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利用漆酶PtoLAC14调控S/G型木质素比例并提高细胞壁降解转化效率的方法

2021-02-02 08:46:45

利用漆酶PtoLAC14调控S/G型木质素比例并提高细胞壁降解转化效率的方法

　　技术领域

　　本发明属于基因工程领域，具体涉及一种调控杨树S/G型木质素比例的基因及调控方法。

　　背景技术

　　杨树(Populus spp.)是世界范围内最广泛种植的速生树种，是重要的造纸原料和建筑用材，同时也是生物能源产业的主要原料(Wang et al.,2012)。然而，在杨树的开发利用中，木质素(Lignin)的存在直接影响着其生产成本(Baucheret al.,2003)。例如在生物质能源生产过程中需要经过预处理以去除木质素，在造纸时也要先去除木质素成分。因此，研究植物木质素生物合成的调控机制，降低木材中木质素的含量或改变其组分，使木质素更易于脱除，在生产上更有利于木材的利用，具有重大的科学意义和产业前景。

　　木质素是苯丙烷单体通过C-C和醚键连接而成的酚类聚合物(Boerjan et al2003)，占生物质总量的15％-40％(Ragauskas et al 2014)。植物体内木质素的合成包括了细胞内木质素单体的合成、单体的转运和跨膜运输、以及细胞外木质素的聚合(Boerjanet al.,2003)。高等植物中，苯丙氨酸(phenylalanine)或酪氨酸(tyrosine)通过苯丙烷途径及木质素特异合成途径的一系列反应，生成香豆醇(coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)三种木质素单体。三种单体随后被转运到细胞壁，再经过尚未研究清楚的聚合过程，生成对-羟基苯基木质素(p-hydroxyphenyllignin，H-木质素)、愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)(Chen et al.,2007；Xu et al.,2009)。杨树的木质素主要由G型和S型单体组成，H型单体含量极少。木材纤维中木质素的组分不同，会影响其化学稳定性。G-木质素单体的苯环C-5处于游离状态，可与其它基团交联形成稳定的C-C键；而S-木质素单体的苯环C-5位置为甲氧基，不能形成C-C键，连接比较疏松。因此，木质素单体的S/G比值(S/G ratio)可反映木质素脱除的难易程度：S/G比值越高，木质素就越容易被脱除(Humphreys et al.,2002)。通过改变木质素的组分，尤其是提高S/G比值，能使木材中的木质素较易于被脱除(Franke et al.,2000)。近年来，杨树中木质素单体组分比例的控制机理，已经成为该领域研究的热点。

　　木质素单体的聚合对于木质素大分子形成至关重要，而漆酶(Laccase，LAC)被认为可能参与这一过程。在拟南芥中的遗传研究发现，AtLAC4和AtLAC17双突变体细胞畸形，木质素含量比野生型降低40％，而AtLAC4，11和17三基因敲除突变体几乎完全抑制了木质素积累，植株生长严重受阻(Berthetet al.,2011；Chaoet al.,2013)。在杨树中下调表达PtLAC2和PtLAC3会导致杨树木质部纤维细胞变形，木质素含量减少(Ranochaet al.,2002；Bryan et al.,2016)。目前的研究表明漆酶参与植物细胞壁的形成，可能是木质素合成和单体组分调控机理研究的重要突破点，但其在木质素合成中的作用尚不明确。迄今为止，尚无通过CRISPR/Cas9技术编辑漆酶基因来改良木质素，提高细胞壁降解效率的报道。

　　发明内容

　　本发明所要解决的技术问题为：如何提供一个新的调控杨树S/G型木质素比例的基因及调控方法。

　　本发明的技术方案为：PtoLAC14基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

　　扩增PtoLAC14基因的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

　　PtoLAC14基因在调控杨树木质素上的应用。

　　进一步地，上述所述的调控杨树木质素是指调控G型木质素。

　　进一步地，上述所述的调控G型木质素是指降低杨树中G型木质素的含量。

　　进一步地，上述所述降低杨树中G型木质素的含量的方法为抑制表达PtoLAC14基因。

　　进一步地，上述所述抑制表达PtoLAC14基因的方法为通过CRISPR/Cas9对PtoLAC14基因进行编辑。

　　与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

　　本发明首次发现一个在毛白杨中特异调控G型木质素单体聚合的漆酶基因PtoLAC14。利用CRISPR/Cas9技术对毛白杨中PtoLAC14进行编辑，得到木质素总含量降低、G型木质素含量降低、木质素S/G比例增加的转基因植株，且转基因植株的细胞壁可降解性显著提高，从而降低了在造纸和生物能源生产时木质素的去除成本。本发明为植物的木质素遗传改良和定向分子育种奠定了基础，为植物基因工程提供了新的基因资源，具有广泛的应用前景。

　　附图说明

　　图1.PtoLAC14蛋白诱导纯化和酶活测定；

　　图2.CRISPR/Cas9编辑载体的构建示意图；

　　图3.CRISPR/Cas9编辑结果检测图；

　　图4.转基因植株茎杆的细胞壁木质素总含量、G型木质素含量和S/G比例；

　　图5.转基因植株茎杆的细胞壁降解转化为己糖的产量。

　　具体实施方式

　　下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

　　一、实施例1：PtoLAC14基因克隆

　　设计特异引物，以毛白杨cDNA为模板，PCR扩增，产物回收，测序，获得PtoLAC14的CDS序列，长度为1677bp。PtoLAC14的CDS序列如SEQ ID No.1所示。引物如下所示，

　　正向引物：ATGGAGTACGCTTGCTGGCTCC(SEQ ID No.2)；反向引物：TCAACATTTTGGAAGGTCGCTT(SEQ ID No.3)。

　　二、实施例2：PtoLAC14蛋白诱导纯化和酶活测定

　　1.构建PtoLAC14蛋白原核表达载体。本发明所用原核表达载体为pET32a+，原核诱导表达的大肠杆菌菌株为BL21。

　　2.PtoLAC14融合蛋白漆酶活性测定。本发明以ABTS为底物测定PtoLAC14融合蛋白的漆酶活性。

　　ABTS(2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)是一种专用于漆酶活力测定的人工合成化合物，被漆酶氧化后生成深绿色阳离子自由基ABTS+，420nm处ABTS+自由基的吸光系数远大于底物ABTS。随着ABTS+自由基浓度的增加，吸光度值变大。吸光度值在某一规定范围内变化时所经历的时间表示为漆酶的活力。反应体系为：100mM的醋酸盐缓冲液(pH值为5.0)，1mm的ABTS,适量的PtoLAC14融合蛋白，总体积为200μL，30℃反应。每隔一段时间用酶标仪在420nm处测定反应体系的吸光值。结果如附图1中A所示，IPTG诱导后PtoLAC14-pET32a融合蛋白对ABTS的催化活性显著增加，说明PtoLAC14具有漆酶活性。

　　3.PtoLAC14蛋白诱导和纯化。

　　⑴PtoLAC14蛋白诱导，具体步骤如下：

　　1)将重组表达质粒转入100μL(BL21)感受态细胞中，冰上静置30min，42℃90s，复苏1h，涂布于相应抗性的LB固体培养基平板培养；

　　2)挑取状态较好的单克隆菌落，接种到10mL含抗生素的LB液体培养基内进行扩大培养(200rpm，37℃)，然后进行菌液PCR检测；

　　3)取检测合格的菌液，接种到10mL相应抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养至OD600为0.6-0.8；

　　4)一组作为未诱导对照，收集菌体。另一组加入IPTG至终浓度为0.1mM，16℃诱导20h，诱导后的菌液收集菌体；

　　5)收集的菌体用适量的Binding buffer洗涤后，加入700μL Binding buffer重悬，转移至1.5mL离心管内；

　　6)重悬的菌体进行超声破碎，破碎时菌体置于冰水混合物内，破碎至液体为透亮乳白色即可；

　　8)4℃，12000rpm离心15min，取上清，转移至新的1.5mL离心管中，沉淀用相同体积的Binding buffer重悬；

　　9)上清和沉淀样品各取40μL分别加入10μL的5×Loading buffer，100℃5min处理；

　　10)样品离心，取上清液20μL进行SDS-PAGE电泳检测，蛋白胶用考马斯亮蓝染色，然后加入脱色液过夜脱色至条带清晰可看；

　　SDS-PAGE胶制备及电泳

　　1)根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶

　　2)分离胶(2块)配方：

　　按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，混匀。然后用异丙醇封住分离胶液面，在37℃凝结30～40min，至一条清亮的分界线，倾倒异丙醇层，用滤纸条将残余的异丙醇吸干；

　　3)浓缩胶(2块)配方

　　胶配好后混匀，灌胶，立即插入梳子，插梳子时根据上样量和浓缩胶长短选择梳子规格；

　　4)胶凝配好之后，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液没过点样孔，拔梳子，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极；

　　5)点样后，先用60V电压电泳30min，待蛋白进入分离胶后，使用70V电压电泳2-3h；根据目的蛋白的大小，可改变电泳时间；

　　6)当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h以上；

　　7)将凝胶用蒸馏水冲洗一遍，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明。

　　⑵PtoLAC14可溶蛋白的纯化

　　小量表达摸索出最佳诱导条件后，则根据最适条件进行大量表达，用镍亲和层析柱纯化。具体步骤如下：

　　1)收集的菌体用适量的Binding buffer重悬菌体，超声破碎，重悬后的菌体如果浓度太高，可以加入适量的Binding buffer稀释，破碎后的菌体低温高速离心，收集上清；

　　2)向装好的柱子内加入少量NiCl2，使胶鳌合更多的Ni离子；

　　3)清洗柱：5mL超纯水清洗2次；5mL 1.5M NaCl清洗3次；5mL 1M NaOH清洗2次；5mL1.5M NaCl清洗2次；5mL 1M HAC清洗2次；最后5mL超纯水清洗4次；

　　4)平衡柱：先用超纯水清洗柱子，上样前加入20mL Binding buffer平衡柱子；

　　5)上样：将收集的上清用5mL移液枪，轻轻沿柱壁加入到柱中，尽量不要冲散镍胶，控制好流速不要太快，使蛋白能充分挂柱；

　　6)洗脱：含有20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、500mM、1M咪唑的Binding buffer进行洗脱5-10个柱体积，每部分的洗脱液都要收集；

　　7)清洗柱，用超纯水冲洗后，填料保存在20％的乙醇中；

　　8)对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测，要检测的对象为：上清、流穿液、Bindingbuffer流穿液、各个浓度梯度咪唑洗脱液。

　　结果如附图1中B所示，PtoLAC14-His融合蛋白被诱导纯化，其大小约62KDa。

　　4.PtoLAC14蛋白对G和S型木质素单体的催化活性测定

　　研究表明，芥子醇(S型木质素前体)和松柏醇(G型木质素前体)在280nm处有最大吸收峰，因此分别以芥子醇和松柏醇为底物，用纯化的PtoLAC14蛋白对其催化，测定底物变化情况，计算Km值和米氏常数。结果如附图1中C和D所示，PtoLAC14蛋白对G单体的最大催化速度Vmax显著高于S单体的Vmax，且PtoLAC14蛋白对G单体的Km值显著小于对S单体的Km值的。这些结果表明PtoLAC14蛋白在催化木质素单体聚合成木质素时，更倾向于选择G单体作为催化的底物。

　　三、实施例3：CRISPR/Cas9编辑载体的构建

　　根据PtoLAC14的CDS序列，分别在第1和第3外显子处设计靶点，连到U3b，U3d启动子上，并依次连接至pYLCRISPR/Cas9-DH/B载体骨架上，引物如下所示，载体构建如附图2所示。

　　靶点一，正向引物：GTCACCCTGCTTTGGTCCAGTGCA(SEQ ID No.4)，反向引物：AAACTGCACTGGACCAAAGCAGGG(SEQ ID No.5)；

　　靶点二，正向引物：GTCAGCGTTTAGGCAAGACAACCA(SEQ ID No.6)，反向引物：AAACTGGTTGTCTTGCCTAAACGC(SEQ ID No.7)；

　　四、实施例4：毛白杨遗传转化

　　本研究中杨树遗传转化采用的材料为野生型毛白杨，采用农杆菌介导的叶盘浸染法进行毛白杨遗传转化。

　　1)农杆菌的培养

　　将含有重组质粒的农杆菌GV3101接种到YEP固体培养基(含有相应抗生素)上，28℃倒置培养；挑取单克隆菌接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养至OD600为0.6～0.8；按1：100的比例将一活菌液转到新鲜的YEP培养基中，28℃培养，至OD600为0.6～0.8，4℃离心，收集菌体，用30mL添加了乙酰丁香酮的WPM液体培养基重悬，放入28℃摇床中振荡培养1h。

　　2)农杆菌介导的叶盘浸染

　　取组培苗无菌叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5cm2大小的叶盘，放入已重悬好的农杆菌菌液中，浸染10min，每隔2～3min轻轻摇晃菌液，使叶盘被充分浸染。

　　3)毛白杨的共培养

　　将浸染过的叶盘，用灭过菌的镊子夹出，放在灭过菌的滤纸上，吸干菌液，将叶盘平铺在WPM共培养培养基上，在25℃条件下暗培养2d。

　　4)毛白杨的选择培养

　　共培养2d后，将转化过的外植体移到可诱导愈伤组织的选择培养基上，25℃条件下，避光培养3～5周，期间每5d左右更换一次新的选择培养基。

　　5)毛白杨诱导芽培养

　　当叶缘周围出现白色块状疏松愈伤组织时，在超净工作台上将愈伤组织移入WPM生芽培养基上，在25℃，光照培养约4～5周，每10d更换一次新的WPM生芽培养基。

　　6)毛白杨的生根培养

　　当不定芽长至约5cm时，将不定芽转入含有相应抗生素的WPM生根培养基中，诱导生根。

　　7)毛白杨的移栽

　　当幼苗根系比较发达时，将幼苗取出，冲洗掉根部的琼脂，移栽到温室中培养，并覆盖保鲜膜保温保湿。

　　WPM重悬液：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+100μmol AS)；

　　WPM共培养培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+100μmol AS+1.0mg NAA+2.0mg ZT)；

　　WPM选择培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+9mg Hyg+1.0mgNAA+2.0mg ZT+400mgCef)；

　　WPM生芽培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+9mg Hyg+0.1mg NAA+2.0mg ZT+400mgCef)；

　　WPM生根培养基：(WPM+30g蔗糖+9mg Hyg+0.1mg NAA+400mg Cef)；

　　YEP培养基(L)：酵母浸出液10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH为7.0，121℃高温高压灭菌20分钟。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10～12g。

　　LB培养基(L)：酵母浸出液为5g，蛋白胨为10g，NaCl为10g，pH＝7.0，121℃高温高压灭菌20min。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10～12g。

　　五、实施例5：转基因阳性苗的鉴定

　　为了筛选成功敲除的转基因株系，通过设计特异性引物对转基因材料中基因组DNA进行扩增，并测序分析。结果如附图3所示，在株系1和3中均有敲除现象发生，在株系1中第一个靶点被删除2个碱基，第二个靶点被删除了4个碱基；在株系3中第一个靶点发生4个碱基缺失，第2个靶点发生1个碱基的缺失，这些碱基的缺失都会导致基因的移码突变。

　　六、实施例6：转基因植株茎杆木质素总含量和单体含量的测定

　　1.木质素总含量测定

　　1)称取0.5000g烘干后的秸秆W1，每个样品3个重复，用滤纸包好，放入索氏提取器中用苯-乙醇(67:33，v/v)抽提4h，抽提后的粉末在通风橱中风干；

　　2)解开滤纸，将风干后材料完全转入250mL三角瓶中，加入10mL 72％(w/w)的浓硫酸，放入摇床，30℃120r/min震荡1.5h，然后加入200mL蒸馏水，120℃，水解1h；

　　3)将水解液用G3坩埚式过滤器过滤，蒸馏水洗冲洗三角瓶3次。残渣用蒸馏水洗至中性，将滤液定容至250mL(V)，此时硫酸浓度为2.88％；

　　4)将洗干净后的残渣和过滤器80℃干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温后，称重得W2(残渣+过滤器)；

　　5)将称重后的过滤器和残渣放入马氏炉中，200℃预热30min，然后575±25℃灰化4h，取出后干燥器中冷却30min，称重得W3(灰分+过滤器)；

　　6)酸不溶木质素的含量为：AIL％＝(W2-W3)×100/W1；

　　7)取步骤3所得滤液1mL，用2.88％的硫酸稀释10倍(视样品而定)，保证吸光度在0.2-0.7之间，稀释倍数记为D。紫外分光光度计比色，测定吸光值，光波长205nm，空白为2.88％的硫酸；

　　8)酸溶木质素的含量为：ASL％＝A×D×V/(1000×K×W1)×100；

　　A：吸收值

　　D：稀释倍数

　　V：滤液的总体积

　　K：酸溶木质素的吸收系数，取110

　　W1：样品质量

　　9)样品总木质素的含量为：Lignin(％)＝AIL(％)+ASL(％)

　　2.木质素单体含量测定

　　1)称取0.1000g秸秆粉末，每个样品称取3个重复，用苯/乙醇(67：33，v/v)抽提4h，后风干至恒重，得到细胞壁残留物(CWR)；

　　2)0.0500g CWR于25mL的聚四氟乙烯密封罐中，加入2mol/L NaOH溶液5mL，硝基苯0.5mL和1枚磁力转子。将密封罐放入不锈钢保护层中；

　　3)将整套装置密封，于170℃磁力搅拌锅中反应3.5h，从温度达到170℃时开始计时，转子的转速为15r/min；

　　4)反应完成后，将密封罐于自来水中迅速冷却。将罐中反应混合液完全转移至100mL磨口三角瓶中，密封罐用2mol/L NaOH溶液冲洗干净，直至清洗液为无色，全部冲洗液都收集于三角瓶中。每个三角瓶中加入200μL浓度为4mg/mL的乙基香兰素(用2mol/LNaOH溶解)，作为内标溶液；

　　5)用30mL二氯甲烷/乙酸乙酯的混合液(1：1，v/v)对反应液萃取3次，去掉过量的硝基苯及其衍生物，保留水相(保留上层)；

　　6)将水相用6mol/L盐酸调pH至3-4后，再次用30mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液(1：1，v/v)萃取3次。收集有机相(收集下层)，用旋转蒸发仪40℃旋转蒸发，得到固体残渣；

　　7)将残渣用5mL色谱甲醇重新溶解，溶解10min至充分溶解，用0.22μm孔径滤膜过滤，取滤液用HPLC进行检测；

　　8)HPLC检测木质素单体的条件为：

　　a)高校色谱柱类型：universal C18反相柱，4.6mm×250mm。

　　b)流动相：色谱甲醇/水/冰乙酸＝16：63：1。

　　木质素总含量和单体含量测定结果如附图4所示，与野生型对照相比，PtoLAC14敲除株系的木质素总含量和G型木质素单体含量均显著降低，而木质素S/G比例显著增加。

　　七、实施例7：转基因植株茎杆降解转化效率的测定

　　1.H2SO4预处理及酶解

　　1)称取秸秆粉末0.3000g于15mL离心管，加入10mL蒸馏水，50℃，150r/min，处理2h，3000×g离心5min，蒸馏水重复洗涤残渣3次，去掉可溶性糖；

　　2)加入6mL 4％(v/v)的H2SO4溶液，120℃，处理20min。样品冷却至室温后再50℃，150r/min，处理2h。每份样品3个重复；

　　3)处理完成后将样品3000×g离心5min，取预处理液1mL，稀释一定倍数，测定C6、C5糖含量；

　　4)将剩余上清液去掉，加入10mL蒸馏水洗涤，3000×g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣6次，最后检查pH，确保洗至中性；

　　5)残渣最后用10mL 0.2mol/L pH 4.8的醋酸缓冲液洗1次，然后加入3mL3.2g/L的纤维素复合酶溶液，用pH 4.8的醋酸缓冲液定容至6mL，最终酶浓度为1.6g/L。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1mL，稀释一定倍数，测定C6、C5糖含量。

　　2.NaOH预处理及酶解

　　1)称取秸秆粉末0.3000g于15mL离心管中，称取秸秆粉末0.3000g于15mL离心管，加入10mL蒸馏水，50℃，150r/min，处理2h，3000g离心5min，蒸馏水重复洗涤残渣3次，去掉可溶性糖；

　　2)加入6mL 4％(w/v)的NaOH溶液，50℃，150r/min，处理2h。每份样品3个重复；

　　3)处理完成后将样品3000×g离心5min，取预处理液1mL，稀释一定倍数，测定C6、C5糖含量；

　　4)将剩余上清液去掉，加入10mL蒸馏水洗涤，3000×g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣6次，最后检查pH，确保洗至中性；

　　5)残渣最后用10mL 0.2mol/L pH 4.8的醋酸缓冲液洗1次，然后加入3mL3.2g/L纤维素复合酶溶液，用pH 4.8的醋酸缓冲液定容至6mL，最终酶浓度为1.6g/L。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1mL，稀释一定倍数，测定C6、C5糖含量。

　　3.比色法测定C6、C5糖

　　⑴C6的测定

　　1)葡萄糖标准溶液配制

　　称取干燥至恒重的葡萄糖(glucose)100.00mg，加水溶解并定容至100mL，混匀，配成1.00mg/mL的标准溶液。

　　2)制作标准曲线

　　取1.00mg/mL葡萄糖标准溶液2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL，10.0mL于100mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃试管中，加入2.0mL蒽酮试剂(0.2g蒽酮溶于100.0mL浓硫酸)快速摇匀，在沸水中加热5min，自来水冷却，620nm比色。1.0mL的蒸馏水作空白样。

　　⑵C5的测定

　　1)木糖标准溶液配制

　　称取干燥至恒重的木糖(xylose)100.00mg，加水溶解并定容至100mL，混匀成1.00mg/mL的标准溶液。

　　2)制作标准曲线

　　取1.00mg/mL木糖标准溶液0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL于100mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.0mL于10mL具塞玻璃试管中，先加入134μLA试剂(A试剂配制方法为6g苔黑酚溶于100.0mL乙醇中)，再加入2.0mL B试剂(B试剂配制方法为0.1gFeCl3溶于100mL 37％浓盐酸中)混匀后，在沸水中加热20min，自来水冷却至室温，使用分光光度计于波长660nm处比色。使用1.0mL的蒸馏水作空白样。

　　3)将上述取得的上清，用蒸馏水稀释10倍后，取适当体积(少于1mL)稀释后样品，补水至1.0mL，按照上述制作标曲的方法比色(使读数处于0.2-0.8之间)。

　　结果显示，在整个酶解过程中(12h-96h)，PtoLAC14-KO植株茎杆细胞壁的糖化效率均显著高于野生型，约增加6％-10％。NaOH预处理的趋势与H2SO4处理相似，即PtoLAC14-KO植株的糖化效率也显著高于野生型，约增加12％-16％(附图5中A和B)。为了进一步分析PtoLAC14对木材利用效率的影响，在H2SO4和NaOH处理，纤维素酶水解后，烘干测定样品的剩余质量。结果如附图5中C和D所示，从图中可以看出，在H2SO4和NaOH预处理处理后，与野生型相比，PtoLAC14-KO转基因植株消耗的质量显著增加，说明在预处理酶解过程中更多的木材被降解利用。这些结果说明PtoLAC14敲除可以增加木材细胞壁转化为糖的产量，增加木材利用效率。

　　序列表

　　<110> 西南大学

　　<120> 利用漆酶PtoLAC14调控S/G型木质素比例并提高细胞壁降解转化效率的方法

　　<160> 7

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1677

　　<212> DNA

　　<213> Populus tomentosa Carr

　　<400> 1

　　atggagtacg cttgctggct ccgatttatg cttcttgctg tctgcctctt ccctgctttg 60

　　gtccagtgca gggttcggca ttacaaattt aatgtggtga tgaaaaatac taccagacta 120

　　tgctctagga agccgattgt taccgtcaat ggccgcttcc caggacccac tctgtatgcc 180

　　agagaagacg atacagttct tgtaaaagtt gttaaccatg tcaaatataa tgtttctatt 240

　　cactggcatg gcattaggca actaagaacg ggctgggctg atggaccagc atacattaca 300

　　caatgcccca ttcagccagg gcaaagctat gtctacaatt tcacaatcac tggtcagagg 360

　　ggcacacttc tttggcacgc acatattctc tggctaaggg ccacagttca tggtgccatg 420

　　gttgtcttgc ctaaacgcgg catcccctac ccattcccag gtcctcataa agaagtggtt 480

　　gttgtattag ctgaatggtg gaaatcagat actgaagctg tgatcaacga ggctcttaaa 540

　　tctggattag ctccaaatgt ctctgatgct cacacaatta atggccatcc aggagctgtc 600

　　tcaacttgtt cttcacaggg cggtttcaca ttgccagtca aaagtggcga gacctacatg 660

　　ctacggttga tcaatgcagc actcaatgaa gagctcttct tcaaaattgc agggcataag 720

　　cttacagtcg tcgaagttga tgccacctat gttaaaccat tcaaaaccga tacagtccta 780

　　attgccccag gccagaccac caatgtcctt gtcacaacta acaaaaatac aggcaagtac 840

　　ttggttgctg cctccccgtt catggattct ccaattgctg tggacaacat gacagcaaca 900

　　gccactttgc agtattcagg agcacttgct aactccccta caactctcac caccccacct 960

　　ccaaagaatg ccactgcagt tgccaaccaa tttaccaact ctctacgcag ccttaactca 1020

　　agaagatttc ctgccaaagt cccattgaac gttgatcaca accttttctt tacagttagt 1080

　　ctaggagtta acccatgtcc aagttgcaaa gctggtaatg gcagcagggt tgttgctagt 1140

　　attaacaatg tcacatttgt gatgccaacc actgccctgc tccaagcaca tttcctcaac 1200

　　atcagcggtg tgttcaccac tgattttcct gcaaagccac cgcatgtttt caattacact 1260

　　ggcactccac ctacaaattt acagaccaaa agtggaacta aagtttatag gctgagctac 1320

　　aactcgacag tccaacttgt tatgcaagat actggtatca tatcccctga gaaccatccg 1380

　　atccatttac atggattcaa tttctttgct gtcggtaggg gagtagggaa ttacaatccg 1440

　　aagactgata ctaagaagtt taacctcgtt gatcctgttg aacggaacac aattggagta 1500

　　ccttctggtg gatgggtggc gataagattt cgcgccgata atccaggagt ttggttcatg 1560

　　cattgccatc tagaggtgca cactacatgg ggacttaaga tggcgttctt ggtagacaat 1620

　　ggcaaaggcc ctaaggagtc tcttctaccg ccgccaagcg accttccaaa atgttga 1677

　　<210> 2

　　<211> 22

　　<212> DNA