一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体与应用。
背景技术
香蕉，主要种植在热带地区，是世界贸易量最大的水果，也是联合国粮农组织认定的发展中国家继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。我国是世界第二大香蕉生产国，也是全球香蕉的主要消费国，如今香蕉已经成为我国热带亚热带地区农业支柱性产业之一。然而，被人们称为“香蕉癌症”的香蕉枯萎病正严重威胁着世界香蕉产业的发展，造成的损失已超过4亿美元，制约着全球范围内的香蕉生产与贸易。
香蕉枯萎病又称香蕉黄叶病，起源于东南亚，1910年在中南美洲的巴拿马大流行，因此又被称为巴拿马病(Panama Disease)，其蔓延快，根治难。香蕉枯萎病已在世界范围内的香蕉产区蔓延，少有地区能够幸免，并且还在不断蔓延至未发病的香蕉种植地区。我国香蕉枯萎病的研究大多集中在南方，针对其病原菌致病机理的研究相对滞后，物理化学防治效果不佳。近年来研究人员在动植物体内发现microRNA(miRNA，长度约22nt的内源性非编码小RNA)是重要的转录后调控因子，通过与靶基因编码区或5’和3’非翻译区结合对靶基因进行切割从而抑制靶基因的翻译，参与多种生物学过程。在真菌中，也存在与动植物miRNA结构相似的非编码小RNA，被称之为microRNA-like RNA(milRNA)。在粗糙脉孢菌中，已报道至少存在4种类型的milRNAs，其中一种milRNA与Argonaute(AGO)蛋白(在香蕉枯萎病菌中由FoQDE2基因编码)密切相关，其合成不需要Dicer酶切割，但依赖AGO的催化活性，AGO取代了Dicer加工milRNA前体并去除非功能链，最后产生成熟miRNA。课题组前期研究结果表明，与野生型菌株相比，香蕉枯萎病菌FoQDE2基因敲除突变体的致病力显著降低(林漪莲.香蕉枯萎病菌miRNA合成相关基因FoQDE2的鉴定和功能分析[D].广州:华南农业大学，2018.)。为了进一步探究FoQDE2基因敲除突变体致病力下降的原因，我们通过高通量测序的方法寻找依赖FoQDE2合成的milRNA，试图通过分析鉴定milRNA的功能解析其在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用机制。而且香蕉枯萎病菌致病相关milRNA的鉴定及功能解析不仅为香蕉枯萎病防控提供了新的作用靶点，还为深入研究milRNA在香蕉枯萎病菌中的作用机制奠定基础，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，其生物合成与Argonaute蛋白密切相关。
本发明的另一目的在于提供上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的前体。
本发明的再一目的在于提供上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs，包括由同一前体产生的两个milRNA：milR109和milR123。
所述的milR109的核苷酸序列如下所示：
ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA。
所述的milR123的核苷酸序列如下所示：
ACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCG。
上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的前体，核苷酸序列如下所示：CTCGGGCCCTGGTTGCGTTGGAGTCACAGCTCGTCCGATTGTGCGAGATCTGCACTGTATGTCTTGGTATGAACGGGGTTCATATCATTGCATACAGTGTCGAACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCGACACCAACGCAACCAGGACTTTGATGGCCTTCGCACACTTGACACACCACACACACTCACTCTCTCTTTATCGCACTCATTGAAATGCCTGGGAGGATTGACTTGACTTGACTTGATTTGGCTTGGACTTGGACTT。
上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
所述的milRNA及其前体缺失能够使香蕉枯萎病菌致病力下降。
上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体在防治香蕉枯萎病中的应用。
所述的香蕉枯萎病由香蕉枯萎病菌导致。
上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs及其前体作为植物病害防治药物的靶标的应用。
所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，通过阻断或抑制香蕉枯萎病菌中上述香蕉枯萎病菌致病相关milRNAs的表达。
阻断或抑制香蕉枯萎病菌中致病相关milRNAs的表达的药剂在制备药物中的应用。
所述的药物用于防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
所述的香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense，FOC)4号生理小种。
所述的尖孢镰刀菌古巴专化型的野生型菌株名称为XJZ2。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过扩增香蕉枯萎病菌致病相关的milR109和milR123前体两侧的同源片段，同时融合潮霉素磷酸转移酶基因，构建milR109和milR123前体缺失突变体。试验证明，相比野生型菌株XJZ2，缺失突变体的致病力显著降低；侵染寄主后的香蕉枯萎病菌中milR109和milR123显著提高。本发明证实了milRNAs是香蕉枯萎病菌具有致病力所必需的，有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病机制，为开发杀菌剂提供靶标。
附图说明
图1为实施例1中，测序处理并分析筛选得到的sRNA表达差异统计图；其中，以y轴(FoQDE2基因缺失突变体中sRNA表达量)与x轴(XJZ2中sRNA表达量)的比值做散点图分析，在直线y＝x以上的圆点表示在FoQDE2基因缺失突变体中表达量上调，以下表示在FoQDE2基因缺失突变体中表达量下调。
图2为实施例1中，测序处理并分析筛选得到的sRNA长度统计结果与开头碱基偏好性统计图；其中，a为测序分析结果中16-40nt reads分布情况；b为开头碱基占比情况；c为20-24nt开头碱基占比情况。
图3为预测的milRNAs(milR109和milR123)前体二级结构图。
图4为实施例3中milRNAs定量检测结果图；其中，a为milRNAs在其合成相关通路基因缺失突变体菌株中的表达量检测情况；b为接种寄主后侵染36h后milRNAs的表达情况。
图5为实施例4milRNAs序列RT-PCR结果电泳图。
图6为实施例5前体敲除突变体的PCR验证结果图；其中，引物HPH-F/HPH-R验证结果：泳道1-3为敲除突变体ΔmilR109-6、ΔmilR109-8、ΔmilR109-10，片段大小均为518bp，4为阳性对照XJZ2，5为清水阴性对照；引物milR109-JCF1/HPH-R验证结果：泳道1-3分别为敲除突变体ΔmilR109-6、ΔmilR109-8、ΔmilR109-10，片段大小均为3715bp，4为阳性对照XJZ2，5为清水阴性对照；引物milR109-JCF1/94验证结果：泳道1-3分别敲除突变体ΔmilR109-6、ΔmilR109-8、ΔmilR109-10，片段大小均为2941bp，4为阳性对照XJZ2，5为清水阴性对照。
图7为实施例5前体缺失型突变体中milR109和milR123的相对表达量检测结果图；其中，使用t text(双尾，等方差双样本检验)分析差异，**代表差异极显著(p<0.01)。
图8为实施例6milR109/123前体缺失突变体和野生型对巴西蕉组培苗的侵染情况照片图。
图9为实施例6milR109/123前体缺失突变体和野生型对巴西蕉组培苗的致病力结果统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1小分子RNA的测序与生物信息学分析
以纯培养条件下尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC)4号生理小种野生型菌株(XJZ2)和Argonaute蛋白编码基因FoQDE2缺失突变体(ΔFoQDE2)(王鸿飞.香蕉枯萎病菌miRNA合成相关基因的鉴定和功能分析[D].广州:华南农业大学，2015:13-18.)菌株为样本进行高通量小分子RNA(small RNA,sRNA)测序，首先使用TianGen公司的Trizol试剂提取样本的总RNA，将RNA质量合格的样品(RIN值>9.0)作为测序样品交由诺禾致源公司完成测序。
对测序所得小分子RNA数据进行生物信息学分析。在拿到公司的测序数据后，首先对测序所得的序列进行处理：去除污染、低质量及长度小于16nt或大于40nt的序列，所得的序列称为净序列(clean data)，然后再去除未比对到香蕉枯萎病菌全基因组的序列，结果如表1所示；接着将其余sRNA序列按照其来源进一步分类注释，结果如表2所示；对基因内含子(intron)、非编码区(3’/5’UTR)以及基因间隔区的sRNA序列进一步进行表达量分析。sRNA的表达量以TPM值(Transcripts Per Million)来表示。
TPM的计算公式为：
公式中，N为比对到某基因或转录本的读段数，L为该基因或转录本的片段长度。
采用算法log2(TPM(sample2)/TPM(sample1))对上述数据进一步分析，当|log2(TPM(sample2)/TPM(sample1))|>1且p-Value<0.05时，说明该处的sRNA在样品1与样品2的表达差异显著。根据上述筛选方法，我们在香蕉枯萎病菌ΔFoQDE2突变体中得到178条差异表达的sRNA，其中显著下调156条，显著上调22条，统计结果如图1所示。
表1 sRNA测序结果及数据分析
表2 sRNA测序数据分类注释
通过sRNA长度统计与开头碱基偏好性分析，发现ΔFoQDE2突变体中，长度介于20-24nt的sRNA序列数要明显比野生型菌株的少，且这个大小的sRNA序列大多以U和A碱基开头(图2)。
进一步对香蕉枯萎病菌ΔFoQDE2突变体中显著下调156条sRNA进行前体二级结构预测，得到茎环结构较好的milRNAs，其中两个我们命名为milR109和milR123，序列分别为：ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA(SEQ ID No.1)、ACTTGCACACTCGTTCGAGCTGCG(SEQ ID No.2)。二者共用一个前体，前体序列(SEQ ID No.3)、位置情况及二级结构预测如图3所示。
实施例2总RNA的提取
1.纯培养条件下菌株总RNA提取(Trizol法，TianGen公司Trizol试剂)
(1)将纯培养的野生型菌株(李敏慧等，2007)和实施例1的FoQDE2基因缺失突变体ΔFoQDE2在PDA平板上28℃培养5d，用打孔器(d＝5mm)在菌落边缘处取生长一致的菌碟，接种于提前倒好100mL PD培养基的三角瓶中，28℃、180rpm摇床中振荡培养2d，过滤收集菌丝进行液氮冷冻处理。
(2)称取100mg左右冻干菌丝放入提前进行灭菌处理后的研钵中，加入液氮研磨至菌丝变为均匀的粉末状，迅速放入2mL去RNase的离心管中，并一同加入1mL的Trizol以及20μL巯基乙醇，涡旋使其均匀分布以便充分裂解，室温静置5-10min。
(3)加入200mL氯仿，涡旋15s，冰上静置10min，12000rpm、4℃离心10min。
(4)取上清液重复步骤(3)。
(5)取上清液约500μL，加入新的1.5mL去RNase离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置15min，12000rpm、4℃离心15min。
(6)弃上清，加入1mL-20℃预冷的75％无水乙醇，清洗沉淀，12000rpm、4℃离心5min。
(7)倒掉洗液，重复步骤(6)。
(8)弃上清，将残留液体吸出，置于室温下自然风干沉淀。
(9)加DEPC水30-60μL，充分溶解RNA沉淀，置于-80℃保存。
2.CTAB法提取侵染寄主后的菌株总RNA
(1)将野生型菌株在PDA平板上28℃培养5d，用打孔器(d＝5mm)在菌落边缘处取生长一致的菌碟，接种于提前倒好100mL YPD的三角瓶中28℃、180rpm摇床中摇菌培养2d，过滤收集孢子。
(2)将收集的孢子用MM液体培养基制成孢子悬浮液(孢子浓度约为106个/mL)，将生长到4-5片叶的巴西蕉苗浸泡在孢子悬浮液中，于28℃、80rpm摇床中光照培养36h，收集有密集菌丝附着的香蕉根并用液氮急速冷冻。
(3)称取100mg香蕉根放入灭菌的研钵中，加液氮研磨成均匀的粉末状，迅速转移到15mL去RNase的离心管中，并一同加入5mL的2％(w/v)CTAB缓冲液以及100μL巯基乙醇，涡旋混匀，65℃水浴加热裂解10min，8000rpm、4℃离心15min。
(4)取上清液转移至去RNase的2mL离心管，加入1/3体积5M的KAc溶液，上下颠倒混匀后冰浴30min，再加入700μL氯仿和异戊醇的混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，混匀后12000rpm、4℃离心10min。
(5)取上清液于去RNase的2mL离心管，加入500μL水饱和酚，混匀后加入500μL氯仿和异戊醇的混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋混匀，12000rpm、4℃离心10min。
(6)取上清液于去RNase的2mL离心管，加入等体积氯仿和异戊醇的混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，混匀，12000rpm、4℃离心10min。
(7)取上清液于去RNase的2mL离心管，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后冰浴40min，12000rpm、4℃离心10min。
(8)弃上清加1mL-20℃预冷的75％(v/v)无水乙醇，反复吸打充分清洗沉淀，12000rpm、4℃离心5min。
(9)弃上清，重复上述步骤(8)清洗沉淀。
(10)弃上清，室温下风干沉淀，加入30-60μL的DEPC水，充分溶解沉淀，置于-80℃保存。
实施例3目标milRNAs的表达量检测
分别以纯培养条件下香蕉枯萎病菌野生型菌株XJZ2和FoQDE2基因缺失突变体ΔFoQDE2的总RNA，以及培养条件下和接种寄主香蕉苗36h后的野生型菌株XJZ2的总RNA(以上总RNA为实施例2中得到)为模板，对其中目标milRNA表达进行检测。采用GeneCopoeia公司的All-in-OneTM miRNA qRT-PCR检测试剂盒来检测目标milRNAs的表达。
1.milRNA的反转录
以上述样品的RNA为模板，首先在Poly A聚合酶的作用下，对milRNAs的3’末端加多聚A尾(PolyA)，然后使用试剂盒提供的Oligo-dT接头引物在逆转录酶的作用下生成milRNAs对应的第一链cDNA。
2.milRNA的表达量检测
分别以步骤1中反转录得到的cDNA为模板，根据目标milRNAs的序列设计的特异性引物和试剂盒提供的接头引物进行定量PCR，(milR109特异性引物:ACAGCTCGTCCGATTGTGCGA；milR123的特异性引物:CTTGCACACTCGTTCGAGCT)，以snRNA U4(检测引物:GGGAATTTTTGGAACTCTTT)为内参，并利用2-ΔΔCt法进行表达量分析。
经检测，结果如图4显示，相比野生型菌株，突变体ΔFoQDE2中milR109和milR123表达量均显著下调；而接种36h后，milR109和milR123表达量均比纯培养状态下明显升高。sRNA测序和qRT-PCR检测结果均说明milR109和milR123的合成依赖FoQDE2基因的功能，且与致病有一定的相关性。
实施例4milR109和milR123的克隆测序
为检测目标milRNAs milR109和milR123的片段大小，提取野生型菌株总RNA(方法同实施例2步骤1)，质量检测合格后反转录为cDNA(方法同实施例3步骤1)，并将其作为模板，以ddH2O为阴性对照，分别用引物milR109、milR123(引物序列同定量PCR检测所用)和接头引物扩增目的条带，电泳检测如图5所示。经过切胶回收、大肠杆菌转化后测序，结果显示milR109、milR123的长度分别为21nt和24nt，均以A开头，属于比较典型的milRNAs。
实施例5milR109和milR123前体缺失突变体的构建及验证
采用split marker同源重组的方法，构建含有抗性基因的同源片段代替目标片段来实现目标milRNA的敲除，具体操作如下：
A.目标milRNA左右同源臂序列扩增与融合
采用split marker同源重组的方法，分别扩增目标milRNA前体两侧的同源片段同时融合潮霉素基因，构建含有抗性基因的同源片段代替目标片段，PCR扩增过程如下：
PCR第一轮扩增，使用特异性引物milR109-P1/P2、milR109-P3/P4与通用引物M13F+226、M13F+225(详见引物表3)，高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vazyme)分别以野生型菌株DNA与pDAN载体(L,MH et al.2014.Functionalcharacterization of the gene FoOCH1 encoding a putativeα-1,6-mannosyltransferase in Fusarium oxysporum f.sp cubense[J].Fungal Genetics andBiology.65,1-13.)为模板扩增目标milRNA前体左右侧臂与潮霉素基因左右臂片段，体系如下：
程序为：预变性95℃、3min；变性95℃、15s，退火56℃、15s，延伸72℃、90s，30个循环；最后再72℃延伸5min。
PCR第二轮扩增(融合)，通过切胶回收或PCR产物纯化方法，得到纯化后的PCR产物，以其为模板，使用高保真KOD FX Polymerase(TOYOBO)进行扩增。
程序：预变性94℃、2min；变性98℃、10s，退火延伸68℃，1min/kb，进行34个循环；最后延伸7min。
B.原生质体的制备
(1)取28℃活化培养3d的XJZ2菌株，用灭菌打孔器(d＝5mm)打菌碟于菌落边缘处，转接新的PDA培养基，28℃培养6-7d。
(2)用ddH2O刷洗平板，并用灭菌毛笔轻轻扫下孢子，以悬浮液终浓度106-108个/mL接种于100mL PD液体培养基，28℃、180rpm培养8-9h(勿超过10h)，显微镜镜检。
(3)收集刚萌生出孢子的幼嫩菌丝，4℃，3500rmp离心10min弃上清，富集；或使用4-6层擦镜纸过滤收集紧密团状菌丝。
(4)用0.75M等渗NaCl溶液清洗至少2次。
(5)准备酶解液：将两种酶(崩溃酶：Lysing Enzymes＝1:1)以终浓度10mg/mL溶解于0.75M NaCl溶液中，离心除去杂质。
(6)将收集到的菌丝置入酶解液，32℃，90-100rpm，振荡酶解3.5-4h，镜检酶解情况。
(7)酶解完成后，用3-4层Mira/cloth过滤，滤液4℃，3000rmp离心10min，收集原生质体。
(8)弃上清，用0.75M NaCl溶液清洗原生质体。
(9)离心5min，弃上清，0.75M NaCl清洗2次。
(10)弃上清液，加800μL STC，200μL和20μL DMSO(STC：PTC：DMSO＝4：1：0.1)重悬原生质体，血球板计数，使原生质体个数达107-108个/mL；
(11)置冰上分装至1.5mL灭菌离心管中，每管100μL，于-80℃冻存。
C.PEG介导的原生质体转化
(1)取20μL融合后的纯化片段(各片段总量为2-5μg)加至100μL野生型菌株的原生质体(约107个/mL)中，轻轻混匀，冰浴30min(注不能上下倒置混匀)；
(2)依次加入100μL、300μL、600μL的50％PEG溶液，轻轻混匀，室温放置20min；
(3)依次加入1mL、3mL、4mL，4℃预冷的STC，每次均轻轻混匀；
(4)3000rpm，室温离心10min；
(5)小心弃上清，余约400μL液体，加入1.6mL RM充分悬浮；
(6)28℃，65rpm震荡培养3-4h；
(7)融化RMA再生培养基(具体配方见Li，2014)，待温度降至45℃左右，加入潮霉素至终浓度为100μg/mL；
(8)倒入适量制备好的含抗生素(100μg/mL)的RMA培养基混合已复壁的原生质体细胞，均匀后倒平板；
(9)置于28℃培养2d左右，挑取疑似阳性突变体至含有抗生素(100μg/mL)的PDA平板上。
D.目标milRNA前体敲除突变体的筛选与验证
通过选择性平板筛选、PCR以及qRT-PCR验证获得正确的敲除突变体菌株，具体如下：
(1)选择性平板筛选：挑取疑是阳性菌落的转化子接种到含HPH(100μg/mL)的PDA复筛平板，28℃黑暗培养3d后，以XJZ2在抗生素平板上的生长情况为对照，挑选生长良好的转化子，用于下一步鉴定。
(2)PCR及qRT-PCR鉴定：根据潮霉素抗性基因设计特异性引物HPH-F(225)与HPH-R(226)，目标milRNA前体序列特异性检测引物milR109-JCF1与226、milR109-JCF1与ΔL715-JCR1(94)，具体引物序列见表3；以XJZ2模板DNA为阳性对照，清水为阴性对照，提取步骤(1)得到的转化子的DNA，以其为模板，使用Green Taq Mix(Vazyme)进行片段的扩增，进行PCR验证，鉴定对应突变体中目标milRNA前体片段是否敲除成功。接着，用Trizol法(同实施例2)提取PCR验证条带正确敲除突变体的总RNA；反转录为cDNA进行qRT-PCR检测；根据目的milRNA在突变体中的表达量水平，筛选表达水平基本为零的菌株，即所得下一步试验突变体。
由于milR109、milR123为同个前体结构产生，在实验中一起进行敲除，对milR109和milR123的相对表达量进行分析(引物见表3)以代表其前体结构被成功敲除，结果如图7，结合图6中清晰明亮的条带(具体大小见附图6说明)可知特异性引物扩增出的片段大小均正确，突变体菌株已经成功获得，使用ΔmilR109-6、ΔmilR109-8、ΔmilR109-10分别命名所得三株突变体菌株，相关检测引物见表3。
表3
注：所有寡聚核苷酸链引物均由上海生工生物工程有限公司合成，纯化方式为PAGE。
实施例6milR109/123前体缺失突变体的致病能力测定
以具有4-5片叶片的幼嫩巴西蕉组培苗为接种对象，以测定突变体菌株相较于野生型菌株的致病能力，方法如下：
选取同种培养条件下，长势近似(4-5片叶)的健康巴西蕉组培苗，将野生型菌株和实施例5获得的突变体菌株使用YPD液体培养基摇菌培养产孢，稀释孢子浓度至1×107个/mL，ddH2O清洗孢子至悬浮液中不含液体培养基为宜，对照组用ddH2O浸根；每菌株接种30株幼苗，设置三次生物学重复；置于恒温28℃，相对湿度50-70％范围的人工培养室内，20d左右观察发病情况，斜剖切开香蕉幼苗假茎基部，观察变褐程度拍照记录，结果见图8。以相同发病等级植株数量较多的一级为代表，可以清晰地看到XJZ2侵染后维管束变褐范围更大，颜色深，而所有突变体菌株相较于XJZ2侵染后的维管束变褐程度均有不同程度的减弱；CK表现为全部不发病。
根据香蕉根部维管束变褐情况，参照文献病情分类标准(李敏慧等，2009)，具体标准见表4，对其病情进行分级(图9)，同时计算其病情指数。分级后统计可知：milR109、milR123前体缺失突变体菌株的一级发病植株数均多于野生型，且四级发病植株数均少于野生型；突变体菌株病情指数为49.63，比野生型79.26有显著降低(表5)。综上所述，milR109、milR123前体的敲除使香蕉枯萎病菌侵染寄主的致病力削弱。
表4香蕉组培苗假茎基部发病症状分级标准
表5接种菌株后寄主病情指数统计
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种香蕉枯萎病致病相关milRNAs及其前体与应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109的核苷酸序列
<400> 1
acagctcgtc cgattgtgcg a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR123的核苷酸序列
<400> 2
acttgcacac tcgttcgagc tgcg 24
<210> 3
<211> 263
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milRNAs的前体
<400> 3
ctcgggccct ggttgcgttg gagtcacagc tcgtccgatt gtgcgagatc tgcactgtat 60
gtcttggtat gaacggggtt catatcattg catacagtgt cgaacttgca cactcgttcg 120
agctgcgaca ccaacgcaac caggactttg atggccttcg cacacttgac acaccacaca 180
cactcactct ctctttatcg cactcattga aatgcctggg aggattgact tgacttgact 240
tgatttggct tggacttgga ctt 263
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> snRNA U4 qRT-PCR qRT-PCR检测引物
<400> 4
gggaattttt ggaactcttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPH-F
<400> 5
gcaagacctg cctgaaaccg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPH-R
<400> 6
ggtcaagacc aatgcggagc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M13F
<400> 7
cagggttttc ccagtcacga c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M13R
<400> 8
tcacacagga aacagctatg acc 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109 qRT-PCR qRT-PCR检测引物
<400> 9
acagctcgtc cgattgtgcg a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR123 qRT-PCR qRT-PCR检测引物
<400> 10
cttgcacact cgttcgagct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109-P1
<400> 11
cttaagttca gcttggagcc 20
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109-P2
<400> 13
gtcgtgactg ggaaaaccct ggcaagcatg cctggtcaat a 41
<210> 13
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<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109-P3
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ggtcatagct gtttcctgtg tgaggacttg gactagacag ga 42
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<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109-P4
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tgatgttgcg actgcgattg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> milR109-JCF1
<400> 15
cttggtcgct tcaggagaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ∆L715-JCR1
<400> 16
gaaacttctc gacagacgtc 20
