一种肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的构建方法
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的构建方法。
背景技术
变应性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)是影响健康的全球性疾病，其发病率高达40％，并呈逐年增加的趋势。中医学认为AR的发生是在肺、脾、肾三脏的虚损基础之上，感受风寒异气、鼻窍受邪所致。现代文献报道肺、脾气虚证是AR临床常见证型。古今医家均认为AR虽为肺窍之病，但与脾虚最为密切相关，如《素问》中记载“脾为孤脏……其不及，则令人九窍不通”。肺五行属“金”，脾五行属“土”，“土生金”，病理上可出现脾土虚弱导致肺亦虚弱的相生异常，如《脾胃论》曰：“肺金受邪，由脾胃弱不能生肺乃所生病也”。他们治疗AR都常用“培土生金、健脾益肺”之法。本发明人在AR中医临床循证医学项目研究发现：《中华医典》和现代文献提到最多的治疗AR方药分别是“补中益气汤”和“玉屏风散”，两方均是“培土生金、健脾益肺”法，上述内容反证了“肺脾气虚”是AR的常见证型。
构建合适的中医病证结合的动物模型对完善中医理论和发展中医临床具有重要意义。近年来国内许多学者采用不同途径和不同思路构建了一些证候相关动物模型，包括肺气虚、脾气虚等AR动物模型，目前尚无肺脾气虚复合证型的AR模型的报道，且证候造模和疾病造模思路不统一。烟熏法是目前肺气虚证实验中使用最多的造模方法，但烟熏设备、烟熏时间、烟熏量各有不同，目前市场上现有烟熏设备造价昂贵，一般实验室都没有配置；而自制烟熏箱的箱内烟雾浓度、温度和通风处理是制备AR模型的关键问题。运用番泻叶冷浸液灌胃是一种简单易行的制作脾气虚的方法，但现有技术中使用番泻叶的浓度有所差异。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：采用烟熏和番泻叶灌胃相结合的方法对模型组动物进行造模，得到肺脾气虚复合证型的动物模型；
步骤2：用卵清蛋白与氢氧化铝混悬液对步骤1所得的肺脾气虚复合证型的动物模型进行腹腔注射；然后采用卵清蛋白对其进行鼻腔滴注，得到肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型；
步骤3：对所得的肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型进行验证。
优选地，所述步骤1烟熏的具体步骤如下：将动物置于烟熏箱内，每次使用8支香烟，熏20min，然后通风休息10min，连续熏3次，每天动物烟熏时间共为1h，烟熏造模周期60天。
优选地，所述步骤1番泻叶灌胃的具体步骤如下：从烟熏第31天开始灌胃，按照1ml/100g体质量灌胃给药，每日1次，灌胃造模周期为30天。
优选地，所述步骤1番泻叶的制备方法如下：将番泻叶投入沸水中浸泡1h，滤出药液后存放于4℃冰箱备用，其中所述番泻叶与水的比例为1∶10。
优选地，所述步骤2卵清蛋白与氢氧化铝混悬液进行腹腔注射的具体步骤如下：将卵清蛋白与氢氧化铝制成混悬液，从烟熏第40天开始进行腹腔注射，隔日1次，共7次，腹腔注射造模周期：14天。
优选地，所述卵清蛋白与氢氧化铝混悬液的制备方法如下：0.3mg卵清蛋白和30mg氢氧化铝加入1ml生理盐水中制成混悬液。
优选地，所述步骤2烟熏第54天开始以10％的卵清蛋白生理盐水滴双侧鼻腔，每次每侧鼻腔滴20μl，每日1次，连续7天。
优选地，在所述以卵清蛋白生理盐水滴鼻之前还包括卵清蛋白与氢氧化铝混悬液腹腔注射的基础致敏。
优选地，所述步骤3验证的方法包括：摄食量、体质量、鼻部症状评分、负重游泳时间、ELISA检测血清IgE水平以及HE染色鼻黏膜病理切片。
优选地，所述动物模型中采用的动物为SD大鼠。
本发明还提供一种用于构建肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的烟熏箱，储物箱(1)和烟熏配件(3)；所述烟熏配件包括带有烟囱(31)的柱体(32)和底座(33)；所述烟囱(31)位于所述柱体(32)的顶部，与顶部相连通；所述柱体底部开口，不封闭，在所述柱体靠近底部的侧面设有通风孔(34)；所述底座(33)顶部开口，底部封闭，所述柱体(32)嵌套于底座(33)上。
优选地，所述烟熏配件(3)为不锈钢材质；所述柱体(32)和底座(33)为圆柱形；所述位于柱体侧面的通风孔(34)为方形；所述储物箱(1)为塑料材质，尺寸为60cm(长)×40cm(宽)×35cm(高)；所述圆柱形不锈钢柱体(32)的直径为7cm，高为18cm；所述烟囱(31)的直径为2cm，高为2cm；所述方形孔(34)的大小为4cm×3.5cm。
本发明的有益效果：本发明中的病证结合动物模型是肺脾气虚复合证型的变应性鼻炎动物模型，采用的动物种鼠为SD大鼠，证候模型和疾病模型同期创建，采用自制烟熏箱放置到实验室的通风橱中，基于内外因同时致病，物理和化学因素相结合，多因素造模，并将各类造模因素、时间量化，采用验证指标包括摄食量、体质量、负重游泳时间、鼻部症状评分、血清IgE水平和鼻黏膜病理切片，通过反复实验验证，动物模型造模死亡率低，能进行大批量操作，能较好地模拟出肺脾气虚复合证型AR的症状表现，具有标准化、可复制性等优点。本发明中的烟熏设备简单易复制，价格便宜，采用市场上的透明塑料储物箱和自制不锈钢小配件即可。
附图说明
图1为使用本发明烟熏装置的流程图。
图2为本发明肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型造模流程图。
图3为ABC三组体质量变化趋势图。
图4为ABC三组摄食量变化趋势图。
图5为ABC三组负重游泳实验时间对比图。
图6为ABC三组血清IgE水平对比图。
图7为A组HE染色结果图。
图8为B组HE染色结果图。
图9为C组HE染色结果图。
图10为本发明自制烟熏箱示意图。
图11为本发明整体结构示意图。
图12为本发明烟熏配件结构示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
主要造模设备和试剂：本发明烟熏箱包括塑料储物箱(大小为长60cm×宽40cm×高35cm)和圆柱形带小烟囱的不锈钢小配件(直径为7cm，高为18cm，见附图10)。通风橱(Eustace公司)，卵清蛋白(OVA等级V，Sigma公司)，氢氧化铝干粉(Sigma公司)，大前门牌香烟，番泻叶(康美公司)。
实施例1
本实施例提供一种用于构建肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型的烟熏箱，包括储物箱(1)和烟熏配件(3)；所述烟熏配件包括带有烟囱(31)的柱体(32)和底座(33)；所述烟囱(31)位于所述柱体(32)的顶部，与顶部相连通；所述柱体底部开口，不封闭，在所述柱体靠近底部的侧面设有通风孔(34)；所述底座(33)顶部开口，底部封闭，所述柱体(32)嵌套于底座(33)上(图12)。
本实施例中所述烟熏配件为不锈钢材质；所述柱体和底座为圆柱形；所述位于柱体侧面的通风孔为方形；所述储物箱为塑料材质，尺寸为60cm(长)×40cm(宽)×35cm(高)，所述圆柱形不锈钢柱体的直径为7cm，高为18cm；所述烟囱的直径为2cm，高为2cm；所述方形孔的大小为4cm×3.5cm。
烟熏过程(图1)：①打开塑料储物箱箱盖(1)，将装有大鼠的笼子(2)(46.4cm(长)×30cm(宽)×18cm(高))整笼(6只大鼠)置入塑料储物箱一角(最多可放2笼大鼠)，并在对角位置放置烟熏配件(3)。将圆柱形不锈钢底座(33)顶部向上置于塑料箱内；(图11)②打开实验室通风橱透明视窗，将装有大鼠的塑料储物箱(1)放置到实验室的通风橱台面中；③以橡皮筋将8根香烟捆成底部同一水平的圆柱状，橡皮筋捆绑部位位于香烟过滤嘴，随后将8根香烟点燃并立置于圆柱形不锈钢底座中央；④将带有烟囱(31)的圆柱形不锈钢柱体(32)嵌入圆柱形不锈钢底座(33)；保证柱体(32)靠近底部侧面的方形孔(34)通风，以保证香烟在不锈钢配件内充分燃烧。盖上塑料储物箱箱盖(不扣紧)，关闭通风橱透明视窗；烟熏时通风设备关闭，烟熏20分钟；⑤20分钟烟熏结束后开启通风设备，抽净烟雾，并拉起通风橱透明视窗，打开塑料储物箱箱盖，取出带有烟囱的圆柱形不锈钢柱体，清除烟蒂，通风10分钟；⑥进行同批大鼠的第二次烟熏。烟熏过程和时间同上，烟熏20分钟后又开启通风设备，通风10分钟后进行同批大鼠的第三次烟熏。肺脾气虚模型组AR大鼠每天烟熏时间共60分钟。
实施例2构建肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型
步骤1：采用烟熏和番泻叶灌胃相结合的方法构建肺脾气虚复合证型大鼠，具体步骤如下：
1)SD大鼠检疫3天后，将其置于鼠笼后放入自制烟熏箱内，烟熏箱放置到实验室通风橱内(储物箱盖子盖上，但不扣紧密封)，每次8支香烟，熏20min，然后通风休息10min，连续熏3次，每天大鼠烟熏时间共为1h，共用使用24支香烟，烟熏造模周期共为60天。
2)从烟熏第31天开始灌胃，将番泻叶投入沸水中浸泡1h(以10ml水中放入1g(0.1g/ml)番泻叶的比例)，滤出药液后存放于4℃冰箱备用。大鼠按照1ml/100g体质量灌胃给药，每日1次。灌胃造模周期为30天。
步骤2：采用卵清蛋白与氢氧化铝混悬液腹腔注射和卵清蛋白鼻腔滴注的方法构建变应性鼻炎动物模型，具体步骤如下：
1)从烟熏第40天开始腹腔注射，取卵清蛋白(OVA等级V，Sigma公司)，0.3mg和氢氧化铝干粉(Sigma公司)30mg同时加入到1ml的生理盐水中制成混悬液(此为一只大鼠用量)，然后对步骤1制备的大鼠进行腹腔注射以基础致敏，隔日1次，共7次。腹腔注射造模周期为14天。
2)从烟熏第54天开始进行滴鼻，以10％的卵清蛋白生理盐水滴双侧鼻腔，每次每侧鼻腔滴20μl，每日1次，连续7天。
步骤3：对构建的肺脾气虚证变应性鼻炎病证结合动物模型进行验证
将上述构建的肺脾气虚证变应性鼻炎组大鼠(下文简称A组)、变应性鼻炎大鼠(下文简称B组)以及空白对照组(下文简称C组)进行比较，验证本发明构建获得的肺脾气虚证变应性鼻炎组大鼠(A组)所具备病理症状，比较结果如下：
1、一般情况和鼻部症状
A组出现喷嚏、挠鼻频繁、流涕，伴有气急、活动减少、毛发蓬乱发黄无泽、易掉落、精神萎靡倦怠、饮食量减少、喜蜷缩聚堆和便溏等肺脾气虚症状；B组可见喷嚏、挠鼻明显、流涕，偶有一过性便溏；C组偶见挠鼻，余无阳性症状体征。各组鼻部症状评分见表1。与C组比较，A组和B组大鼠的鼻部症状评分有统计学意义(P＜0.05)，但A组和B组比较无统计学意义(P＞0.05)。
表1鼻部症状评分(
*P＜0.05
2、造模后体质量比较
A、B、C三组间比较具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较，A组与B、C组比较有统计学意义(P＜0.05)，B组与C组比较无统计学意义(P＞0.05)(表2)。从体质量变化趋势图可以看出，A组大鼠体质量增长较B、C组慢(图3)。
表2体质量比较(
*P＜0.05
3、摄食量
造模后摄食量比较，三组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较，A组与B、C组比较有统计学意义(P＜0.05)，B组与C组比较无统计学意义(P＞0.05)(表3)。从摄食量变化趋势图可以看出，A组大鼠摄食量较B、C组少(图4)。
表3摄食量比较(
*P＜0.05
4、负重游泳实验
A组游泳时间短于B、C组(图5)。经计算，三组间比较具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较，A组与B、C组比较有统计学意义(P＜0.05)，B组与C组比较无统计学意义(P＞0.05)。提示A组大鼠出现气虚表现。
5、血清IgE水平
A、B两组的血清IgE水平均升高，与文献(杨利桃，变应性鼻炎患者血清总IgE和特异性IgE分析；张茂华，变应性鼻炎血清总IgE水平测定及临床意义；张建辉，血清总IgE、INF-γ、IL-4作为变应性鼻炎动物模型建立的客观评价指标初探；李佳锋，变应性鼻炎大鼠动物模型的建立及评价)报道的变应性疾病机体(包括人体和动物)血清IgE升高相一致。提示变应性鼻炎大鼠模型建立成功。A、B、C三组间比较具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较，C组与A、B组的差异有统计学意义(P＜0.05)，A组与B组的差异无统计学意义(P＞0.05)(图6)。
6、鼻黏膜病理HE染色
A组(图7)、B组(图8)均可见鼻黏膜纤毛脱落，排列紊乱，腺体增多，局部炎性细胞浸润；C组(图9)鼻黏膜纤毛整齐，完整，无炎性细胞浸润。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
