状态为13-15体节，发育所需时间大约42-45小时，即孵化至第三天上午8点左右取出。由于气室在钝端，鸡胚总是浮在最顶端，钝端朝上放置的方式使取供体的时候通过气室取胚更方便，成功率更高。(由于供体为GFP鸡蛋，GFP鸡蛋的发育比普通鸡蛋要略慢，因此，本实施例中供体孵化时间相比于受体的普通受精蛋稍长)
(1-2)受体胚胎准备：孵化未GFP的普通受精蛋20枚，水平放置，于同天下午1点开始孵化，温度37.5℃，湿度60%，每30分钟翻蛋一次，孵化至H&H阶段11/12，该阶段鸡胚发育状态为13-15体节，发育所需时间大约40-44小时，即孵化至第三天上午8点左右取出;采用水平放置的方式可以使鸡胚避开钝端的气室，从而使鸡胚更靠近蛋壳，植入供体时操作更方便，成功率更高。
将孵化后的供体受精蛋和受体受精蛋用75%的酒精清洁消毒鸡蛋表面，待其彻底变干。
(2)试剂和材料准备
配置质量百分比为3%的琼脂糖/印度墨水凝胶板2块，所述质量百分比为3%的琼脂糖与印度墨水体积比例10:1，用于固定供体鸡胚。
准备100ml含青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液;所述缓冲液中，青霉素浓度为100U/ml链霉素浓度为100μg/ml;
准备50μl溶有印度墨水的青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液，所述印度墨水与青霉素-链霉素(1×)-PBS缓冲液体积比例1:4;
准备1ml的二氧化碳非依赖性培养基/10%鸡血清培养基(C-C培养基，CO2-Independent medium/10%Chicken serum)
实施例2供体组织分离
(2-1)取出鸡胚
从步骤(1.1)准备的供体鸡胚的钝端开一个小窗，在GFP显微镜下检查胚胎的状态，确认供体鸡胚显示荧光并已有13-15个体节;即处于H&H阶段11/12，如果鸡胚生长超过15体节，则舍弃该鸡胚;如果鸡胚生长少于13体节，将供体胚蛋重新封口，继续孵化(约每1.5小时生长1体节)至13-15个体节;
沿着血岛周围将胚胎剪下，小心地取出供体鸡胚;
将供体鸡胚正面朝上置于加有含青链霉素PBS缓冲液的3%琼脂糖/印度墨水凝胶板上，以便于观察鸡胚，并用大头针固定。
(2-2)分离供体组织
在立体显微镜下，预测供体鸡胚脊柱左侧(观察者右侧)将要发育为第16-23体节的位置。所述“预测(发育为)供体鸡胚脊柱的第16-23体节”方法为：显微镜下观察到每个体节的大致长度，然后以此为准进行推算，如果已有13个体节，则往下推算10个体节(此时该位置处于脊柱尾部)，如果有14、15体节，则往下推算9或者8个体节。如果供体鸡胚当前具有13个体节，那么第23体节将位于脊柱的尾部。
切割一条长8体节，宽2体节的组织条带;延预测的第16-23体节位置沿体节的左侧用显微操作针切割出小心地纵向打两行小孔，两行小孔之间横向距离为2个体节的宽度。用显微操作针切割小孔之间的连接处，形成一条长为8体节，宽为2体节的组织条带(此条带上部为外胚层，中部下部为中胚层和内胚层)。
将此组织条带切割为长宽各2体节的组织块，即获得供体组织。注意区分组织块的正反方向(外胚层与中胚层内胚层有较为明显的分界，外胚层类似于膜状形态，略透明，具有粘性，容易形成凹面)。
(2-3)收集供体组织
使用口吸管和口径100μm的微量吸液管将供体组织转移到含有二氧化碳非依赖性培养基/10%鸡血清培养基(C-C培养基)的小培养皿中，待组织移植。
注意盖上培养皿的盖子以避免培养基挥发。
每个发育至13-15体节的鸡胚可以取下3-4块供体组织。共从4个鸡胚中取下13块供体组织(供体1和供体2各4块，供体3三块，供体4两块)。将来自不同供体的供体组织分别转移到含有C-C培养基的小培养皿中，等待组织移植。保留这4个鸡胚的分离长为8体节，宽为2体节的组织条带后剩余的组织，进行性别测定。(见附图2)
实施例3受体胚胎准备
(3-1)胚蛋开窗
将大约孵化至13-15体节的受体胚蛋水平放置。
在钝端(气室部位)用注射器针头扎一小孔，然后在水平放置的鸡蛋最顶部小心地贴一块胶布(长宽各1.5cm)。
在胶布的最顶部开一个直径1cm的小窗。
(3-2)显示胚胎
通过步骤(3-1)开的小窗，在胚胎上方小心加入青链霉素PBS缓冲液，以保持胚胎的湿润，并使胚胎略微上升靠近窗口。
使用口吸管连接口径约50μm的微量吸液管(提前拉成90°直角)，吸取稀释于青链霉素PBS缓冲液中的印度墨水，注射到胚胎的下方，使胚胎清晰可见。
在显微镜下确认鸡胚的发育阶段(应具有13-15个体节)。
(3-3)移除受体组织
使用显微操作针将供体组织对应部位的蛋黄膜小心掀开，暴露外胚层组织。
轻轻地将对应第21-23体节处的外胚层组织用显微操作针切开并翻到一侧，暴露中胚层。
小心地移除中胚层组织(长宽约1.5-2体节)，注意不要破坏内胚层。至此，剩余的受体胚胎已可以用作胚胎移植。
共准备发育到适宜阶段(13-15体节)的受体胚胎13个。(见附图3)
实施例4胚胎移植
(4-1)转移供体组织
利用口吸管将供体组织转移到受体胚胎中。在转移过程中同时吸取少量培养基，有助于供体组织的黏连。
将供体组织按外胚层在上的方向放入受体胚胎对应位置中，使用显微操作针使供体组织尽量紧密地结合于受体胚胎。
将翻起的外胚层和蛋黄膜重新覆盖与供体组织之上。
(4-2)重新封口
从受体胚蛋钝端的针孔中用注射器小心的吸取0.5-1.0ml的蛋白，使胚胎的位置下沉，低于蛋壳上的开口。在GFP显微镜下观察胚胎，确保供体组织仍然在对应的位置上。用胶带紧密的封住受体蛋壳上的开口及钝端的针孔。
(4-3)重新孵化
将蛋水平放置与孵化器中，温度37.5℃，湿度60%，在重新孵化的第一天不进行翻蛋。在蛋的封口和孵化过程中尽量小心操作，以免造成供体组织与受体分离。
共获得移植后的胚蛋13枚。准确记录各枚胚蛋的供体来源(见附图4，受体1-4供体组织来自供体1，受体5-8供体组织来自供体2，受体9-11供体组织来自供体3，受体12-13来自供体4)。
实施例5移植效果检查
分别在胚胎期第7天、胚胎期第20天、出雏后24周对部分鸡胚进行解剖和性腺检查。检查结果见附表1。
附表1.鸡胚胎移植试验检查结果
注：E7表示胚胎期第7天，E20表示胚胎期第20天，W24表示出雏后24周。
在不同的时间点进行鸡胚和性腺的观测，结果见附图5，图中箭头所示的高亮部分为荧光信号区域。从图5a中可以看出，孵化7天的胚胎和出雏后24周的母鸡均有部分组织带有绿色荧光信号，表示该胚胎或个体为嵌合体。从图5b中可以看出孵化20天的性腺和出雏后24周的成年性腺中均有部分组织带绿色荧光信号，表明嵌合体性腺构建成功。
切片取自胚胎期20天嵌合体性腺组织，进一步对嵌合体性腺进行组织切片和免疫染色，GFP信号(绿色)表示雄性供体组织，使用Aromatase(芳香化酶)抗体标记雌性组织(红色)，使用Hoechst抗体标记细胞核(蓝色)，并通过组织形态和标记基因判断是否为交叉性别的嵌合体性腺，结果见附图6。从图中可以看出，左侧性腺呈现出带皮质层的卵巢形态，而右侧性腺呈现出带精索结构的睾丸形态。以芳香化酶为雌性组织的标记基因(红色)，可以看出，此性腺同时含有带绿色荧光性腺的雄性供体细胞和表达芳香化酶基因的雌性组织，表明交叉性别的嵌合体性腺构建成功。
本实施例中，移植后的胚蛋共13枚，构建成功5个嵌合体性腺，成功率为38%。
