一种地毯草黄单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于地毯草黄单胞菌的研发技术领域，具体涉及一株耐酸耐碱、稳定性高的 地毯草黄单胞菌噬菌体及其应用。
背景技术
地毯草黄单胞菌，黄单胞菌属，革兰氏阴性细菌，菌体短杆状，两端钝圆，大小 0.5～0.7×1.5～2.0μm，单个排列，鞭毛单根极生，不产生芽孢，有荚膜，氧化酶阴性，接 触酶阳性。地毯草黄单胞菌在YDC培养基上呈表面光滑的黄色圆形菌落，边缘整齐，粘稠， 并稍隆起。该细菌生长适宜温度为20～30℃，最低5～10℃，最高35℃，致死温度为55℃ 10分钟，最适pH值为6.6。
地毯草黄单胞菌是导致柑橘溃疡病的致病菌。柑橘溃疡病在我国柑橘产区均有发生， 在湖南、浙江、福建、云南、江西、广西、广东、贵州等南方柑橘种植省份(区)发生较为普遍、在四川、重庆、湖北等省份(区)有局部零星分布。柑橘感染溃疡病之后，在叶、枝、 果实上形成过山口状的病斑，后期可造成落叶、落果，严重影响柑橘果实的产量和品质。 (林文力,肖伏莲.柑橘溃疡病菌检测方法及防治技术研究进展[J].现代农业科技,2012(22):112- 114.)。
噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在 于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性，其通过与细菌细胞表面特异位点结合后 杀灭特异性细菌的病毒。自从Frederik Tword于1915年首次发现噬菌体以来，越来越多的 研究证明了噬菌体具有较高的抗菌活性和专一性，可防治耐药性细菌并防止损伤微生物群落。 与抗生素治疗相比，其副作用极低且更加快速有效，不会抑制机体的自然免疫或引起变态反 应，同时对人类、其他哺乳动物以及植物不具有侵染性及毒性。然而目前对噬菌体的研究仅 集中于筛选及生物特性的探讨，对其应用方面鲜有报道。因此，筛选并应用合适的烈性噬菌 体，是研发新型抗菌制剂的一条有效途径。
目前，关于地毯草黄单胞菌噬菌体的研究几乎还是空白，噬菌体疗法用于控制由地 毯草黄单胞菌引起的柑橘溃疡病也一直没有相关研究和报道。因此，对于开发地毯草黄单胞 菌噬菌体，用于相关病原菌的防治，具有积极的意义。
发明内容
本发明的目的一在于提供一株地毯草黄单胞菌噬菌体，其在酸碱环境下具备良好的 稳定性，是潜在的、优良的柑橘溃疡病防治生物类制剂。
本发明的上述发明目的一是通过以下技术方案得以实现的：采用的一株地毯草黄单 胞菌噬菌体，所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018579。
进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部,属于有尾噬菌体目短尾噬菌体科 噬菌体，基因组大小为43457bp。
进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 在4～40℃条件下，在7天内效价降低不超过一个数量级；在pH3～pH11环境下，在7天内效价降低不超过一个数量级。
进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 在发酵参数为MOI＝0.001条件下，发酵12h，其效价达到5.0×109PFU/mL以上。
本发明的目的二在于提供一种含有上述地毯草黄单胞菌噬菌体的组合物，组合物中 至少含有一株地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)。
进一步的，组合物包括组合物包括化学性杀菌剂。
作为本发明实施方案之一，将所述的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phageYHC5)和化学性杀菌剂(例如代森铵700倍液)作为组合物联合使用。作为示例性的说明，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5与代森铵700倍液之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
本发明的目的三在于提供一种含有上述地毯草黄单胞菌噬菌体组合物的试剂盒，本 发明的上述发明目的三是通过以下技术方案得以实现的：试剂盒中带有所述地毯草黄单胞菌 噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)或地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)的组合物。
本发明的目的四在于提供一株地毯草黄单胞菌噬菌体的应用：上述的地毯草黄单胞 菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)可用于但不限于杀死地毯草黄单胞 菌，当其工作浓度≥106PFU/mL时，其杀菌效果较强，可作为生物类消毒剂或生物类农药的 有效成分，治疗但不限于由地毯草黄单胞菌引起的各类细菌性疾病。
本发明的目的五在于提供一种地毯草黄单胞菌噬菌体组合物的应用，上述的地毯草 黄单胞菌噬菌体YHC5的组合物，用作为生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治但不 限于由地毯草黄单胞菌引起的各类细菌性疾病。
通过采用本发明技术方案，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)及其组合物可以用于治疗和预防因地毯草黄单胞菌引起的细菌感染。
本发明所述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)在 噬菌体效价、最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度对噬菌体存活稳定性的影响等方面具有 如下的生理特性和有益效果：
(1)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)是从自然界中 分离的烈性噬菌体，供试噬菌体不含毒力基因或不良基因，其DNA无法编码可能引起潜在 健康风险的蛋白，不存在携带溶源基因的可能；本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。
(2)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5具有较高的发酵效价，其在发酵时，感染宿主地毯草黄单胞菌的最佳MOI为0.001；是具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可在发酵12h内达到109PFU/mL以上的效价。地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5可以特异性地部分或完 全灭活地毯草黄单胞菌，仅需少量初始噬菌体即可完成大量增殖，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供优质噬菌体株来源；本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所 述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5或其组合物制备成应用于检测、消毒及植物防护等方面的各 种产品并加以工业应用。
(3)本发明地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高度专一性和裂解性并且具有较广的宿主范围，对128株地毯草黄单胞菌的裂解率高达96.9％。地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、灌溉设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液 体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于 磷酸盐缓冲液、TSB培养基、LB培养基、氯游离水等。
(4)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别28株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株，特异性良好。
(5)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)稳定性良好，在4～40℃条件下，可在7天内效价降低不超过一个数量级；在pH3～pH11环境下， 稳定性仍然良好，可在7天内效价降低不超过一个数量级。
(6)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，可用于制备组合物、试剂、或试剂盒，可应用于地毯草黄单胞菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的地毯草黄单胞菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌 进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
(7)地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5及其组合物(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)对液体培养基中浓度为103pfu/mL的地毯草黄单胞菌具有良好的杀灭能力；当地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5浓度≥1x106PFU/mL时，其对地毯草黄单胞菌的杀灭率达99％以上，且对其他联用物质无拮抗作用。
(8)本发明地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)及其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成可应用于防治由地 毯草黄单胞菌引起的病害的生物药剂。
附图说明
图1是地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)的噬菌 斑示意图。
图2是电镜鉴定的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)透射电子显微镜下形态结构示意图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，保藏 编号为CCTCC NO:M 2018579，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省 武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏时间为2018年09月12日。
以下实例中，
TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；
SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L Tris-HCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)和50％的代森 铵700倍液的组合物(1：1)按照实施例10的方法制备。
实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养
本发明中地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的来源样品采集于江苏省南京市江宁区大学城附近生 活污水，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。
噬菌体的分离：向10mL过滤后的样本上清液中加入10mL 2倍TSB培养基中，同时加入1mL地毯草黄单胞菌宿主菌对数期菌液，于25℃下150r振荡培养12h。取上述培养物8000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，4℃保存备用。取0.5mL地毯草黄单胞菌 宿主菌对数期菌液，加入5mL不高于45℃的半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板 上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μL点滴于已凝固的双层平板上， 在无菌条件下风干后，放置于25℃培养18-24h，观察噬菌体点滴斑生长情况。
噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mL SM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取1×102，1×104和1×106稀释液分别加入对数期地毯草黄单胞菌宿主菌0.5mL，混 合均匀静置15min后，将上述混合液加入5mL不高于45℃半固体TSB培养基，混匀后立刻 倾倒于TSA平板上，待其凝固后置于25℃温箱培养18h-24后观察，即获得含有单个噬菌斑 的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终 在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液 的50mLTSB培养基中，25℃条件下180rpm摇培12h。取培养物在8000rpm条件下离心 10min，用0.22μm滤膜过滤上清液，即为得到的纯化的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5 (Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)。
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)在地毯草黄单 胞菌菌苔上产生单一的圆形噬菌斑(参见图2)，中心透亮，直径为6-7mm，在电子显微镜下呈现为1个直径约50nm的多面体立体对称的头部，及一个短收缩尾部(参见图1)。基 于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为 短尾噬菌体科(Podoviridae)。
实施例2：噬菌体的电镜观察
分别取实施例1制得的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 滤液作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余 液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做透射电子显微镜观察，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 透射电子显微镜观察结果如图2所示。
实施例3：噬菌体基因组的提取与测序
取实施例1制得的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g Nacl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将 上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100mL加入10g)，完全溶 解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体 积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。 再次加入DNaseI、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA至终浓 度20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10μL10％ SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂 盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度 和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)具有SEQ IDNo.1所 示的核苷酸序列；
实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本发明选取30种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定地毯草 黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)的全基因组并对其进行生物 信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明供试噬菌体不含有下列毒 力基因。
表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例5：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5对宿主发酵菌最佳感染复数(MOI)的测定 挑取地毯草黄单胞菌宿主菌单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，25℃下 160rpm振荡培养24-36h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到10mL TSB培养液， 25℃，160rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、 0.001和0.0001的比例加入地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的纯培养液(由实施例1制得)和 宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同，25℃下 160rpm振荡培养12h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体 效价：用SM液做稀释液，将噬菌体YHC5培养滤液分别10倍梯度稀释至10-7倍。分别取 不同稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌地毯草黄单胞菌菌液500μL均匀混合，静 置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入5mL不高于45℃的TSB半固 体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的TSA固体平板上，待琼脂凝固后于25℃倒置培 养18-24h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中， 噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以 产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
结果表明，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的MOI＝1:1000时，其效价达到最高(5.2×109pfu/mL)。地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的最适MOI为0.001。
表2不同感染复数下地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的效价
实施例6地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的热稳定性试验
取1mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5纯培养液(实施例1制得)装于无菌EP管中，分别 于20℃、30℃、40℃、60℃水浴中作用6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h，同时将4℃ 下处理作为对照(CK)。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后 采用双层平板法测定噬菌体效价(方法见实施例5)。实验重复3次。
结果如表3所示，与对照相比地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5在40℃下水浴168h(7天)，效价仅降低一个数量级，由此说明地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5具有良好的耐高温特性。
表3地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5于不同温度下的效价(PFU/mL)
实施例7：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的pH稳定性试验
取无菌EP管分别加入不同pH(pH1～pH14)的TSB培养基900μL，将上述EP管置于25℃ 的恒温水浴中，待温度平衡后向其中分别加入l00μL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5纯培养 液(实施例1制得)，使其初始效价为5.9x109PFU/mL，室温下静置，分别于反应1h、4h、 8h、24h及96h后取样测定效价(方法见实施例5)。重复实验3次。
结果如表4所示，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5效价在pH3～pH11之间无显著变化，说明该噬菌体在中性，酸性和碱性条件下都有较好的稳定性。
表4地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的pH耐受性实验
实施例8地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的裂解谱实验
取效价为1×109PFU/mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5噬菌体液体(实施例1制得)，采用双层平板点滴法来测定供试噬菌体的裂解谱。分别挑取128株地毯草黄单胞菌单菌落，将其接种于盛有3mL TSB培养基的试管中，25℃160rpm振荡培养18～24h，制得各株细菌菌液。取300μL供试细菌菌悬液分别与5mL TSB半固体培养基混合铺于TSA平板上，取5μ LYHC5噬菌体点滴于平板上。待自然风干后25℃培养18～24h，观察结果。
试验重复三次。结果如表5所示，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5对于128株地毯草 黄单胞菌的裂解率可达96.9％，具有较宽的裂解谱。
表5地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5裂解谱实验
注：+++：完全透亮；++：中等透亮；+：轻微透亮；-：不裂解
实施例9：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5对非宿主性致病性细菌的裂解试验 挑取包括无乳链球菌、停乳链球菌等在内的28株非宿主性病原细菌单菌落，将其分别接种 于盛有3mLTSB的试管中，37℃160rpm振荡培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL供试 细菌菌悬液分别与5mL TSB半固体培养基混合铺于TSA琼脂平板上。分别取10μL地毯草 黄单胞菌噬菌体YHC5噬菌体液点滴于平板上，待自然风干后25℃培养18～24h，观察结果。 试验重复三次。
结果显示，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5无法识别28株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表6)。说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。
表6地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5对非宿主性致病性细菌的裂解试验
注：-：不裂解
实施例9：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5在液体中的杀菌效果
培养地毯草黄单胞菌至对数生长期，分装进不同试管中，用等体积的TSB液体培养基稀释 菌液至地毯草黄单胞菌的终浓度为1×103cfu/mL。向其中分别接入终浓度为1×104PFU/mL、 1×105PFU/mL，1×106PFU/mL、1×107PFU/mL、1×108PFU/mL的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)。同时设置对照组和空白组(CK)，对照组给 予终浓度1x103 cfu/mL的地毯草黄单胞菌；空白组给予等量生理盐水。4h后检测地毯草黄 单胞菌的残留量。检测方法为：将各处理样本以无菌水进行稀释后，取100μL稀释液于 TSA固体平板上涂布，37℃培养24h后统计平板上菌落数量。地毯草黄单胞菌数量＝TSA平 板上菌落数量×稀释倍数×10。
结果如表7所示，地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)在其终浓度为1x104 PFU/mL时即可良好控制地毯草黄单胞菌在液体培养基中的生长； 在地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5终浓度≥1×106PFU/mL时，对地毯草黄单胞菌具有良好的 杀灭作用，杀灭率可达99.9％。
表7不同浓度地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5在液体中的杀菌效果
实施例10：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的组合物在液体中的杀菌效果 将终浓度分别为1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL、1×107PFU/mL、1× 108PFU/mL的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)原液分 别与终浓度为50％的代森铵700倍液(化学杀菌剂)等体积均匀混合制成1:1的组合物1、 组合物2、组合物3、组合物4、组合物5。
培养地毯草黄单胞菌至对数生长期，分装进不同试管中，用等体积的TSB液体培养基稀释菌液至地毯草黄单胞菌的终浓度为1×103cfu/mL。向其中分别接入上述地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的组合物，同时设置对照组和空白组(CK)，对照组给予终浓度1×103 cfu/mL的地毯草黄单胞菌；空白组给予等量生理盐水。4h后检测地毯草黄单胞菌的残留量， 检测方法见实施例9。
表8不同浓度地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5组合物在液体中的杀菌效果
结果如表8所示，各浓度下的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodisphage YHC5)组合物均可良好控制地毯草黄单胞菌在液体培养基中的生长；地毯草黄单胞菌噬菌 体YHC5终浓度≥1×106PFU/mL时的组合物对地毯草黄单胞菌杀灭作用更强，地毯草黄单 胞菌的存活数量低于单独施用同等浓度时的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5的处理(表7)。 说明地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5可与其他物质联用防治细菌，且对其他物质无拮抗作用。
本实施例的组合不限于代森铵700倍液，还可以是多抗霉素，氟吗啉、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑、氟硅唑、腈菌唑、代森锰锌、甲基硫菌灵、多菌灵、百菌清、聚糖果 乐等化学杀菌剂。本发明还可以与化学消毒剂联用，起到防杀效果。
实施例11：地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5及其组合物的试剂盒的制备及使用 试剂盒中含有5～10mL的效价为1×107的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonasaxonopodis phage YHC5)，1L TSB半固体培养基，1L TSA培养基。
试剂盒的使用方法为：取效价为1×107PFU/mL地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5噬菌体液体，采用双层平板点滴法来测定供试噬菌体的裂解谱。挑取待检测单菌落，将其接种于目标液体培养基中，于目标温度下结合待检测菌株生长特性进行振荡培养，制得待检测菌株菌 液。取300μL待检测菌株菌悬液分别与5mL TSB半固体培养基混合铺于TSA平板上，取 10μL YHC5噬菌体点滴于平板上。待自然风干后根据待检测菌株生长特性于目标温度下进 行培养，观察结果即可。
综上，本发明的地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5) 及其组合物安全性高，可用作为制备试剂盒，还可以作为生物类消毒剂或生物类农药的有效 成分，防治但不限于由地毯草黄单胞菌引起的各类细菌性疾病。
本具体实施例仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在 阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的 权利要求范围内都受到发明法的保护。
序列表
<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
<120> 一种地毯草黄单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43457
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagaggcacc cgcgcccacg taacgcgcgc ccacgcgcac gcacaggcac ccacaggcgc 60
acgcgcgcat acacccgcac gcacccacgc gcgtcacgcg ggagggcgca tgggggcgca 120
cacgcgagct ttgattggag tggcccccgc gcaattctaa atcaaaattt ggtccagctc 180
ccgatcagcc cgtcttaagc ctaacgatgg gcgcagcgga gtacatgtcg atagcgcacg 240
cggcagccac ggccttagcc gcagacttgc tcacatggta cgctccgcga gcaatacccg 300
cgccgctgcc aatgaagatc ggagcgtcat caggccaaga cttcttgccg ctaacgactg 360
tcgcctgtcc gtccttgatg ataagcacgg tggagctacc actgaccagc ggctcgatgg 420
cttctccgtc tttgagggcg gccaccacgg agcggaggac gtgaatctca ccggctacgg 480
cgcagaagac cggaccctcc ggggtttgga cccggagagc cttggtcatc gtgcccttca 540
tgtcgtccgc agtgacttgg ctgtcggcat acaggtgctt accgtcccac acgatggtcg 600
tcatgggcta cttctccacc ttgcagcgcc aaccgcaggc ttgcttgtag ccatcgtacc 660
acgcacgcag ggcgcgcttg tccacgttgc agagcttcac gtcgaactct ctgtcgatag 720
cgagcttcgc cacgtcagag ttagacggat gctccttggt gaggtacgtt acggcgcagt 780
cttcaaggta ctgcgcgggc ggcgccggta tcgtgacgca ggaggtcagc gacatcagca 840
ggagcaggct cgtcagccca ctcaggactg cgggcaaggg cttgatcgag cgcggcatgc 900
gcgttctcct tctcgattac tacggttttc agttccttag ccgcagtggt agcggccgag 960
gcgttgcccg acgcctgttg gtagtcctgc tggacattgg cgcgggagtt gcggaggtgc 1020
agcgagtacg cggacaggag gattacggcc agaagcagca gccctccgat cagcaactcg 1080
attttacgga agatagacat aaggtccgcc cttcaggcac gttgcctgct cctcgtaccg 1140
tcgggtcaca agaccgttca gtaccatctt gttggcgtaa atccatcggg gatactggtt 1200
gcagctcccg attcggtctc cggcgttgac cttgcgaagc agggtcgatg cccggagatt 1260
cggttcaccc acgttgaaga cgaaggagac catcgcgtcg tactccccct gcttcagggg 1320
cacgcgcaca ttgcgctgga cggccttctc cgccacgcgg aggtcttcgg cataccactg 1380
gtcgcactgc tcgtgcgtgg cccgcatacc ccggtacacg cccttggtgt gccctcggca 1440
gatggtccaa ggtgcgccgc cagtggcggg gtccgggtag gccaccagcc ggtagccttc 1500
gtgggaagcg atctgctgcg ccccgtcgag cgagaggtag gttgccccac ctcccgccac 1560
agcgagggcc agcagcgcgc ccatgacgcg cttgctgacg ttcatggctt actcccccgg 1620
ctcaggttcc ggctccggct cgactggcag cggcttgccg cccggaccag acgattccgt 1680
acgggccttg gcagcggtga tggcagcctg cacacgagcc acgtcggcgt tgaacagggt 1740
ctccagctgg gccgcagtct gcgggtgctt ctcggcatgc tcgaccagag ccagcagctc 1800
acggacgagg tagttgccac ggccgaacag gccggtgtag ttggagaaat cggacttcag 1860
catgttacct ccggtaacgg tcaaggatgg atggacggcc tgcacggatc ggccctcgtc 1920
gggtcgccgc cttcatgccg gttggatcgt tgatccagtc ttggaactcc ttctgcgctt 1980
gcttctcgat ggccttgttc tggtccagtg cgagcttgct cacccagtgg cgaacgctgc 2040
cttccagtgc gtcgatacgg tcatcgtgcg caaggctgcc gcgttggctg gtgatcttgg 2100
cgagctggtg gaacagggaa tacaccgagc gcttgccgct gttggcgtgc cgctgcgtgt 2160
actcgtgatc catttcgacc acgctctcca gcacgacgag agagccacgg gcgatcacag 2220
gctccaaggt gccgatgatg cgggcctcct tgttgccggt cacgaactcc tcgaccagcg 2280
agccgttcca cttctcccgc aggatcggca ggaacacctt ggcgaaggca ccgtggccca 2340
tgttcttctc gatggagagg acgttgggct tgtacttggc ggcgatttcc gcgaggtggc 2400
gcaggccatc cccgtcgtag ccacccggca ccgcgcccac tgcgagcacg tacacggtgg 2460
agttgaggaa gccggtcact gcgaacgcgg tctcgtctcc gttggcaccg ccaccggccg 2520
ggtcgatctg catgtggacg ccctgaagct ccgcagtctc cacggagatt tcgtgcgggg 2580
ccatcatgat gaagccgatg ccgctggact ggaacgtgcg ctggtgctgc tgggacatgc 2640
cccgcgtgat cgtcagcggg tagcgggtgc caccgcccgg aatcacgatc aggttctccg 2700
tcttcagcgg gaagcgcatg gcatccatga gtcgggtgtt cagcatgtag ttcagctgga 2760
acgaggacgg gcctcggtcc ttcagcttcg cttgcagctt ggcctcgtcg taaatctgct 2820
cgtcggtcgg ctgcccctcg tcgcccatcg ggccaccgcc aaaggcgagg gacgggtctg 2880
cttcgaggcg ctggacgatg gacggagcca gatgcgggcc gtatgcctcg cgctgcgccg 2940
gggtcgggta gcgaccgggc cagatgcgaa cgtcgaagcc acgaccgggg agcgtgttgt 3000
agatgctctc gctggtctgc ggcgtgccga ggtacaggat gcgtgccggg atgcccggac 3060
ggcctgtgca gatggcggag aactccaacg tgatgttcag cagcagctcg cggttcgcag 3120
cggtgcggct gttcttgttg gattccacgt cgtcggcgat cagaaggtcc gcgcgcttgc 3180
ccggcaggtt gccggtgacg ccgatacacg ccacggacgg cgagcggtcg atgcccttca 3240
ggctgtgatg cacgtcgaaa gcctcaaccg aagtgcggtc gcccgcgttc ttgtcggggc 3300
ggaggcattc gagctgcggc acggtcagga tgatgcgctg gatcagcgtc gccgtctcgt 3360
tggcgttggt gccgcctgcc gaaatcacga ggattcggtg ctgcgggtct tggatcagct 3420
gccacacggc gaatatcgcg gtgatcgtgg tcttcgcttc accacgctgc gcctgcacca 3480
tcaggttgtt cggcccgaat tgcaggtagt tggcgatgtc gtactgcatc cacgtgggcg 3540
tgaagcccaa caccttcatg atgtcgcgca tgaagacggc gaagtgcgcg taatgcttct 3600
ggagcacagc cagtttcttg cggcgcagct cagccgcctc tgcggactca tgcgccattg 3660
gctacgctcc ccggaaagtt gacgatgttg tccagcgccg cttgcagctc ggcctcctcg 3720
gcctcggaca cgtccttgtt ctccagcgta tcggccagct cgtcgagcgc cttgttggcc 3780
tcgcgcgtgg cttggatgtt gttgtccttc aggaacttga ttgcggcgtt gatgtcggct 3840
gcggtacaca gctcatcgtt acggagacga tccttcagga ccgtcgccac gatgacgtgc 3900
agctcgccga gcgcgccttc acttgcggga ttcgacattc ttgtccccca tgatcttccg 3960
gtgctcgcgt gcgcgccagt agaactgggc cactgcgtac aggatggcga gcgtggtgac 4020
gatggcagcg ccataggtgc tgatgaagtt gaggtacagc gcccccgccg tgaggggcga 4080
ggttcggacg acctcagaag ccagtgacgg cggggtcatt tgtagttctc cttgtgggtt 4140
agggccagtc gtcagggttg ccgacgagct tccattgcag gcggtttacg ctgttcatgc 4200
ctacggcgat caggtcgccg gggatgcccg tggcgatcac gtgttcggtt gcgaagcgct 4260
cacgctgcgc gcggacgcac aggttgctgc cgttcttgta cgacagcagc acgtcgctct 4320
gcgtggcgaa gaccgcccgc ttctcgtcca tgcacaggcg tggtgtggtt gcactgggga 4380
tcaccattgt ctgcatggaa gcagccaccg tgtcgtacca gtagaacttg cacacaccac 4440
ccgccatgta tgcgacgtgc ggccgcatgg tctgatcgaa ggccagtgcg atctgagtga 4500
tacccgagtc tgtcagcacg gtaacggggg caacgccatc gcggtaaacg acgacgctgc 4560
ttccgtcact ctcggcggtc cacagcacag cttggaggtt atccactgcc gcgttgagag 4620
tcagcccgcc ctgctcgaag tcgatgagcg ggcgggtgcg ccggttctgc tgctccaccc 4680
agtcaccacg ttggatgctt tgggagacag tagggatcat ggcgtgtaac ggctccacga 4740
aactcgcatg cgcaggttcg cagtctcgga gctggtcttc tcgataccgg gactgaaccc 4800
tacctgccac ggaatcacag cagacagacc ctgcgccgca gtgatggggc cgggcggcgt 4860
gttgttgatc gacagtcggc agatggtgtc gcggtagtag ctccccggaa cgtaggccac 4920
ggactgcatc tgcaagtccg aggcactata catggtgccg ggagggtacc ggtccgtgat 4980
agcgccagtg ccgtcacccg tgccgccgta gaagtagtag cagccccaca cgtaatccgt 5040
ccaagcgacg gcggactggc cgttgagata accgctgcgg ccaagtgcaa tgggcttgca 5100
ggtgacggtg gtgctgaccc ccttgatagt ctcggtactc accaccgggg tggtatccac 5160
gtacagccgc agctcgtaag tcaccacgag gatttcatcc tccagcacgg tgatcgtggt 5220
gggattaccc gatgaatcct tgatgagagc acgagtcgtc agtgggtagg ttctggtgta 5280
gctgttgtaa tacttacctc ccagctcgga aagcacacca gtcgcggtgc ctgccgggaa 5340
ctggaactga ctgcgggcat aggcatagta cggtgccgtg ctggttccgc cggtgtcgga 5400
tgtggttcga ctaacctgcg ccacctgagc accaagcgcg gtgtcggtga aggcaggctc 5460
ggcactaccg ctaccaacgg caaggtacga aatgatgttg tagaaggact gggcgtaccc 5520
gccaccgttg tcgcccatag cgtccatgcc ggtatcggta atcaggttgt gttgccagtc 5580
tgcgacaact tccatcgagt cgagcgactt gcccttactg atagtgaaca gtccggctac 5640
gccgaagtga ttctgaatca tgcgaagctc catgatacga agctgctctt agcccgcgca 5700
gtcgcgtcta gcggctggtt gactacaggg tgctgcttca gggtgaagga atggaaagac 5760
gaagatgcgc gagcgctctc cggttcttcg acattgtact ccttgctgat actcttgagg 5820
tcgaagctca cgaagccgct ggtgagggac gcgccctccg tcccgccgtc gaggtcttga 5880
cgtgtgctgc ggaattccca agacacgaaa gaggagccga ccaagctgga atccacagga 5940
ggcaacatgt cgatgttgct gtagcggttg aacccactac tcagcagcgc agcctcagtc 6000
tggtagaagt tgtagagctt cgacgtaacg tagatgccct gttcttcaat gcgcccggac 6060
cagtaagcca cccggttcag gccgtctgtg accttgatgc tcaggaagta agagctgtcg 6120
tcgttctggc ccagcacgta cttgtggttc cacttaacgg tgtccaccca cagcggcttg 6180
ttctgcttgc tgcggaacgc ggacagcacc acctgcacgt atttcgtgtc cttgggtgct 6240
gcgccctcgg cgacagactg gtgccatgca ccgttgctac cggaggaaac catgttgccc 6300
cagttgcgtt gcagctcggt tccatcttcc ttgcggtaga tgatcgagac acgcgcaccg 6360
gccttgccct tggagcttgc gccctgctga acttcggcgg tgcagcggat gtagtcgttg 6420
accttggcag gaatcagagg gttgagcaga tcgctaccgc ccgtcttgat gtcggcgaag 6480
cgtgcgctgt agacgccgct gtcggtgtcg tagtctggcc cggtgccaat cgaccagcct 6540
tcgccgttcg acccaccgcc cggcacccac gtgccgtcgt cgcctgcctc gaagtctccg 6600
tttggcacga gggtttcctc gtccacgact tcagtgaaag ccgcccactt gacgacgact 6660
tccttggtga tgttgtccac tcgcaccgca gcgcccggag ggagcgtcga ttcgatgacc 6720
tccacggtgc agcggccgac tgggttgttg atggacaggc gagactcgta agcctcgccc 6780
gccgtgtacc cttccagcac gcccgtcacc gacaggccat ctgcaacctc gtccgccatc 6840
agcggtcggc cgtacagcct gaagtgatta gccatgctta ctccttagcc aagtcgcccg 6900
agagcaacca cgtgttagtg tcgccgtcga tgcacgttgc cgtgacgacg gagttggtgc 6960
cgcgagttgc ggcggtacag ccgaccggga cttcaatggt cacgcccgcg tcgccggtga 7020
tggtgactgg gcctgccttc tgctgaacgc tgaagtagct gcccgaggcg agcttcgtct 7080
cgccgtcgcc cacttccggg atcaggttga tgttgacggc gcagcctccg gcgtacgtac 7140
agcgcacgag gccgtactcg gcagccttgg cggcgtagta ggtcgggcct tctgccggga 7200
tgatcggcac tcgcaggctc gcagcagtga tcggcgcagg gccggtgtag ggcttggcgt 7260
aacctcgaag gacagcgaac cagatgctac cctcggcggg aaccgtggcg aagcggatga 7320
agctgggatc ggtgccatcg gccagagtga cctgatagtc cacgtccggc tgcatgccga 7380
tgccgttgac gtacacgtcg tagaagccag cgccggacac gtccgcgcct tccatatcga 7440
agtcggtatc gtccacctga tcgcctgtcc acgaaccgga ccagactcgt ggagccacgg 7500
acacgatgcc gcctgcggcc agaagttcga ggacttcctt gtaaatctcg gtgatgatct 7560
tgttcaggtc taccaccaca ccgacctgct ggtcaatgct aagggtggca atgttcaacg 7620
aatcgaacat ttcctgaatg atcttcagca actggtcatt gctgaggtta aggttggtct 7680
tgctgatgat gctaccgtta acgtagtcaa cgagcatctg ctgcaccgga gtgctgcggt 7740
agatgtagag cttgcgccca gccgcgacgg caggctcaac tcgcacggtc gaggagtttt 7800
catcctcgga cagcacctcc acggtgtggg aggtccggtc ggtaagcagc tgcgtttcct 7860
cgtccagaat gccgctcatc gcgtacacat gggaagggtc gatgtagccg cccgtgaagc 7920
tgatttgcca gtcggtagtg acaccgttgg cgtcgaatac gtccgtcgcg tagcgcagct 7980
ggggatcggg aactgccatg ctgcctcctg tgtttgtcgt atgtgtacca aaagtcgggc 8040
cgtccttggc ccgccagcgt tattcctcta gatgcgccgc cgcgcccttc agcaacggga 8100
tcacgtacgg caggcgtccg cccggcagca cgtccgcaag gttctcggga cgcccgctca 8160
cgccctgcgc gaagtcgttg atgaccccta gcgccggggc gaagctgccg cccacgattt 8220
ccttccggtt gccgagctgg ccgcccgcga gctgccgcac ccagtccggg gagccggtgt 8280
cggttgcgtg ctcgtaccag ccacccgcca cacccgtccc cacttccagc acgtcgccga 8340
ggaaggccgt cgcgctgatg tagttcatgg tgctgcgacc catcgccaga ggcgacaggg 8400
catcttcgat agcctgctcg cgctgctcct ccggcaggag gacagcacgc gaagccacac 8460
gcagggcttg cagcggggcg accacggcca tcgccgaagc gatgataccg gcagtacccc 8520
atgcgccgta caggcccatg tagcggccca gctgcttctg ctgcgcgacc agcgagaacg 8580
tgcggtgctg gaacagcatc ttcagccaac cgttgtgcgc ccacttgccg gtctcaccga 8640
tgaaggtgtc ctgcaagatt tggttcgtac cacggtcgat ggcgttgtag aacgcgagcc 8700
acgcctgacg gtcgtgcagg ttctccagac cacgtgggtc cacagcctcc agcttcccgt 8760
ccgcgcccca gcgcaccacc tgatcctgag tctgccgcag gcgagcaagc agcgtgtcgt 8820
cgaggcccat gtccttcagg gcagtatcgg cagccttgcc gtcccgcagg aacttcacac 8880
ccttggcaat cagcacctcc gcgaagccgc gctgctgcac agccagtacc gcgcgctgcc 8940
ccgagaggat gcggttggcg ttggcagtgc gctgggccag agcggtcagg aagcctgcgc 9000
gctcggagcc gtacagcgaa gcctgcgtgt ccatcgagtt gaacatgtgc aggtcgtaac 9060
cggcgaggcc gaagccacgc ccgctgatga actcgaagcc gccgaggatg ctgttctccg 9120
ggtcttcacc acggagcagc ttgccgattt cggcgcgcat gcggggagca attcggatgg 9180
cttccgccac accagcagca ccgacagccg ggaggccgtt ggagtattcc gccgcttggt 9240
tgatacctgc gccgcccagc tggatagccg aagtcagcag tcgcgcattc gccagaacag 9300
tcggatcacc cgtgccgatg acacggcccg tgaactcgga catcacctga tcgaacgcac 9360
gcagctccac gtcgttggca ccagtaacct gcatcgcctt acgcagcacc gagataccgg 9420
cgtcgcccat gatgccgtgc ttcgccagag cgatgtcacc agccacacga cccgcgtact 9480
tgcggtagtt gtccatcacg cggttgtcca agtagtccat caggcggaac tcgccctcgg 9540
catccttgta cttgcgcgtc acgtccaagt cgatacggct cttggtgtgc ttcgcaccgc 9600
cacgcgagta gcggcccatc accttctgga tttcctcctc gttgagcgac agtgcgcgca 9660
gggtgtcccg cagagtgtca gactggttgt cggagaacag gttgtccggc gcacggttca 9720
tgcccgcagc ccgctcctct atccgctcca gatacttgat gctcaggtcg tcgaggaact 9780
tgtccccata cagctcgccc atcacatcga actggtcacg cagcgcctgt cggatgctct 9840
cccgacgcac gcgcccggcc gcagcgatct tgccgcccag ccaagtacgg gactcgtaac 9900
cggccacgtc accatcgggc aggcgggcag aacccaccgt accgacagcg cgctgctcgg 9960
cagccatccg gttgtagcct tcgtccagcg ccttcgccat ctgcttgatg gactcgtggg 10020
cgtcggcaat ctcgcggccc atatacatgg tctcgcggta cagcttcacc tcgtactcga 10080
actcgctccg catcttccag ccggtggcga agtccttgat cgcaccagcc ttccgcacgt 10140
cggcacgcca cagccggtag gccgcttccc actgacgcgg gcgcgaaccc atgaacgact 10200
cgaagcgacc acggcgatcc atcgctgcgg tgctatgccg accagccgcg ccttccgggt 10260
tctccagcag ggtgacggcg atcatgcgag cgaccgggga ctgcgacgac atgagcgtgg 10320
tgctcgttgc ctccagcccg aacttctgca tgatagtgga cagcttctcc gcgtcgatgg 10380
catacttgcc gctgaagcgc tcggcacggc cgatcacctc ggcgacttgg atgcgcgtgg 10440
cgctgtcgct gatctgcttg tccagcccgg tgcgctgcat gaaagccttg cgctcgcggt 10500
tgttcttgaa gatcgagttg accagcatgc cacgggtctg ctgcgaggca gcctgcggag 10560
agcgaatctc ctcacccaag ttctcaccga ccacgttcat caggcgctcc aacgcggact 10620
cctgcccggt caggcccagc acgcgggcga tcttgtcctt cagccattcc cacgcggtct 10680
gctgcgttgc gcccggaggg gcgctgatgt tgcgcagcac tgcctgcacg tcgcggttgg 10740
tcaggccata cgacaccagc tcgtcggtgt tagcgaggaa gcccatgcgc tgctgatcca 10800
cccgaccctg catcgcctga gtcatcaggt tgcggtccgc ctcggacagg ttggcattga 10860
cgtgcgtcag cagctcgtcc atctgcgcct tgaaattcgc atcctgccgc agcgagcgga 10920
aggtagcagc atgcagcatt tcgtgcagca ccacctcggc gttgtgcgca gagctacgca 10980
tcgccatcgc attgagcgac gggttgtacc caccggccac gttcggctgg ttcgggaacc 11040
actgggacag ctcggcatcg ggagcgatgc gcacgccgtt caaccgaccg ctacgcttca 11100
gcgtgttggc gattgcacgg aagtcttccg gcacgttctt cgaggattcg aggtaacgca 11160
ggatgtcgtc gggcgtgccc ttgatgccgc tcgccttcca tgcacgggtc agcagcgggt 11220
cagccggagc gttccactcc acccgtccgc ccacgttgtc ggcgtagttg ccggtgcttg 11280
ggtccacgtt ctctacgtca cgcgccagtg cgccggtggc gttcgaggca gccggggctt 11340
cctgcgccac gtccgggcga gcgaacagac ggaagtcgtc cggcacgtca gccatgcctg 11400
cacgaatcca gtccatcacc tcggcgcgcg cgagggagtg aatcttcgcg ttgagcgcca 11460
ccgggttgcc ctcgcccacc tcagccacgg cgcgtgcgcg gaggtccgca ttccactgct 11520
cgccgtacat ggcggcgttg ccggaggcca agtcgatggt ggccttgtcg cggacagcag 11580
ccgcgctacg gataccgcgc aggttcatcg ccgtgccgat accagccgag aaggcggcgt 11640
cggtcatgaa gtcggcgatg gtgcggttct cgcccatgcc caccagtgct gcatccgtga 11700
tgacggacgc ggcggcgttc tcggcgacac tcgaagcgat gcccgcagcc acgcggcctt 11760
cagcgaacag agccgcagag ccgacgccca gcgcgcgcgc accaccggag gccaagccgc 11820
cagtcgccca gttacccgga tcggtcaggc ccgccacgag gtcgtagccg aagctacccc 11880
agccggtctg gttctccttg atacgcatgc tgtgacgccg catgtagata cggtccgtca 11940
cgtacgacag ctcgtccggg gagtacgccg catcgcggat gtcctccagc tcgtcggcgg 12000
tgtagtacgg cttctcccac tgcttcgggt cgtacgtcca gccctccggg gtcagctcgc 12060
ggtcgcgggt gatctggttg gtcagagccg caccgatgcc gctatcgaat gccgcgcccc 12120
acttgtcgag gaacgacagg gaatcacgga acgcaacctc gtcacggtcg gactgggttg 12180
cagcgatggc tgccttggtg ttgcgctcgt tggtctgcgt gtcgatggca gatacttcct 12240
gccgcaccca ccacgggacc acctcgtcgc taccgcgcac ggcctgcgca gcggccacgc 12300
cctgctcggc ggtgccaccg gccatcacgt tctggcccat cgccagctcg cccagcccct 12360
cgcgcacctt gccgatgtac tccttcgtcg cacgggcaag accgccgccc gcgccttcga 12420
tggcatcgcc acgccacgct gcggggatgc tcgccccgct ccacgtctgt gtggtcatgt 12480
tgcccgcacc tgcccaagcg gcactgatgc tgccctgact ggccgcaccc tgcggagcca 12540
cagccggggc agcctcgccg cccagtacag ccggagcgta cgccgcattc ttcggtcccc 12600
agttggcacg gttggtgccg ccgtggtaga tgcggagtgc ggtcgtaacg tcgcccttgg 12660
cgagctgcat gttctcgcgc atgatgtgcg cgtacatttc gaggttgtct tggaagttgc 12720
gcacgtcgta cttcttgccc gtgcgcgctt cgataaccgc ctgcgtctgc ggcatgactt 12780
ggaagtcgcc gcgtgcgcct gcctcggagg tgatgatccc ctgtgcattc cgcttcgcgc 12840
ggccgctgcc ggactccacg cgccactgtc cacgcacaac cgactccggc actcccgcgt 12900
aagcggcagc cgcagcgatc tgctggtctt gggtcagccc cgaaagatcg agtgccattg 12960
tctagttctc cttagagttt gggttggatg gaaatgctct gctggatgct accgtccggc 13020
atgcggacgt agccttgcgg caccgggaac tcggtgcggg tcgcagcctt gcggcggcgt 13080
tcgtactcgg ccttgatgtc agcgccagtg acggcgacga ccttccagcc cctctcgcca 13140
accgtgttga cgtacagcac cggctctccg gtctcgctat cacgcatgcg gaacacgtcg 13200
gccttcaggc tcttgctcgg ctccacgttg ttggcgcgga gggtggcgtc gattgccgct 13260
tcgattgcag gcccggtctc cttggtgtcc atgaagccca gccatgcgcc gacgctgccg 13320
atgacgtgac cttcgtcgtc acgcccgttc tcccagtaat acttgcccgc atcctcaccg 13380
ccgtacttca gcttggcgag attgagcgca gcagtgatac cttcggagga cgtgtcgagc 13440
aagccaccgg actcgttgac cgcgcgcacg attgcacgcg cagctgcggc ccggccggag 13500
tcgcccagct tgttaccgaa gtatccgaag taggcggggt tcgccttctg caacacgtca 13560
gcaacgcgcg cctgcaacgc ctcggattcc ttgcggctgc ttgcactgaa ctcggtcggg 13620
tcggcggtgg tgatttcccc gcgcgccacc tcgtaggcaa gctcgaagtt cacgccggat 13680
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