透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、制法及其应用
技术领域
本发明涉及透明质酸改性技术领域，尤其涉及一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、制法及其应用。
背景技术
骨关节炎是比较常见的关节疾病，对患者的危害较大。目前，中国60岁以上的老年人中，有一半以上饱受骨关节炎的困扰。同时，由于年轻人运动不当和外伤导致的骨关节炎也越来越常见。骨关节炎的致残率高达53％。疼痛是骨关节炎最常见的症状，骨关节炎的治疗目的是缓解疼痛，延缓疾病进展，矫正畸形，改善或恢复关节功能，提高患者生活质量。
骨关节炎的治疗主要分为物理治疗、药物治疗和手术治疗。其中，关节腔内药物注射疗法，是向病变部位直接注射药物，因具有见效快、创伤小的治疗特点被广泛应用，所用药物主要分为西药注射剂和中药注射剂。西药注射剂主要包括透明质酸、糖皮质激素、富血小板血浆、医用臭氧、高渗葡萄糖、医用几丁糖、间充质肝细胞、细胞因子和基因疗法等新型制剂。中药注射剂主要包括注射川弓嗪注射液、盐酸青藤碱、参麦注射液、丹参注射液、舒血宁注射液和人参皂苷Rg1等。
透明质酸是治疗骨关节炎，尤其是膝关节炎的常用药物。透明质酸是关节滑液的主要成分，也是软骨基质的主要成分之一。透明质酸注射液可以润滑关节内的滑膜组织、各组织平面、韧带和胶原结构等，减少组织间的摩擦，达到增加弹性的效果，缓冲关节软骨的压力，改善周围组织的炎症反应，从而促进关节软骨的愈合和再生，帮助缓解疼痛，恢复膝关节的运动功能。
D-氨基葡萄糖，是合成关节软骨胶原、蛋白多糖的基础物质，存在于人体所有结缔组织中，绝大多数存在于软骨、滑膜和滑液中。改善病情的药物中最具代表性的是氨基葡萄糖类药物，其中又以硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐晶体的有效性最有保证，能够缓解症状和改善功能，同时长期服用可以延迟疾病的结构性进展。有研究发现，服用氨基葡萄糖类药物能够加速软骨细胞的再生和修复，刺激软骨弹性组织的修复、再造，预防软骨失去弹性，控制滑膜分泌液的平衡，减轻关节发炎，实现关节疾病从症状改善型到结构改善型的彻底治疗。
早期骨关节炎一般采取保守治疗，临床上最常用的治疗方法包括口服氨基葡萄糖和关节腔内注射透明质酸。许多研究表明，口服氨基葡萄糖联合透明质酸注射治疗骨关节炎的治疗效果优于两种方法的单独治疗，见效更快，显效更明显。但是，相对于向病变部位直接注射氨基葡萄糖，口服氨基葡萄糖治疗骨关节炎，存在口服后需要被吸收，然后进入体循环进行分布与代谢的过程，最后真正到达病变部位，发挥药效作用的氨基葡萄糖只占口服氨基葡萄糖含量的一部分，且见效较慢。为了更大限度发挥氨基葡萄糖对软骨的结构性改善效果，CN105982911A公开了一种氨基葡萄糖和透明质酸组合的高粘弹性注射液的制备方法。注射液主要成分为硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐和透明质酸。其优势在于改变了氨基葡萄糖高度引湿性、易氧化、难保存的特性，产品稳定性提高，疗效佳，耐药率低，不良反应少。CN110950976A公开了一种通过关节腔注射方式对骨关节炎模型大鼠具有较好的治疗效果的氨基葡萄糖透明质酸盐及应用，所述氨基葡萄糖透明质酸盐的制备方法如下：氨基葡萄糖盐类与透明质酸盐，混合或分别溶于水中，在透析袋中进行离子交换反应。氨基葡萄糖通过正离子(阳离子)与透明质酸的负离子(阴离子)结合，经浓缩后，用有机溶剂沉淀、喷雾干燥得固体粉末成品。
众所周知，透明质酸具有良好的生物相容性和生物降解性，是优良的填充剂，但其稳定性稍差，对人体内的自由基和透明质酸酶敏感，容易发生降解。因此，在保留透明质酸优良性能的前提下，有必要通过化学改性以提高其稳定性及其他性能。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种稳定性好、疗效佳、不良反应少的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物用于骨关节注射液，可以延长起效时间，减少注射次数。
本发明具体技术方案如下：
1.一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的制备方法，其包括下述步骤：
将缩合剂、氨基葡萄糖或其盐以及水混合得到混合溶液；
调节混合溶液的pH值，然后加入透明质酸或其盐进行酰胺化反应得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物。
2.根据项1所述的制备方法，其中，所述缩合剂为复合缩合剂，优选的，所述复合缩合剂为由碳二亚胺类和琥珀酰亚胺类组成的复合缩合剂；或者
所述复合缩合剂为由碳二亚胺类和苯并三唑类组成的复合物缩合剂；或者
所述复合缩合剂为由碳二亚胺类、琥珀酰亚胺类和苯并三唑类组成的复合缩合剂；
优选为由碳二亚胺类和琥珀酰亚胺类组成的复合缩合剂。
3.根据项2所述的制备方法，其中，
所述碳二亚胺类为碳二亚胺或碳二亚胺盐，优选的，所述碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺或1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺；
优选的，所述琥珀酰亚胺类为N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
优选的，所述苯并三唑类为N-羟基苯并三唑、3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑。
4.根据项3所述的制备方法，其中，所述碳二亚胺盐为碳二亚胺盐酸盐；优选地，所述复合缩合剂为由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺组成的复合缩合剂。
5.根据项1-4中任一项所述的制备方法，其中，调节混合溶液的pH值为7-10，优选为8-9。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸或其盐的分子量为900k-3000kDa，优选为900k-1500kDa。
7.根据项2-6中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸或其盐的羧基、碳二亚胺类以及琥珀酰亚胺类的摩尔比为1:0.5-2:0.5-2，优选为1:1-2:1-2。
8.根据项1-7中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸或其盐的羧基与所述氨基葡萄糖或其盐的氨基的摩尔比≤1，优选为0.2-1，进一步优选为0.2-0.5。
9.根据项1-8中任一项所述的制备方法，其中，酰胺化反应时间为2-8小时，优选为4-8小时。
10.根据项1-9中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸或其盐的浓度为10-200g/L，优选为50-100g/L。
11.根据项1-10中任一项所述的制备方法，其中，在进行酰胺化反应之后还包括加入水进行稀释后加入有机溶剂进行沉淀的步骤。
12.根据项11所述的制备方法，其中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇和丙酮中的一种或两种以上。
13.一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其通过项1-12中任一项所述的制备方法制备得到。
14.根据项13所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率在800μS/cm以下，优选为2-400μS/cm，进一步优选为2-200μS/cm。
15.根据项13或14所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，在透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基形成酰胺键，优选为25-40％的羧基形成酰胺键。
16.根据项13-15中任一项所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量为900k-3500kDa，优选为900k-1800kDa。
17.一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率在800μS/cm以下，优选为2-400μS/cm，进一步优选为2-200μS/cm。
18.根据项17所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物是透明质酸的羧基与氨基葡萄糖的氨基通过共价键连接形成酰胺键而形成的。
19.根据项17或18所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，在透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基形成酰胺键，优选为25-40％的羧基形成酰胺键。
20.根据项17-19中任一项所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量为900k-3500kDa，优选为900k-1800kDa。
21.一种骨关节注射液，其包括项1-12中任一项所述的制备方法制备得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物或者项13-20中任一项所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的浓度为0.5-2.0％(g/ml)。
发明的效果
本发明提供了一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物及其制备方法，并将接枝氨基葡萄糖的透明质酸衍生物用于制备骨关节注射液。透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物注射到关节腔内不仅可以直接恢复关节滑液的粘弹性，具有润滑和营养关节的作用，且有缓吸收性，注射到膝关节内后，透明质酸可以长时间停留在关节腔内，保持药效，并减少相互摩擦，预防关节和周围组织的粘连，并对氨基葡萄糖具有缓释作用，可维持氨基葡萄糖的长效作用机制，并且其制法简单、高效；在水溶液中进行，避免了使用有机溶剂带来的环保压力；反应条件温和，不会破坏反应体系中透明质酸或其盐的长链及分子结构，可以维持较高的分子量；通过缩合剂的介导，透明质酸与氨基葡萄糖之间通过稳定的共价键连接。
附图说明
图1是实验例1中的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、透明质酸与氨基葡萄糖透明质酸盐的酶解曲线对比示意图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的制备方法，其包括下述步骤：
将缩合剂、氨基葡萄糖或其盐以及水混合得到混合溶液；
调节混合溶液的pH值，然后加入透明质酸或其盐进行酰胺化反应得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物。
对于缩合剂，本发明没有任何限制，只要是能够使透明质酸或其盐的羧基与氨基葡萄糖或其盐的氨基发生酰胺化反应即可，例如，使用由碳二亚胺类物质和琥珀酰亚胺类物质组成的复合缩合剂，或由碳二亚胺类物质和苯并三唑类物质组成的复合缩合剂，或者由碳二亚胺类物质、苯并三唑类物质和琥珀酰亚胺类物质组成的复合缩合剂，优选为由碳二亚胺类物质和琥珀酰亚胺类物质组成的复合缩合剂，其是现有技术中常用的用于羧酸或胺的缩合酰化反应的缩合剂，所述碳二亚胺类物质可以为碳二亚胺或碳二亚胺盐，所述碳二亚胺例如可以为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(ETC)或1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺(CMC)，所述碳二亚胺盐例如可以为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
所述琥珀酰亚胺类物质例如可以为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。
所述苯并三唑类物质例如可以为N-羟基苯并三唑(HOBt)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧-1,2,3-苯并三唑(HOOBt)或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HAt)。
优选的，本发明所述的复合缩合剂为由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组成的复合缩合剂。
本发明通过将两种复合缩合剂进行联用，大大提高了缩合效率和程度。
本发明采用碳二亚胺类和琥珀酰亚胺类复合缩合剂制备透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的原理如下：
在偏碱性条件下，在EDC和NHS介导下，将透明质酸的羧基与氨基葡萄糖的氨基进行酰胺化反应，形成透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物。
反应过程表示如下：
所述氨基葡萄糖是一种重要的氨基己糖，由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，易溶于水及亲水性溶剂，俗称氨基糖，简称氨糖，又称为葡萄糖胺。所述氨基葡萄糖的盐例如氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐或者氨基葡萄糖磷酸盐。
如上图反应所示，接枝得到的产物(接枝产物)如下式(I)所示，其中透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物是透明质酸的羧基与氨基葡萄糖的氨基通过共价键连接形成酰胺键而形成的，在所得到的接枝聚合物中，透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基与氨基葡萄糖的氨基发生酰胺化反应，通过共价键连接形成酰胺键，从而形成接枝产物，在本发明的接枝聚合物中有一部分是以接枝产物的形式存在的，有些仍然是透明质酸本身，即接枝率＝透明质酸已接枝的二糖重复单元数量/透明质酸二糖重复单元的总量。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在加入透明质酸或其盐进行酰胺化反应之前，调节混合溶液的pH值，以使反应在中性或者碱性环境下进行，这种环境有利于避免氨基葡萄糖或其盐的伯氨基发生质子化，优选的，调节混合溶液的pH值为7-10，优选为8-9，例如调节混合溶液的pH值为7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或其之间的任意范围。
调节混合溶液的pH值可以用酸或者碱来调整，所述酸可以是本领域技术人员公知的酸，例如可以为盐酸、硫酸、硝酸等常用无机酸；所述碱可以是本领域技术人员公知的碱，例如可以是碱金属氢氧化物等常用无机碱，例如氢氧化钠。
对于透明质酸或其盐的分子量，本发明没有特别的要求，其可以根据产品的应用领域、作用等进行选择，例如，透明质酸或其盐的分子量可以为900k-3000kDa，优选为900k-1500kDa，例如，所述透明质酸或其盐的分子量可以为900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa或其之间的任意范围。
所述透明质酸盐例如可以为透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等，优选为透明质酸的钠盐。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸或其盐的羧基、碳二亚胺类以及琥珀酰亚胺类的摩尔比为1:0.5-2:0.5-2，优选为1:1-2:1-2，例如，所述透明质酸或其盐的羧基、碳二亚胺类以及琥珀酰亚胺类的摩尔比可以为1:0.5:0.5、1:0.5:1、1:0.5:1.5、1:0.5:2、1:1:0.5、1:1:1、1:1:1.5、1:1:2、1:1.5:0.5、1:1.5:1、1:1.5:1.5、1:1.5:2、1:2:0.5、1:2:1、1:2:1.5、1:2:2或其之间的任意范围。
所述透明质酸或其盐的羧基、碳二亚胺类以及琥珀酰亚胺类的摩尔比即是透明质酸或其盐的羧基/碳二亚胺类/琥珀酰亚胺类的摩尔比例。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸或其盐的羧基与所述氨基葡萄糖或其盐的氨基的摩尔比≤1，优选为0.2-1，进一步优选为0.2-0.5，例如，所述透明质酸或其盐的羧基与所述氨基葡萄糖或其盐的氨基的摩尔比可以为1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1等。
所述透明质酸或其盐的羧基与所述氨基葡萄糖或其盐的氨基的摩尔比即是所述透明质酸或其盐的羧基/所述氨基葡萄糖或其盐的氨基的摩尔比例。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，酰胺化反应时间为2-8小时，优选为4-8小时，例如，酰胺化反应时间可以为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时或其之间的任意范围。
为了使氨基葡萄糖或其盐与透明质酸或其盐能够更充分地反应，在加入透明质酸或其盐进行酰胺化反应之前，可以先在4℃左右维持10-30min，使所述透明质酸或其盐充分溶胀，然后在室温下进行反应。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在进行酰胺化反应之后还包括加入水进行稀释后加入有机溶剂进行沉淀的步骤，即先加入水进行稀释，然后加入有机溶剂进行沉淀。
所述有机溶剂例如可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇或丙酮。
在加入有机溶剂进行沉淀后，加入无机酸调节pH值至近中性，得到白色沉淀。
所述无机酸例如可以为盐酸、硫酸、硝酸等。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，其中，将所得到的白色沉淀用有机溶剂洗涤，脱水，去除残留小分子杂质，接着干燥得到。
所述的有机溶剂例如可以为乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙酮等。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸或其盐的浓度为10-200g/L，优选为50-100g/L，例如，所述透明质酸或其盐的浓度可以为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L或其之间的任意范围。
其中，所述透明质酸的浓度指的是在整个反应体系中透明质酸的终浓度。
透明质酸或其盐的浓度在此范围内，原料能较好的溶解，反应体系的粘度也不会太高，能较快的进行反应。如果透明质酸或其盐分子量较大，可以选择较小的浓度，以便于溶解和反应，如果透明质酸或其盐分子量较小，可以选择较大的浓度。
本发明提供了一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其是通过上述所述的制备方法制备得到。
所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物与透明质酸相比，具有抗透明质酸酶降解的性质，从而可以延长体内存留时间，起到长时间发挥润滑作用，并能够缓慢释放氨基葡萄糖，发挥双重功效。
所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，利用氨基葡萄糖的氨基与透明质酸的羧基形成共价键的酰胺键，与透明质酸相比，其水溶液的电导率更低。因此在配制骨关节注射液时，不同浓度对注射液的渗透压、电导率以及离子强度的影响可以忽略不计。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率在800μS/cm以下，优选为2-400μS/cm，进一步优选为2-200μS/cm。
例如所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率可以为2μS/cm、5μS/cm、15μS/cm、20μS/cm、25μS/cm、30μS/cm、35μS/cm、40μS/cm、45μS/cm、50μS/cm、55μS/cm、60μS/cm、65μS/cm、70μS/cm、75μS/cm、80μS/cm、85μS/cm、90μS/cm、95μS/cm、100μS/cm、110μS/cm、120μS/cm、130μS/cm、140μS/cm、150μS/cm、160μS/cm、170μS/cm、180μS/cm、190μS/cm、200μS/cm、210μS/cm、220μS/cm、230μS/cm、240μS/cm、250μS/cm、260μS/cm、270μS/cm、280μS/cm、290μS/cm、300μS/cm、310μS/cm、320μS/cm、330μS/cm、340μS/cm、350μS/cm、360μS/cm、370μS/cm、380μS/cm、390μS/cm、400μS/cm、410μS/cm、420μS/cm、430μS/cm、440μS/cm、450μS/cm、460μS/cm、470μS/cm、480μS/cm、490μS/cm、500μS/cm、510μS/cm、520μS/cm、530μS/cm、540μS/cm、550μS/cm、560μS/cm、570μS/cm、580μS/cm、590μS/cm、600μS/cm、610μS/cm、620μS/cm、630μS/cm、640μS/cm、650μS/cm、660μS/cm、670μS/cm、680μS/cm、690μS/cm、700μS/cm、710μS/cm、720μS/cm、730μS/cm、740μS/cm、750μS/cm、760μS/cm、770μS/cm、780μS/cm、790μS/cm、800μS/cm或其之间的任意范围。
所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率通过将所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物使用超纯水配置成0.5％(折干后)的水溶液进行测定的，即配成0.5％的水溶液时所测定的电导率。对于测量电导率的仪器没有限定，电导率表征的是溶液传导电流的能力，因此，只要是能够测定溶液的电流的仪器即可。
在一个具体的实施方式中，采用DDSJ-308A型电导率仪测定其电导率。所述的电导率仪用于测定一定浓度的溶液中传导电流的能力，例如，在本发明中，采用电导率仪测定在0.5％浓度下透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物溶液中传导电流的能力。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基形成酰胺键，优选为25-40％的羧基形成酰胺键。
例如，参与形成酰胺键的透明质酸的羧基的量可以为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％或其之间的任意范围。
所述的透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基形成酰胺键指的是在反应体系中，透明质酸的全部羧基中，20-40％的羧基与氨基葡萄糖的氨基发生酰胺化反应从而形成酰胺键，也可以称为接枝率。
对于接枝率，其是通过将透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物进行酶解得到酶解产物，然后对所得到的酶解产物进行测定从而得到接枝率。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，使用透明质酸酶优选细菌透明质酸酶对透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物进行彻底的酶解，然后对酶解产物进行测定得到接枝率，例如，采用分子排阻色谱法对酶解产物进行测定，根据面积归一法由分子排阻色谱图中接枝片段的峰面积占比计算得到；优选的，分子排阻色谱为Agilent-1260型高效液相色谱系统，色谱条件例如可以为：Superdex Peptide 10/300GL，流动相为10mmol醋酸铵，流速为0.5ml/min，进样量为25μl，柱温为25℃，检测器为可变波长检测器(VWD)，检测波长为232nm。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量为900k-3500kDa，优选为900k-1800kDa。
例如，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量可以为900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa、3100kDa、3200kDa、3300kDa、3400kDa、3500kDa或其之间的任意范围。
所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量可以通过包括多角度激光光散射仪的设备进行测定，优选通过多角度激光光散射仪与液相色谱系统进行联用来测定透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量；优选的，测定透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量的色谱条件可以为：流动相为0.2mol/L NaCl(包含0.02％NaN3)；流速为0.6ml/min；样品浓度为0.05mg/ml；柱温为35℃；进样体积为500μl。
本发明提供了一种透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的电导率在800μS/cm以下，优选为2-400μS/cm，进一步优选为2-200μS/cm。
优选的，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物是透明质酸的羧基与氨基葡萄糖的氨基通过共价键连接形成酰胺键而形成的。
优选的，在透明质酸的全部羧基中有20-40％的羧基形成酰胺键，优选为25-40％的羧基形成酰胺键；优选的，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的分子量为900k-3500kDa，优选为900k-1800kDa。
本发明提供了一种骨关节注射液，其包括上述所述的制备方法制备得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物或者上述所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物，其中，所述透明质酸-氨基葡萄糖接枝聚合物的浓度为0.5-2.0％(g/ml)，例如，所述注射液的浓度为0.5％(g/ml)、1％(g/ml)、1.5％(g/ml)、2％(g/ml)或其之间的任意范围。
通过将透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物注射到关节腔内不仅可以直接恢复关节滑液的粘弹性，具有润滑和营养关节的作用，且有缓吸收性，注射到膝关节内后，透明质酸可以长时间停留在关节腔内，保持药效，并减少相互摩擦，预防关节和周围组织的粘连，并对氨基葡萄糖具有缓释作用，可维持氨基葡萄糖的长效作用机制。
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
表1实施例和对比例所用到的原料来源表
实施例1
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入4.79g EDC、2.88g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸(1500kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应4h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物。
所得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量通过下述方法测定：
采用多角度激光光散射仪DAWN EOS(美国怀雅特公司)与液相色谱系统(美国安捷伦公司)联用测定透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物。色谱条件为：流动相为0.2mol/L NaCl(包含0.02％NaN3)；流速为0.6ml/min,；样品浓度为0.05mg/ml；柱温为35℃；进样体积为500μl。
接枝率的测定方法如下：
使用细菌透明质酸酶在温度为37℃，5mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液为介质下，对透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物进行彻底的酶解，然后采用分子排阻色谱法对酶解产物进行测定，根据面积归一化法，接枝率由分子排阻色谱图中接枝片段的峰面积占比计算得到。Agilent-1260型高效液相色谱系统，色谱条件为：Superdex Peptide 10/300GL，流动相为10mmol醋酸铵，流速为0.5ml/min，进样量为25μl，柱温为25℃，检测器为可变波长检测器(VWD)，检测波长为232nm。
电导率的测定方法如下：
将制备得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物折干后，用超纯水配制成0.5％(g/ml)溶液，采用DDSJ-308A型电导率仪测定其电导率。
通过上述方法得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量为1607kDa，测得的接枝率为27％，测得的0.5％溶液的电导率为148μS/cm。
实施例2
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入9.58g EDC、5.75g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至8.0，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸(900kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应8h，反应完成后加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为994kDa，接枝率为33％，电导率为101μS/cm。
实施例3
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入4.79g EDC、2.88g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至10.0，再向上述溶液中边搅拌边加入20g透明质酸(900kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应2h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为972kDa，接枝率为24％，电导率为290μS/cm。
实施例4
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入0.96g EDC、0.58g NHS和3.47g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至7.0，再向上述溶液中边搅拌边加入1g透明质酸(3000kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应4h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为3230kDa，接枝率为26％，电导率为133μS/cm。
实施例5
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入7.19g EDC、4.32g NHS和11.19氨基葡萄糖，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至8.5，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸钠(1200kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应6h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为1372kDa，接枝率为35％，电导率为90μS/cm。
实施例6
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入3.59g EDC、4.32g NHS和26.85g氨基葡萄糖，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至7.0，再向上述溶液中边搅拌边加入15g透明质酸钠(2000kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应3h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为2019kDa，接枝率为22％，电导率为322μS/cm。
实施例7
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入3.83gEDC、1.15gNHS和27.73g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得到混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至10.0，再向上述溶液中边搅拌边加入8g透明质酸(2400kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应4h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为2481kDa，接枝率为21％，电导率为303μS/cm。
实施例8
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入9.58g EDC、5.75g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至6，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸(900kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应8h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，得到固体粉末，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为830kDa，接枝率为4％，电导率为790μS/cm。
实施例9
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入9.58g EDC、5.75g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至11，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸(900kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应8h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，得到固体粉末，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为412kDa，接枝率为14％，电导率为733μS/cm。
表2实施例和对比例所用到的原料用量表
对比例1
(1)室温下，向100ml纯化水中依次加入9.58g EDC、5.75g NHS和13.86g氨基葡萄糖硫酸盐，完全溶解得混合溶液；
(2)用NaOH溶液将混合溶液的pH值调至4.5，再向上述溶液中边搅拌边加入10g透明质酸(900kDa)，分散均匀，放入4℃条件下活化10～30min，然后取出置于室温下反应8h，反应完成后，加入200ml纯化水稀释反应液，再加入2.5倍稀释液体积的乙醇进行沉淀，用盐酸调节沉淀混悬液的pH值至7.0，静置一段时间后，弃去上清液，沉淀用乙醇反复洗涤、脱水3次，最后抽滤除去液体，得湿粉末，将湿粉末放入40℃真空干燥，得到固体粉末，采用与实施例1相同的方法测定得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为801kDa，接枝率为0％，电导率为820μS/cm。
对比例1与实施例2的区别仅在于pH值不同，其他条件均相同，但制备得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的分子量和接枝率有很大的区别，在pH为4.5时，二者并没有发生接枝反应，说明只有在特定的pH值范围内，透明质酸或其盐与氨基葡萄糖或其盐才能发生接枝反应。
对比例2按照中国专利申请CN110950976A中记载的氨基葡萄糖透明质酸盐的技术方案制备氨基葡萄糖透明质酸盐
称取5g分子量为900KDa的透明质酸与5g氨基葡萄糖硫酸盐，溶解于水中，在截留分子量为7000Da的透析袋中透析3天，除掉小分子盐类，收集截留大分子产物，旋蒸浓缩后，乙醇沉淀，抽滤，真空干燥，得到氨基葡萄糖透明质酸盐。采用与实施例1相同的方法测定得到的氨基葡萄糖透明质酸盐的分子量、接枝率和0.5％超纯水溶液的电导率，得到分子量为893kDa，接枝率为0％，电导率为847μS/cm。
可以看出，透明质酸与氨基葡萄糖硫酸盐并没有发生接枝反应，可以明确透明质酸与氨基葡萄糖硫酸盐是以离子键形式存在的。
应用例1
取实施例1中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-甘油缓冲液配成1.0％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例2
取实施例2中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-甘油缓冲液配成1.5％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例3
取实施例3中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成2％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例4
取实施例4中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成0.5％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例5
取实施例5中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成1.5％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例6
取实施例6中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成2％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例7
取实施例7中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成1.8％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例8
取实施例8中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成0.5％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
应用例9
取实施例9中所得的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，以磷酸盐-NaCl缓冲液配成2％(g/ml)透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
对比例3
分子量950kDa的透明质酸，用磷酸盐-甘油缓冲液配成1.5％(g/ml)透明质酸凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
对比例4
取对比例2中所得的氨基葡萄糖透明质酸盐，以磷酸盐-甘油缓冲液配成1.5％(g/ml)氨基葡萄糖透明质酸盐凝胶，灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后可用于关节腔注射液。
实验例1透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物的抗透明质酸酶的酶解研究
细菌透明质酸酶可以特异性降解透明质酸，酶解产物中会出现双键，在232nm处有紫外吸收。因此A232能够反映酶解情况，A232数值越大，表示含双键的降解产物越多，酶解作用越强。
将实施例1制备的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、对比例2制备的氨基葡萄糖透明质酸盐与透明质酸分别配成0.2％溶液为底物，加入细菌透明质酸酶，在温度为37℃，5mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液为介质下进行酶解反应，加热煮沸2分钟以终止酶解反应。通过测定不同反应时间下酶解产物在232nm处的紫外吸收值，绘制两者的酶解曲线，其结果如图1所示。
由图1可以看出，随着酶解时间的推移，透明质酸和氨基葡萄糖透明质酸盐的A232值增长速度显著高于透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，表明透明质酸和氨基葡萄糖透明质酸盐被透明质酸酶降解的速度更快，而透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物具有明显的抗透明质酸酶降解作用，说明本发明所述的透明质酸-氨基葡萄糖的透明质酸和氨基葡萄糖是以共价键结合在一起，比较稳定，而对比例2中的氨基葡萄糖透明质酸盐的透明质酸和氨基葡萄糖是以离子键结合在一起的，在水溶液中易解离，稳定性比较弱，从而易于被透明质酸酶降解。
实施例2-10所得到的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物具有类似的技术效果。
实验例2透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物对炎症因子IL-1β和TNF-α的表达水平的影响
健康成年兔(购自山东省农业科学院)40只，体重2.5～3.0kg，雌雄不限。随机选择8只为空白对照组，剩余造模。各组兔均在相同条件下自由饮水摄食。
实验前预先配制0.4％木瓜蛋白酶溶液，配制方法为：木瓜蛋白酶4.0mg溶于1ml生理盐水中，加入盐酸半胱氨酸50mg，完全溶解后过0.22μm滤膜。
造模过程为：用2.0％的戊巴比妥溶液经兔耳边缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧固定于试验台上，刮去膝关节处毛，常规消毒，右侧膝关节注射0.4％木瓜蛋白酶溶液0.3ml，左侧作为正常对照。空白对照组兔不做处理。造模兔随机分为4组，每组8只，分别为模型组(0.3ml生理盐水)、透明质酸组(0.3ml对比例3注射液，关节腔注射)、氨基葡萄糖透明质酸盐组(0.3ml对比例4注射液，关节腔注射)、供试品组(0.3ml应用例2注射液)。造模后第7d给药，关节腔注射0.3ml/joint，每周一次，连续给药5周。
末次给药7d后试验结束，实验前兔过夜禁食不禁水，2.0％的戊巴比妥溶液麻醉，腹主动脉取血，制备血清，放于-80℃保存，用于检测血清炎症因子IL-1β、TNF-α。分别采用IL-1β酶联免疫分析试剂盒和TNF-α酶联免疫分析试剂盒测定IL-1β和TNF-α。测定结果见表3。
表3各组兔血清中炎症因子含量的比较
从实验结果可以看出，模型组兔血清中的炎症因子IL-1β和TNF-α水平显著高于空白对照组，说明兔骨关节炎造模成功；与模型组相比，透明质酸组、氨基葡萄糖透明质酸盐组和供试品组兔血清中的炎症因子IL-1β和TNF-α水平均显著降低；供试品组与透明质酸组、氨基葡萄糖透明质酸盐组对比，血清中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平降低更明显，说明关节腔注射透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物，能够显著降低炎症因子IL-1β和TNF-α的表达水平，且效果优于透明质酸和氨基葡萄糖透明质酸盐。
应用例1的注射液以及应用例3-9的注射液具有类似的技术效果。
综上所述，本发明所述的透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物注射关节腔内不仅可以直接恢复关节滑液的粘弹性，具有润滑和营养关节的作用，且有缓吸收性，注射到膝关节内后，透明质酸可以长时间停留在关节腔内，保持药效，并减少相互摩擦，预防关节和周围组织的粘连，并对氨基葡萄糖具有缓释作用，可维持氨基葡萄糖的长效作用机制。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
