一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用。
背景技术
TRIM蛋白家族第一个成员，非洲爪蟾核因子7于1991年被克隆鉴定以来，在人类的基因组中已经发现了近80个TRIM家族蛋白。TRIM家族蛋白由于其具有的特殊RBCC(RING/B-box/coiled-coil)结构，又被称为锌指蛋白。从N端到C端，首先是RING结构域、中部为一个或者两个B-box结构域，以及C端一个coil-coiled结构域。TRIM家族的成员在细胞分化、增殖、发育、凋亡等众多的生物学过程中发挥重要的生理作用，尤其在天然免疫的一系列生物过程，对逆转录病毒具有限制作用。
TRIM25蛋白是从属于C-Ⅳ亚家族中的TRIM蛋白家族之一，该蛋白N端具有TRIM蛋白家族典型的RING，B-box，Coiled-coil(RBBC)结构域，C端还有一个PRY/SPRY结构域。其主要在女性生殖器官(子宫，卵巢和乳腺)以及乳腺癌和卵巢癌中表达；另外，发现其再免疫相关信号通路和抗病毒免疫反应中也发挥着重要的作用，例如，TRIM25蛋白可通过参与机体的先天性抗RNA病毒反应，抑制人艾滋病毒，鼠白血病病毒，禽白血病病毒和B型乙肝病毒等RNA病毒在细胞内的复制。
2015年首次报道了鸡TRIM25全基因，克隆了鸡TRIM25的全长cDNA，荧光定量检测发现TRIM25蛋白在鸡的免疫组织如胸腺、法氏囊和肺脏等含量较高。比较发现鸡TRIM25蛋白与人和小鼠的TRIM25同源性分别仅为在47.6％和45.7％(Feng et al.,2015)。此外，还分析了在体内外感染新城疫病毒(NDV)后，以及经Poly(I:C)或Poly(dA:dT)刺激的鸡胚成纤维细胞(CEF)中TRIM25蛋白表达水平的改变。因鸡免疫器官的特殊性，对鸡TRIM25功能和作用机制知之甚少，许多亟待进一步深入研究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。利用该重组荧光表达质粒可以开展鸡TRIM25功能的研究，以及抗RNA病毒转基因鸡的制备。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取鸡脾组织细胞中的RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，利用SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，得到大小为1881bp鸡源TRIM25基因扩增产物；
(2)将步骤(1)得到的鸡源TRIM25基因扩增产物连入pMD18-T载体，获得pMD18-T-ChTRIM25；然后用BamH I和EcoRI分别酶切pEGFPC1载体和pMD18-T-ChTRIM25，回收载体pEGFPC1和含有启动子的ChTRIM25片段，并用T4-ligase连接，提取重组质粒，酶切鉴定，构建得到大小约为6500bp鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。
优选的，步骤(1)中，PCR扩增的体系为25μL，包括：cDNA模板2μL，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各1.0μL，2×EsTaq Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL。
优选的，步骤(1)中，PCR扩增的条件为：94℃4min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min50 s，循环37次；72℃，6min。
优选的，步骤(3)中，T4-ligase连接的温度为23℃，连接时间为2h。
本发明的第二方面，提供上述方法构建的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒。
本发明的第三方面，提供上述鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒在鸡TRIM25过表达研究中的应用。
本发明的第四方面，提供上述鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒在制备抗RNA病毒转基因鸡中的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒，可以用于开展鸡TRIM25功能及应用的研究，也可以用于抗RNA病毒转基因鸡的制备。
附图说明
图1：本发明的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒(ChTRIM25-GFP)的构建及鉴定；其中，A：鸡TRIM25开放阅读框目的基因的扩增(泳道M1，DNA marker；泳道1和2，鸡TRIM25目的基因，1881bp)；B：含鸡TRIM25基因的重组克隆载体的酶切鉴定(泳道M1和M2，均为DNAmarker；泳道3和4，克隆载体TRIM25-T双酶切)；C：含鸡TRIM25和GFP基因的重组过表达质粒(泳道M3，DNAmarker；泳道5，TRIM25-GFP；泳道6，TRIM25-GFP单酶切)；D：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后胞内绿色荧光信号；E：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后TRIM25mRNA转录水平的变化(**，组间差异极显著P<0.01)；F：TRIM25-GFP质粒转染DF1细胞后胞内TRIM25蛋白水平表达变化。
图2：DF1细胞鸡TRIM25过表达对ALV-A病毒复制的抑制作用；其中，dpi，鸡TRIM25过表达质粒接种后的天数；DF1细胞上清中ALV-A/K病毒滴度是使用IDEXX ALV P27抗原ELISA试剂盒检测计算所得；(**,P<0.01)。
图3：DF1细胞鸡TRIM25过表达对ALV-K病毒复制的抑制作用；其中，dpi，鸡TRIM25过表达质粒接种后的天数；DF1细胞上清中ALV-A/K病毒滴度是使用IDEXX ALV P27抗原ELISA试剂盒检测计算所得；(**,P<0.01)。
图4：活体成像系统观测出壳后雏鸡各组织中GFP荧光信号图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，由于鸡TRIM25蛋白与人和小鼠的TRIM25同源性分别仅为在47.6％和45.7％，加之鸡免疫器官的特殊性，目前对鸡TRIM25功能和作用机制知之甚少，许多亟待进一步深入研究。
绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因无需底物、诱导物等的参与，无毒害、无损伤，在异源细胞内自主表达、自发产生荧光，能简单、灵敏的动态检测，克服了传统报告基因成本高、操作繁琐，不能反映体内真实过程的缺点，是较为理想的报告基因。因此，构建鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒非常有利于鸡TRIM25功能和作用机制的研究。但目前还没有用鸡TRIM25基因构建重组荧光表达载体。以往都是用人或其它哺乳动物TRIM25基因构建的，获得TRIM25蛋白与本发明表达的鸡TRIM25蛋白结构组成上差异性较大(同源性少于60％)。
基于此，本发明设计构建了一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒，以用于鸡TRIM25功能和作用机制的研究。
对于重组表达载体的构建，目前虽然有较多的报道，但是，对于本发明的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒构建而言，仍存在诸多的技术难点，具体来说：
第一，对于连入载体的目的基因片段长度的选择，若目的基因片段的长度过长，其一方面在PCR扩增过程中容易出现扩增错误，另一方面，长度过长也会导致载入载体的难度增加；但若目的基因片段的长度过短，则无法涵盖编码区的主要功能区域，从而失去对目的基因的研究价值。
本发明所选择的连入载体的目的基因片段长度为1881bp(具体序列如SEQ IDNO.3所示)，该基因片段能够编码完整鸡TRIM25蛋白并具有较强的生物活性如抗病毒功能、泛素化活性等。
第二，PCR特异性扩增目的基因时的引物设计是至关重要的一环，使用不合适的引物容易导致试验失败。而且，对于重组质粒的构建而言，其还不仅仅是简单的PCR扩增，之后还需要将目的片段连接到表达载体上，所以在引物设计时还需要考虑添加限制性内切酶酶切位点。本发明对扩增引物进行了优化设计，所采用的引物能够将连入载体的1881bp目的基因片段准确、完整的扩增出来，而且方便后续目的片段与表达载体的连接。
第三，本发明所构建的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒(ChTRIM25-GFP)要同时稳定表达GFP基因和鸡TRIM25基因，在应用过程中通过荧光蛋白基因表达显示鸡TRIM25基因的表达，这需要选择合适的连接部位和连接酶来解决。
第四，在应用过程中也要选择鸡源细胞(系)和鸡胚开展应用研究，要选择合适的转染试剂和途径如脂质体和慢病毒载体等转染进入鸡源细胞或鸡胚。
本发明在鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的构建过程中，首先扩增得到特定长度的目的基因片段(1881bp)，然后将目的基因片段连入pMD18-T载体，以获得大量含鸡TRIM25基因的质粒，也就能够获得较多的鸡TRIM25基因，进而与载体pEGFPC1连接得到的阳性重组载体才足够多，筛选阳性质粒或菌体会容易；若直接将目的基因片段与载体pEGFPC1连接，则直接连接形成的重组表达载体ChTRIM25-GFP很少，筛选时很难得到阳性质粒。
本发明最终构建的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒，能够同时稳定表达GFP基因和鸡TRIM25基因，在应用过程中通过荧光蛋白基因表达显示鸡TRIM25基因的表达；而且本发明构建的质粒在鸡源细胞和鸡胚内表达稳定，是一种研究鸡TRIM25功能非常好的生物材料。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：
1.引物设计：
本发明根据已发表的TRIM25基因序列(NM_001318458.1)设计包含所有关键结构域的引物，并根据需要插入的表达载体添加酶切位点。所合成的引物序列如下所示：
F：5’-GGAATTCTGATGAGCGGGAGAATGGCGACG-3’；(SEQ ID NO.1)
R：-5’-GGATCCCGAAAATAACCAGAAGGCAGGGTACAC-3’。(SEQ ID NO.2)
2.组织RNA的提取：
无菌低温条件下取2周龄海兰褐雏鸡脾脏，剪碎后液氮研磨，挑取40mg左右，置于无RNA酶的1.5mL EP管中，加入1mL Trizol后吹打混匀，室温下裂解6min。加入0.4倍Trizol体积的氯仿，振荡20s后静置3min。4℃恒温离心12 000rpm(13400×g)10min，取上层水相。在水相溶液中加入与水相等体积的异丙醇，涡旋振荡混匀后离心，弃掉上清液。洗涤沉淀，DEPC水配制75％乙醇，以1倍Trizol体积加入，12 000rpm(13400×g)离心2min，弃去上清。开盖静置3min，50-100μL DEPC水溶解沉淀，置于-80℃冰箱保存，备用。1％琼脂糖凝胶电泳观察，测定OD260nm、OD280nm吸光度值，并计算其比值，鉴定样品RNA质量，于-80℃保存备用。
3.逆转录合成鸡TRIM25 cDNA：
反转录酶5×FastKing-RT SuperMix 4.0μL、RNase-Free ddH2O 15.0μL及将模板RNA1.0μL在冰上溶解，使用前简短离心并混匀。混匀20μL体系后加入PCR仪进行逆转录操作，反应程序为：42℃15min，95℃3min，反应完毕后于-20℃保存。
4.鸡TRIM25基因的扩增：
将设计合成的TRIM25-GFP引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)简短离心后稀释，以鸡脾脏基因组DNA为模板，按25μL的PCR扩增体系(cDNA模板2μL，SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物各1.0μL，2×EsTaq Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL)扩增目的片段，PCR扩增条件：94℃4min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min 50s，循环37次；72℃，6min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图1A。由图1A可以看出，扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，一条大小1881bp带为ChTRIM25基因(序列如SEQ ID NO.3所示)。
5.鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒(ChTRIM25-GFP)的构建及验证
凝胶电泳后切下包含目的片段ChTRIM25的阳性条带胶块并回收，与pMD18-Tsimple载体连接，得到重组连接载体pMD18-T-ChTRIM25，进一步转化至DH5α感受态细胞，挑取状态良好边缘润滑的白色菌落，接种于含5mL的LB液体培养基(50μg/mL Amp+)的试管中，37℃振摇8h，用DNA质粒试剂盒提取重组质粒，BamH I和EcoRI双酶切鉴定重组质粒，37℃酶切反应4h，取2μL 10×Loading Buffer终止酶切反应，酶切产物进行1％琼脂凝胶电泳验证。结果见图1B。
将酶切产物进行浓度测定后与同等操作(BamH I和EcoRI双酶切)的pEGFP-C1载体回收产物进行23℃连接2h，并转化至TOP10感受态细胞，重复进行上述的挑菌、扩大培养及酶切测序，电泳验证，结果见图1C。对菌种进行扩大培养并按照无内毒素质粒提取盒提取质粒，即得到构建成功的鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒(ChTRIM25-GFP)，-20℃冷冻保存。
将提取的无内毒素质粒利用分光光度计定量，利用Opti-MEM稀释至工作浓度。同时将DF-1细胞均与铺于六孔板，细胞覆盖率达70％-80％时，ChTRIM25-GFP质粒与转染试剂lipo3000按照1：2比例混合并转染DF-1细胞，转染后6h，去除细胞上清，并改用1％血清浓度培养基继续培养。间隔12h，倒置荧光显微镜观察细胞内行GFP绿色荧光表达。结果见图1D。检测到GFP绿色荧光信号表明ChTRIM25-GFP中荧光蛋白的表达。
荧光定量RT-PCR检测鸡TRIM25mRNA的转录水平变化：收集荧光信号为阳性的转染细胞液氮研磨，处理后按照RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，随即将获得的RNA进行浓度测定，并根据不同浓度混合反转录酶及无菌水混合至20μL，按照反应条件42℃15min，95℃3min逆转录为cDNA。将合成的定量引物简短离心后用无菌水进行稀释，按照20μL反应体系预混，预混体系为：
SYBR MIX 10.5μL
cDNA 1μL
ddH2O7.5μL
Forward-Primer(5’-TACAACCACCACCCTCA-3’)0.5μL
Reverse–Primer(5’-GATGCCAATGCCACAG-3’)0.5μL。
PCR反应程序为：95℃10min；95℃15S，60℃60s，40循环；添加溶解曲线，利用△△Ct法计算相对表达量。结果见图1E。与空白对照和GFP空质粒相比显著升高，表明ChTRIM25mRNA有效转录。
WB法验证ChTRIM25蛋白表达：收集细胞，加入含1％PMSF的IP细胞裂解液，4℃消化30min。超声破碎，3S/次，间隔1S，重复3次，超声功率200W。4℃12000rpm(13400×g)离心10min收集上清。细胞蛋白与SDS蛋白上样缓冲液按照4：1混合15μL体系，置于沸水中煮沸7min，4℃12000rpm(13400×g)离心10min，立即放置在冰块上迅速降温(使蛋白变性后不再复性)备用。配制5％上层浓缩胶，12％下层分离胶。加样后，按照70V 50A1h，90V 50A 1-1.5h进行电泳。电泳完成后，甲醇活化PVDF膜，切下包含目的条带的胶块覆盖在膜上，按照电流从负到正进行转膜，转膜电流保持200A，时间2-2.5h。转膜完成后，TBST洗脱液配制5％牛血清白蛋白，室温2h震荡孵育PVDF膜进而封闭杂蛋白，孵育完毕后TBST振荡洗脱4次，每次7min。将ChTRIM25鼠源抗体与一抗稀释液按照1：2000稀释，将洗脱后的PVDF膜浸没，4℃放置过夜。取出PVDF膜，TBST振荡洗脱4次，每次7min。HRP标记的鼠源二抗与TBST按照1：2000稀释，浸没洗涤后的PVDF膜，37℃温箱孵育1.5h。取出PVDF膜，TBST振荡洗脱4次，每次7min。ECL特敏显色试剂盒，显色液A与B按照1：1混合后，于蛋白显影仪曝光显示蛋白条带。结果见图1F。结果有相对空质粒对照过表达的特异性阳性带出现，表明ChTRIM25蛋白有效表达。
应用例1：
将验证正确的ChTRIM25-GFP质粒进行浓度测定后，稀释至工作浓度并于-20℃保存。
六孔板培养DF-1细胞，覆盖率达70％-80％时，转染ChTRIM25-GFP质粒，维持转染6h后PBS洗去细胞上清，维持24h。
接种ALV-A病毒，孵育2h后PBS洗去细胞上清，用生长培养基或维持培养基维持72h。取细胞上清和细胞，用ALV P27抗原ELISA和IFA分别ALV-A病毒滴度和病毒。结果见图2。
应用例2：
六孔板培养DF-1细胞，覆盖率达70％-80％时，转染ChTRIM25-GFP质粒，维持转染6h后PBS洗去细胞上清，维持24h。
接种ALV-K病毒，孵育2h后PBS洗去细胞上清，用生长培养基或维持培养基维持72h。取细胞上清和细胞，用ALV P27抗原ELISA和IFA分别ALV-K病毒滴度和病毒。结果见图3。
应用例3：
鸡胚准备：购买SPF鸡胚120枚，并置于全自动孵化箱中进行孵化。每日用照蛋器进行监测，剔除死胚和未受精胚。
ChTRIM25-GFP慢病毒载体的准备：使用ChTRIM25-GFP质粒与慢病毒载体构建重组载体5μL(108TU/mL)和5μLploybrene转染增强剂(20μg/mL)进行混合，室温静置备用；
卵黄囊注射：在蛋托上将鸡胚气室端朝上放置，分别用3％的碘酊与75％的乙醇对气室部位进行杀菌处理，然后利用经酒精消毒的打孔器，在鸡胚气室中心位置钻一小孔，之后用经高压灭菌的微量注射器从小孔处以垂直桌面向下的方式进针三分之二将ChTRIM25-GFP慢病毒载体转染混合液注射进鸡胚卵黄囊内；转染后的鸡胚，用3％的碘酊与75％的乙醇再次对小孔处消毒处理，并立即用融化石蜡封口，然后继续置于全自动孵化箱中进行孵化。
鸡胚出壳后3日龄，随机抽取各组雏鸡2只，利用活体成像系统观测出壳后雏鸡各组织中GFP荧光信号。结果如图4所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种鸡源TRIM25基因重组荧光表达质粒的制备方法和应用
<130> 2020
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaattctga tgagcgggag aatggcgacg 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatcccgaa aataaccaga aggcagggta cac 33
<210> 3
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcgggagaa tggcgacgtt gaccaaagct cagtcggagc cgaatctgtt ggcgctggag 60
gaggacctga cgtgctccat ctgcctcagc atcttcgacg cccccgtgac ggtgccctgc 120
gggcacaact tctgtgccta ctgcctggag caaacctggg ccagccaggt gcgggacttc 180
agctgcccgc agtgccgcac caccttcccg gaccgcccgc agctccacaa gaacacggtg 240
ctgtgccggg tggtggagca gctgcagggc tgcggggacg ggaaggagga cgatgagcac 300
gaggaggaag agcaggaggc ggcagccccc atctactgcg acagttgtct gcaagcggcc 360
gccacgcaga cctgcctcac ctgcatggcc tccttctgcc ccgagcacct gcggccgcac 420
tacgacagcc cggccttccg ccaccatcag ctgtgcccgc ccgtgcggga cctgcagcag 480
aggaagtgcc cgcagcacaa caagctcttt gagttcttct gcagccagca cagctgctgc 540
atctgctcgc tctgcctgct gagccacaag ctgtgccaca ccagcccgct gcagcaggcc 600
aaagacaacg ctgagtcagc actgaagaag aggctggcag agctgcacaa tcagagtgaa 660
agatctgtgc aagcaatgaa ctctgtgaaa acaatccaaa gacaagctgc tgagacagct 720
gccagaaagc gagatttgct gagagctgag tttttggaaa ttaaagcttt aattgaagaa 780
aaagaaaacc agaccctaaa agtatttatg gaagaagaaa aaagagtttg caataagttt 840
gattacgtat ataaaattct gggaaataag aagaatgaaa ttcagtctct gagagaccag 900
attgagatgg cactgactga aggtgatgac gttctctttt taaagagagc agcagcgctg 960
caacgaacat caataaaaga ggcttttgtc ccagtaattg aaatggacaa caacatgata 1020
catgctgctt atcagtctgc cattaacctt aaagatgttg tcaaacttgc agtgaatgtg 1080
tctgtggata aaagaacgga tgcaaaacca ccacctggga aaacaaagcc tccttcagtg 1140
ccttccccaa acaaacccgt tgttaaaaaa aagcttgctg cagactcacg tacccacaaa 1200
gacaaaatcc ctcacccaac taaaaccact ctgctggagg agacagatac ccaagacaaa 1260
aggaatcctg ttaaacttgc accaagcatg ggagcaccaa gcatgggagc accaagcgct 1320
gcaaatgctg ctaaagtgaa agaacttatt agcagcttcc tgaaaaaacc cagagcggag 1380
cttttgcagt atgctgctaa cgtcacgctg gatttcaaca cagctcacag caaagtggct 1440
ctgtctgaga gatacaccaa gatgtctgtt tcagacaccc aactgaatta caaccaccac 1500
cctcagcgtt tcaccgactg cccccaggtg ctggggttcc agtgcttcaa gagaggcatc 1560
cactactggg aagtggaaat gcagcagaac aacttctgtg gcattggcat ctgctatggc 1620
agcatggagc ggcaggggcc ggacagccgc ctgggtagga acagcagttc ttggtgtatc 1680
gagtggttta attccaaaat ttcagcctgg cataatgatg ttgaaaagtg cttacccaat 1740
acaaaggcca ctaagattgg tgtgctgctc cactgtgatg gagggttcgt gcttttcttg 1800
actgttgagg aaaagcttaa tttgatctat aaattcaaag cccagtttac tgaagctgtg 1860
taccctgcct tctggttatt t 1881
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tacaaccacc accctca 17
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatgccaatg ccacag 16
