被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物的制造方法、据此制造的光子结晶IPN复合物以及利用其的生物传感器
技术领域
本发明涉及一种被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物制造方法、据此制造的光子结晶IPN复合物以及利用其的生物传感器，更加详细地，涉及通过将PAA水凝胶渗透到固体状态的螺旋形光子结晶结构体并固定酶，从而通过由酶反应引起的pH变化引发PAA水凝胶的收缩和膨胀而显示出颜色变化的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物制造方法。
背景技术
生物传感器可以应用于多种领域，诸如医疗用途、环境用途、食品用途、军事用途、产业用途等。然而，目前为止应用的生物传感器技术为了识别希望检测的生物物质而需要大量样品。并且，麻烦的是，为了分析样品需要经过分析物投入步骤、信号生成步骤、信号放大步骤、复杂的分析结果解析步骤等非常复杂的过程才行，想应用到实际生活中则需要过于高昂的费用。
因此，虽然目前为了精密地分析少量的分析物质而使用利用以电化学方法、光学方法以及质量检测方法工作的转换器的多种传感器技术，但具有欲分析的样品的准备过程复杂，需要高价的专业设备的问题。
在这种观点下，可以容易地测出生物物质或者化学物质，并且能够利用在特定波长下反射光的光子结晶而不用电池的情况下以通过颜色(或者强度)变化来视觉性地进行感测的光传感器正在引起广泛关注。
在光子结晶中，胆甾相液晶(CLC：Cholesteric Liquid Crystal)表现出以赋予特定光学性质的螺旋形扭曲的分子取向，并且具有容易制造一维光子结构的优点。
所述胆甾相液晶的反射波长可以由下述式(1)表示。
λ＝n×P×cosθ---(1)
在胆甾相液晶以非偏光方式照射的情形下，由于被选择的波长的入射光和螺旋结构的相互作用而以给定的手性(handiness)的环形偏光(根据螺旋的手性而向左手方向缠绕或者向右手方向缠绕)而反射其强度的50％，剩余50％作为相反手性的环形偏光传输。
并且，如果胆甾相液晶物质的平均折射指数(n)恒定，则所述胆甾相液晶的反射波长(λ)将依赖于螺旋的螺距(P)。即，胆甾相光学物质根据螺旋的螺距而表现出选择性的光反射，据此表现出独特的反射图案，因此所述CLC可以利用随着外部刺激而变化的螺距而被用作传感器。
然而，由于以往的CLC被制造为液体状态的液滴，在长时间维持稳定度方面具有限制。
为了解决上述问题，研发了将CLC液滴胶囊化的方法，在此情形下，随着在高分子相将液晶胶囊化，高分子对液晶兼做乳化剂或者粘合剂的作用，从而具有制造方法简单的优点，但显然仍为液体状态，存在难以调节液晶滴(LC droplet)的尺寸或者分布的缺点。
因此，本发明人基于这些问题而致力于提供一种制造方法简单，不用精密的工具也可以通过颜色变化而肉眼检测生物体物质，并且能够长时间保管的固相的光子结晶复合物的制造方法而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明是为了解决如上所述的问题而提出的，其目的在于提供一种被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物制造方法。
并且，目的在于提供一种特征在于通过所述光子结晶IPN复合物制造方法而制造的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物。
并且，目的在于提供一种特征在于包括所述光子结晶IPN复合物而制造的生物传感器。
此外，本发明的目的不限于以上所提及的目的，根据以下的记载将可以明确理解未提及的其他目的。
技术方案
为了解决所述目的的根据本发明的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物的制造方法包括如下步骤：(1)在混合非反应性手性掺杂剂和反应性向列型液晶基元并固化后，在维持螺旋形结构的同时去除手性掺杂剂而制造固相的螺旋形光子结晶结构体；(2)使PAA水凝胶渗透到所述光子结晶结构体的内部空间后固化而形成IPN结构的复合物；以及(3)将酶固定到所述IPN结构的复合物。
并且，根据本发明的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物的特征在于通过所述光子结晶IPN复合物制造方法制造。
并且，根据本发明的利用被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物的生物传感器的特征在于利用所述光子结晶IPN复合物而制造。
技术效果
根据所述课题的解决方案，本发明的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物制造方法具有在从胆甾相液晶去除手性惨杂剂的同时维持胆甾相液晶所具有的独特螺旋结构，并且制造方法简单，制造费用低廉的效果。
并且，根据本发明的光子结晶IPN复合物制造方法制造的IPN复合物不仅由于被固定的酶而具有高选择性，还感测多重生物体，因此具有能够被用作具有多重感测能力的生物传感器的效果。
并且，利用本发明的光子结晶IPN复合物的生物传感器具有可以通过由于酶反应而变化的pH而引发PAA水凝胶的膨胀和收缩，从而显示出颜色变化而用肉眼也可以容易感测的效果。
附图说明
图1是示意性地示出根据一实施例的ICLCHPN脲酶的制造方法的图。
图2是示出向根据本发明的一实施例而制造的2×3ICLCHPN脲酶滴加7.5mM的尿素水溶液之后根据经过的时间的结果的照片。
图3是示出PAA水凝胶液滴的制造的照片，(a)为示出用于制造PAA水凝胶液滴的实验设备布置的照片，(b)为示出制造的PAA水凝胶液滴的照片。
图4是示出PAA水凝胶液滴的膨胀比的曲线图，(a)示出了根据交联剂的量的膨胀比，(b)示出了根据pH的膨胀比。
图5是示出根据尿素水溶液的浓度的PAA脲酶液滴的照片。
图6示出了根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的UV-Vis光谱。
图7示出了根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的反射波长。
图8是示出去除根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的掺杂剂前后以及UV固化后去除未反应AA的膜的照片。
图9是根据本发明的一实施例而制造的CLC膜和ICLCHPN膜的截取的表面的SEM图像以及各自的UV-Vis光谱。
图10示出了根据本发明的一实施例而制造的CLC膜、ICLCHPN膜以及ICLCHPN脲酶膜的FT-IR光谱。
图11示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜的光带隙的中间波长以及按pH的UV-Vis光谱。
图12为示出根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的照片，(a)为向倾斜的5×4ICLCHPN脲酶膜滴加尿素水溶液后的紧接着的照片，(b)为示出向3×3ICLCHPN脲酶膜滴加彼此不同的浓度的尿素水溶液之后的颜色变化的照片。
图13示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的选择性以及敏感性，(a)为显示出向2×3ICLCHPN脲酶膜滴加多种血液内成分之后的颜色变化的照片，(b)为显示出向2×4ICLCHPN脲酶膜滴加具有彼此不同的尿素浓度的人的血清之后的颜色变化的照片。
图14示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜和ICLCHPN脲酶膜的pH以及针对尿素水溶液的可逆性，(a)为显示出向2×2ICLCHPN膜交替滴加pH为2和12的水溶液之后的颜色变化的照片，(b)为显示出用水交替洗涤2×2ICLCHPN脲酶膜后滴加尿素水溶液之后的颜色变化的照片。
具体实施方式
本发明的优点和特征以及实现其的方法将通过参照附图和一起详细后述的实施例而变得明确。然而，本发明并不限于以下公开的实施例，而将以彼此不同的多种形态实现，本实施例只是为了使本发明的公开变得完整，并且向在本发明所属的技术领域具有普通知识的人员完整地告知发明的范围而提供的。并且，本说明书中使用的术语仅用于说明实施例，并不旨在限定本发明。在本说明书中，只要没有在语句中特别提及，则单数形式包括复数形式。
以下，参照附图详细说明本发明的优选实施例。此外，将简化或者省略具有相应技术领域的普通知识的人员能够容易地知道的构成以及关于其作用和效果的图以及详细说明，并以与本发明相关的部分为中心进行详细说明。
根据本发明的一方面，提供一种被酶功能化的固相的光子结晶互穿聚合物网络结构(IPN)复合物制造方法，包括如下步骤：(1)将非反应性手性掺杂剂和反应性向列型液晶基元混合并固化，然后在维持螺旋形结构的同时去除手性掺杂剂而制造固相的螺旋形光子结晶结构体；(2)使PAA水凝胶渗透到所述光子结晶结构体的内部空间之后，进行固化而形成IPN结构的复合物；以及(3)将酶固定化至所述IPN结构的复合物。
此外，根据所述制造方法制造的光子结晶IPN复合物可以被制造为部分形成在螺旋形光子结晶结构体的形态或者独立分布在玻璃基板上的形态。
详细地，特征在于包括如下步骤而制造成膜形态：(1)在平行地堆叠的两个基板之间注入混合了非反应性手性掺杂剂和反应性向列型液晶基元的混合物并进行固化，然后去除上部基板，并在维持螺旋形结构的同时去除手性掺杂剂，从而制造固相的螺旋形光子结晶膜；(2)通过在所述光子结晶膜上涂覆PAA水凝胶混合物，据此使PAA水凝胶渗透到所述光子结晶膜的内部空间并进行固化，从而形成IPN结构的复合物；以及(3)将所述IPN结构的复合物浸渍到酶水溶液中并进行固化，从而将酶固定到所述复合物。
此时，特征在于，所述酶为脲酶(Urease)、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase)、胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)或者肌酐脱亚氨酶(Creatinine deiminase)。
并且，特征在于，所述手性掺杂剂为选自于由C15、CB15、CM21、R/S-811、CM44、CM45、CM47、R/S-2011、R/S-3011、R/S-4011、R/S-5011以及R/S-1011构成的群中的任意一个掺杂剂，优选地，可以使用(S)-4-氰基-4'-(2-甲基丁基)联苯(CB15：(S)-4-cyano-4'-(2-methylbutyl)biphenyl)。
并且，特征在于，所述反应性向列型液晶基元为选自由RM 82、RM 257、RM308以及RMM727构成的群中的任意一个液晶基元，优选地，可以使用RMM727。
所述RMM727为包括丙烯酰氧(acryloyloxy)基、1,6-六亚甲基二醇二丙烯酸酯(1,6-hexamethylenediol diacrylate)、2-甲基-1-(4-甲基硫代苯基)-2-吗啉代丙烷-1-酮(2-methyl-1-(4-methylthiophenyl)-2-morpholinopropan-1-one)的混合物，并且可以将反应性丙烯酰氧基液晶基元(reactive acryloyloxy mesogen)APBMP、反应性丙烯酰氧基液晶基元(reactive acryloyloxy mesogen)AHBCMP、反应性丙烯酰氧基液晶基元(reactive acryloyloxy mesogen)AHBMP以及反应性丙烯酰氧基液晶基元(reactiveacryloyloxy mesogen)AHBPCHP用作包括所述丙烯酰氧基的材料。
根据本发明的另一方面，提供一种特征在于用所述光子结晶IPN复合物制造方法制造的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物。
用所述光子结晶IPN复合物制造方法制造的复合物即便从光子结晶结构体去除了手性掺杂剂，仍然原样维持螺旋结构形态，因此具有如胆甾相液晶的光反射特性。
因此，显示出螺距由于外部刺激而改变从而变化为用肉眼也可以容易地确认的反射颜色的本发明的被酶功能化的固相的光子结晶IPN复合物可以用作生物传感器。
所述生物传感器通过由酶的反应引起的pH变化而使PAA水凝胶的羧基被离子化，被离子化的所述羧基引起链间斥力，因斥力而被收缩及膨胀的PAA水凝胶引发所述光子结晶结构体的收缩及膨胀，从而使光带隙的波长范围被改变，据此感测生物高分子。
此时，其特征在于，所述波长范围的变化在pH 2至pH 12进行。
以下，通过实施例更加具体地说明本发明，但下述实施例不限制本发明的范围，其应当被解释为用于帮助理解本发明。
<实施例>
(1)材料
利用了RMM727(反应性LC混合物，Merck，英国)、(S)-4-氰基-4'-(2-甲基丁基)联苯((S)-4-cyano-4
并且，利用了氯仿(Duksan，韩国)、丙酮(Duksan，韩国)、聚酰亚胺(PI，LixonAligner，Chisso，日本)、NOA65(Norland Products，美国)、Micro-pearl(Sekisui，日本)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Sigma-Aldrich，美国)。
并且，利用了N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N
(2)CLC混合溶液的制造
通过磁力搅拌(Magnetic stirring)将预定量的RMM 727和CB15在60℃下混合了12小时。此时，用Φ表示了RM727与CB的比率。
将透明的所述CLC混合溶液完全搅拌并在25℃下冷却，从而制造了乳白色的CLC混合溶液。
(3)被酶功能化的IPN结构的阵列膜(ICLCHPN)的制造
图1是示意性地示出根据一实施例的ICLCHPN脲酶的制造方法的图。
参照图1说明则如下，依次用甲醇和去离子水洗涤玻璃基板(Marienfeld，德国)，并利用旋涂机(SPIN-1200D，Midas，韩国)用PI对准器(PI aligner)在所述玻璃基板将PI以2000rpm旋涂60秒之后用摩擦机(NamilOptical Components，韩国)涂擦而形成了上部基板。此时，涂擦了PI的上部基板可以通过平面锚定(anchoring)而使CLC膜整体配向，并且可以在UV固化后容易地去除。
可以利用旋涂机在又一玻璃基板将TMSPMA以3000rpm旋涂45秒，然后在65℃的烘箱中进行干燥，从而形成了可以与CLC混合溶液反应的下部基板。
利用用NOA65粘结的微珠(Micro-pearl)将所述上部基板和下部基板以平行的配向夹成6μm厚度之后，通过毛细作用力将所述CLC混合溶液插入，并利用UV固化机(Innocure100N，Lichtzen，韩国)在365nm重复20分钟开启5秒和关闭5秒的操作而进行了固化。
在UV固化后，去除被夹住的玻璃中的所述上部基板，将下部基板上的固化的CLC膜用丙酮洗涤10次而提取了手性掺杂剂。
在CLC膜涂覆AA/TPGDA/Irgacure 500(98.5wt％/0.5wt％/1.0wt％)混合溶液30分钟而使PAA水凝胶渗透到膜的内部空间，然后在6cm的距离利用光掩模(Photo mask)将所述膜UV固化10分钟而形成了IPN结构的复合物膜(以下称作“ICLCHPN”膜)。此时，在光掩模包括有直径2mm的点，并从点的中心分离为4mm左右的四边形。
然后，在pH 12下将ICLCHPN膜在EDC/NHS水溶液(0.2M/0.2M)浸渍1小时而进行了活化。将EDC偶联的ICLCHPN膜浸渍到脲酶水溶液(1wt％)而将脲酶结合之后，在空气中进行干燥而制造了被脲酶功能化的IPN结构的复合物膜(以下称作“ICLCHPN脲酶膜”)。
图2是示出向根据本发明的一实施例而制造的2×3ICLCHPN脲酶滴加7.5mM的尿素水溶液之后根据经过时间的结果的照片。参照图2说明则如下，所述ICLCHPN脲酶膜的颜色在向2×3膜的点滴加7.5mM的尿素水溶液后经过75分钟以上之后被饱和。
(4)PAA水凝胶液滴的制造
为了在后述的实验例(1)确认PAA水凝胶液滴的体积变化，用注射器将混合TPGDA和AA单体的AA/TPGDA混合溶液加入到装有聚二甲基硅氧烷(PDMS：Polydimethylsiloxane)前体的小瓶(vial)而制造了液滴。此时，在使用PDMS微流体(或者玻璃毛细管)的情形下，如果被现场紫外线(in-situ UV)固化则液滴会彼此融合，这是由于增加的密度而使管内液滴之间的距离接近，因此交联结合之后的移动变慢。
图3是示出PAA水凝胶液滴的制造的照片，(a)为示出用于制造PAA水凝胶液滴的实验设备布置的照片，(b)为示出制造的PAA水凝胶液滴的照片。
参照图3的(a)说明则如下，在0.3mm直径的注射头形成了1mm直径的AA/TPGDA溶液，并通过注射泵(LEGATO 100，kdScientific，美国)将速度控制为0.1μl/s而加入到PDMS小瓶中。此时，注射器为了在PDMS制造一系列的液滴而垂直移动，生成的PAA水凝胶液滴由于PDMS的高粘度(51泊)而基本被固定。
如图3的(b)所示，固定在小瓶内的液滴不融合而利用UV灯(Innocure100M，Lichtzen，韩国)在6cm距离固化了10分钟，然后在提取PAA水凝胶液滴并用氯仿洗涤之后在65℃的烘箱进行了干燥。将干燥后的PAA水凝胶液滴在EDC/NHS水溶液(0.2M/0.2M)浸渍1小时而活化，将用EDC偶联的PAA水凝胶液滴浸渍到脲酶水溶液(1wt％)而结合脲酶，然后在空气中干燥而制造了被脲酶功能化的PAA液滴(以下称作“PAA脲酶液滴”)。
(5)分析装置
使用在15kV的加速电压下工作的场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，SU8220，Hitachi，日本)测定了ICLCHPN膜的截面影像。具体地，以在截面涂覆有铂金的ICLCHPN膜为样品而进行了FE-SEM分析。
通过FTIR分光仪(FT/IR-4100，Jasco，日本)在600～4,000cm-1范围以4cm-1的分解能收集64scan的平均而测定了傅里叶变换红外线光谱(FTIR spectra：Fourier-transforminfrared spectra)。
利用紫外可见光谱仪(UV-Vis Spectrometer，UV-2401PC，Shimadzu，日本)并使用与UV-Vis光线垂直取向的膜测定了针对CLC膜的300～900nm范围的紫外可见光(UV-Vis)光谱。
<实验例>
(1)PAA水凝胶液滴的体积变化的确认
为了确认根据本发明的PAA水凝胶液滴的体积变化，根据交联剂的量以及pH分析了湿润/干燥的PAA水凝胶液滴的膨胀行为。
图4是示出PAA水凝胶液滴的膨胀比的曲线图，(a)示出了根据交联剂的量的膨胀比，(b)示出了根据pH的膨胀比。(a)示出了在pH9时根据作为交联剂的TPGDA的量(ζ)的膨胀比(Sr：Swelling ratio)，(b)示出了在含有PAA水凝胶液滴(ζ＝0.5wt％)的小瓶内根据pH的膨胀比。在图4的(b)插入了按pH的PAA水凝胶液滴的照片，照片的左侧上端记载的数字表示pH。膨胀比(Sr)被定义为V/V0，V和V0分别表示在湿润或干燥状态下的PAA水凝胶液滴的体积。
参照图4的(a)，在ζ达到0.5wt％为止，膨胀比表现出增加的倾向，在ζ为0.5wt％时表现出了最大值18.2，但此后随着ζ的增加，膨胀比大幅减小。在ζ为0～0.5wt％的情形下，由于不完整的交联结构，测出的膨胀比略低，在超过0.5wt％的情形下，可以确认膨胀比减小。这被判断为交联密度增加而导致膨胀比减小。
参考图4的(b)，已确认在含有PAA水凝胶液滴的小瓶内部的pH为2时，测出的膨胀比为2.6，直到pH达到7为止以大幅度增加，此后直到pH达到12为止仍然不断增加，在pH为12时膨胀比为21.7。
据此，在本发明中表现出，作为引发PAA水凝胶液滴的最大膨胀的交联结合剂的TPGDA的最优浓度为0.5wt％，且膨胀比随着pH的增加而增加。可确认膨胀比在pH 7时以最大幅度增加。
此外。根据EDC偶联的酶的固定化提供酶和PAA水凝胶液滴之间的共价键。确认了酶反应能否改变在ζ为0.5wt％时制造的PAA水凝胶液滴的pH和体积。
图5是示出根据尿素水溶液的浓度的PAA脲酶液滴的照片。
参照图5，在浓度为0mM、6.6mM、17mM以及50mM的尿素水溶液中，PAA脲酶液滴的尺寸分别被测定为2.15mm、2.37mm、2.63mm以及2.65mm。这被判断为随着尿素水溶液的浓度增加，由于脲酶以及尿素的酶反应而生成氨，氨在水中被分解为NH4+和OH-而使PAA脲酶液滴的体积膨胀增加。据此，可确认PAA脲酶液滴反应于分析物的酶反应。
(2)ICLCHPN膜的结构确认
为了确认根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜的结构，分析了UV-Vis光谱、照片以及SEM图像。
与此相关地，图6示出了根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的UV-Vis光谱，(a)是根据干式CLC膜的根据Φ的UV-Vis光谱，(b)是根据干式ICLCHPN膜的根据Φ的UV-Vis光谱，(c)是湿润ICLCHPN膜的根据Φ的UV-Vis光谱。此时，湿润ICLCHPN膜在pH为7的PBS缓冲溶液中。
并且，图7示出了根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的反射波长，(a)是根据干式CLC膜的根据Φ的UV-Vis光谱，(b)是干式ICLCHPN膜的根据Φ的UV-Vis光谱，(c)是湿润ICLCHPN膜的根据Φ的反射波长。此时，湿润ICLCHPN膜在pH7的PBS缓冲溶液中。
参照图6和图7，光带隙的峰值被明确确定。这表示在CLC膜，光结构在AA/TPGDA混合溶液的渗透和固化前后均很好地发展。在CLC膜使AA/TPGDA混合溶液渗透并进行固化之后，判断为ICLCHPN膜的反射波长由于由PAA增加的光带隙而增加。
并且，在干式ICLCHPN膜的AA/TPGDA混合溶液渗透和固化前后的反射波长比(r1)为在Φ＝20、22、24、26、28wt％时，分别被测定为1.17、1.19、1.22、1.29、1.34，掺杂剂的体积％(Φv)在Φ＝20、22、24、26、28wt％时分别被计算为22、24、26、28、30、32％。Φv表现为比(r1-1)×100的值稍高，表示从CLC膜提取CB15的空间几乎被AA/TPGDA填满。此时，由于PAA水凝胶为亲水性，从而可以通过水而溶胀，因此初始状态优选为湿润状态。
湿润ICLCHPN膜的光带隙表现为相比干式ICLCHPN膜的光带隙有所增加。若参照此，则从绿色到黄色以及红色的变化比其他颜色的变化更加敏感，因此在此后的实验中选择在Φ＝29.6wt％以绿色(λ＝550nm)为基准色。
图8是去除根据本发明的一实施例而制造的干式CLC膜、干式ICLCHPN膜以及湿润ICLCHPN膜的掺杂剂前后以及UV固化后去除未反应AA的膜的照片。
在图8的(a)是去除CB15之前的干式CLC膜(Φ＝29.6wt％)的图像，观察到了亮绿色；(b)是去除CB15之后的干式CLC膜(Φ＝29.6wt％)的图像，观察到了深蓝色；(c)是干式ICLCHPN膜的图像，观察到了亮蓝色。
据此，可确认在UV固化、掺杂剂提取以及AA/TPGDA混合溶液的渗透之后整个膜仍维持均匀的光结构，可确认从提取掺杂剂前后的CLC膜观察到的亮绿色(λ＝550nm)和蓝色(λ＝380nm)与作为被报告的螺旋形的螺旋扭曲力(Helicaltwist power)的9.86μm-1的亮绿色(λ＝555nm)以及蓝色(λ＝365nm)一致。
并且，(d)为用光掩模UV固化后去除未反应AA的干式ICLCHPN阵列膜的图像，其在蓝色背景上观察到了天蓝色的点。这种天蓝色点由于UV固化后交联结合的PAA，在洗涤未反应AA后也仍然被维持。然而，点以外的区域则恢复成蓝色背景，这表示由于AA/TPGDA混合溶液的提取而回到了与AA/TPGDA混合溶液渗透之前相同的光结构。(e)为用光掩模UV固化后去除未反应AA的湿润ICLCHPN阵列膜的图像，观察到ICLCHPN膜在被包括于pH 7的PBS缓冲液时反射色变成绿色。
从上述的结果可确认成功制造了利用CLC膜的ICLCHPN阵列膜。
图9是根据本发明的一实施例而制造的CLC膜和ICLCHPN膜的截取的表面的SEM图像以及UV-Vis光谱，(a)为示出垂直切割CLC膜的截面的SEM图像，(b)为垂直切割ICLCHPN膜的截面的SEM图像，(c)为示出CLC膜和ICLCHPN膜的UV-Vis光谱的图。
参照图9的(a)，在没有渗透AA/TPGDA混合溶液的CLC膜的截面观察到了间距为190±5nm的规则性的层状结构，可确认由于UV固化和掺杂剂提取而生成了固体状态的光结构。此时观察到的间距以p/2表示，p为螺旋的螺距。
参照图9的(b)，在AA/TPGDA混合溶液渗透而被固化的ICLCHPN膜的截面观察到了光结构的规则性原样地维持的同时如均质层状(Homogeneous lamellar)的结构，由于相互渗透的PAA网络，间距增加至220±6nm。并且，AA/TPGDA混合溶液渗透至提取了掺杂剂的空间，因此没有观察到缺陷和相分离的区域。由于AA的溶解度变量为与交联结合的RMM727(22MPa1/2)相似的24MPa1/2，可确认这是由于AA为适合RMM727的溶剂，因此AA/TPGDA混合溶液均一地渗透到了相互连接的RMM727。
参照图9的(c)，在AA/TPGDA混合溶液渗透而固化前(i)和后(ii)的ICLCHPN膜中分别在432nm和517nm(峰值的中心)观察到了完美的光带隙。并且，可以确认，在AA/TPGDA溶液渗透之前的情形下在UV固化后平坦度稍微下降，但光带隙的底部和上部边缘之间的平坦的区域的光结构非常规则。
从上述结果可确认将PAA水凝胶渗透到CLC膜而成功地制造了具有良好的光结构的ICLCHPN阵列膜。
(3)ICLCHPN膜的结构确认
为了确认根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的结构，分析了FT-IR光谱。
与此相关地，图10示出了根据本发明的一实施例而制造的CLC膜、ICLCHPN膜以及ICLCHPN脲酶膜的FT-IR光谱，(a)示出了CLC膜，(b)示出了ICLCHPN膜，(c)示出了ICLCHPN脲酶膜。
参照图10，CLC膜的光谱(a)在2856cm-1、2226cm-1、1727cm-1、1246cm-1以及836cm-1的波长分别观察到了-CH2、-CN、-C、＝O、-Ar-O-以及-Ar-的伸长带。可知这种峰值是RMM的液晶基元基团(Mesogenic group)以及间隔基团(Spacer group)引起的。
并且，ICLCHPN膜的光谱(b)在存在PAA的新的峰值的同时表现出与CLC膜相同的峰值。具体地，在3400cm-1、1408cm-1以及1565cm-1的波长分别观察到了在各个羧酸基团中非氢键合的-OH伸长带、COO-离子的对称和反对称伸长带(stretching band)。并且可以知道，由于相互渗透的PAA，在1158cm-1波长下的羧基的-C-O-延伸的强度变得比CLC膜的光谱更强，在1010cm-1波长下的TPGDA的C-O-C伸长峰值表示CLC膜中存在IPN结构的PAA。
并且，在ICLCHPN脲酶膜的光谱(c)的1109cm-1、1635cm-1以及3290cm-1的波长分别观察到了脲酶的-C-N、C＝O(酰胺Ⅰ)以及-N-H变形(酰胺Ⅱ)伸长带。
从上述结果可确认成功制造了固定有脲酶的ICLCHPN脲酶膜。
(4)ICLCHPN膜的pH反应性确认
为了确认根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜的pH反应性，分析了彼此不同的pH下的UV-Vis光谱。
在确认ICLCHPN膜的pH反应性之前，为了将ICLCHPN膜用作被酶功能化的生物传感器，重要的是确认光带隙的pH反应性。如在图4所观察，PAA液滴的体积随着pH增加而持续膨胀。如果在ICLCHPN膜的内部以相似的方式发生PAA的膨胀，则可以预测光带隙的波长也将随此而增加。
与此相关地，图11示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜的按pH的UV-Vis光谱以及光带隙的中间波长。
在图11的(a)，从曲线图的左侧沿右侧方向示出了pH 2、4、6、8、10以及12时ICLCHPN膜的UV-Vis光谱，明确观察到了根据pH的光带隙的变化。
图11的(b)作为pH函数而示出了示出带隙的中间波长的曲线图和按pH的ICLCHPN阵列点的照片，在各点的上端记载的数字为pH。光带隙的波长随着pH增加而增加，并在pH 8以上观察到了大的变化。即，在高pH的去质子化使PAA链膨胀，这导致CLC膜的螺旋螺距增加。
此时，在pH 7以上观察到了PAA液滴的最大膨胀(参考图4的(b))，在pH 8以上观察到了渗透到ICLCHPN膜的PAA的最大膨胀，这被判断为由于ICLCHPN膜为PAA渗透到CLC膜的内部空间的结构，因此PAA的膨胀增加受阻而使最大膨胀不一致。
从上述结果可确认，由于ICLCHPN膜的光带隙随着pH的变化而变化，因而适合引发局部pH变化的酶反应，从而可以应用到不用精密的工具二通过肉眼检测酶的生物传感器。
(5)ICLCHPN膜的酶反应性确认
为了确认根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的酶反应性，观察了在滴加酶的水溶液之后的颜色变化。
从实验例(1)的结果确认到PAA脲酶液滴对尿素的酶反应产生反应。ICLCHPN脲酶膜的酶反应可以增加pH，并且可以向ICLCHPN阵列的点滴加分析物溶液而使PAA的体积膨胀，因此预测可以增加ICLCHPN脲酶内的CLC螺距(以及反射色)。
与此相关地，图12为示出根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的照片，(a)为向倾斜的5×4ICLCHPN脲酶膜滴加尿素水溶液后的紧接着的照片，(b)为示出向3×3ICLCHPN脲酶膜滴加彼此不同的浓度的尿素水溶液之后的颜色变化的照片。此时，图12的(b)的点上记载的数字为尿素水溶液的浓度。
参照图12的(a)，可知ICLCHPN脲酶膜由于疏水性的CLC膜，在阵列的液滴之间没有交叉点。为了通过光学显微镜(或者肉眼)进行观察，通过微量移液管(micropipette)去除了过量的分析物溶液。
参照图12的(b)，在向ICLCHPN脲酶膜的点滴加尿素水溶液(3.5μL)之后，点的颜色从明亮的绿色变成了黄色。
具体地，在尿素水溶液的浓度为0.5mM和0.9mM的情形下，ICLCHPN脲酶膜的绿色没有变化，在1.9mM和3.8mM的情形下，观察到了绿色和黄色混合的混色，在7.5mM的情形下，观察到了黄色，在15mM以上的情形下黄色变成了红色。
此外，健康的人的血液内尿素浓度在成年男性的情形下为17～51mg/dL，成年女性的情形下为13～44.6mg/dL，因此为了将ICLCHPN脲酶用作脲酶生物传感器，应当在最高包括45mg/dL(7.5mM)浓度的尿素的样品中发生酶反应而使颜色变化。
因此，从上述结果可知，ICLCHPN脲酶膜的颜色变化十分依赖于脲酶水溶液的浓度，由于在浓度为7.5mM的尿素水溶液发生了颜色变化，因此确认到可以用作用于分析实际血液的尿素生物传感器。
(6)人的血清中ICLCHPN膜的选择性和敏感性评价
为了评价根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜在人的血清内的尿素选择性和敏感性，利用血液内成分和稀的血清(×10PBS缓冲液)进行了检测实验。
首先，利用实际人类的血液中存在的成分进行了检测实验。
与此相关地，图13示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN脲酶膜的选择性以及敏感性，(a)为显示出向2×3ICLCHPN脲酶膜滴加多种血液内成分之后的颜色变化的照片，(b)为显示出向2×4ICLCHPN脲酶膜滴加具有彼此不同的尿素浓度的人的血清之后的颜色变化的照片。
参照图13的(a)，将血液内的成分(i)尿素(0.21mg/dL)、(ii)葡萄糖(0.126mg/dL)、(iii)胆固醇(0.24mg/dL)、(iv)生物素(0.003mg/dL)、(v)抗坏血酸(0.017mg/dL)以及(vi)尿酸(0.006mg/dL)溶液(利用PBS缓冲溶液)分别按3.5μL滴入到阵列点后，可以确认ICLCHPN脲酶膜的颜色变化。具体地，只有滴入尿素溶液的ICLCHPN脲酶阵列膜的颜色变成了黄色，滴入其他成分的溶液的ICLCHPN脲酶阵列膜的颜色没有变化。
据此，确认了ICLCHPN脲酶膜针对尿素具有高选择性，并且可以用作尿素生物传感器。
接下来，利用用PBS缓冲溶液稀释的血清进行了检测实验。此时，已知人的血清包括胆固醇、葡萄糖、钠、铁、蛋白质、毒素以及中性脂肪，因此利用了稀释了不同浓度的尿素的血清。
在图13的(b)记载的数字为尿素水溶液的浓度。若参照此，则在尿素水溶液的浓度为3.5mM的情形下，ICLCHPN脲酶的绿色开始变成黄色，在7.5mM的情形下，显示为黄色，在14mM和28mM的情形下开始从黄色变成红色。这种结果与图12的(b)的结果相似，因此可知血清内的其他成分并不阻碍ICLCHPN脲酶的尿素检测性能。
从上述结果可确认，ICLCHPN脲酶提供针对尿素检测的充分的特异性，并且可以用于实际血液检查。
此外，分析了ICLCHPN和ICLCHPN脲酶阵列膜针对pH和尿素水溶液的可逆性。
与此相关地，图14示出了根据本发明的一实施例而制造的ICLCHPN膜和ICLCHPN脲酶膜的pH以及针对尿素水溶液的可逆性，(a)为显示出向2×2ICLCHPN膜交替滴加pH为2和12的水溶液之后的颜色变化的照片，(b)为显示出用水交替洗涤2×2 ICLCHPN脲酶后滴加尿素水溶液之后的颜色变化的照片。
参照图14的(a)，在滴入pH 2的水溶液而显示出天蓝色的ICLCHPN膜滴入pH 12的水溶液而使其变化为红色，(i)、(iii)、(v)以及(vii)为滴入pH 2的水溶液之后的ICLCHPN膜照片，(ii)、(iv)、(vi)以及(viii)为滴入pH 12的水溶液之后的ICLCHPN膜照片。在这样重复四次交替滴加pH2水溶液和pH 12水溶液的操作期间ICLCHPN膜在天蓝色和红色之间交替发生了变化，因此确认根据水溶液的pH而发生ICLCHPN内PAA水凝胶的可逆性的膨胀和收缩。
参照图14的(b)，向用水洗涤而显示出绿色的ICLCHPN脲酶膜滴入尿素水溶液(3.5μL，7.5mM)而将其变换为黄色，(i)、(iii)、(v)以及(vii)为用水洗涤后的ICLCHPN脲酶膜照片，(ii)、(iv)、(vi)以及(viii)为滴入尿素水溶液之后的ICLCHPN脲酶膜照片。在这样重复四次交替用水洗涤和滴入尿素水溶液的操作期间ICLCHPN脲酶膜在绿色和黄色之间交替发生了变化，因此确认到ICLCHPN脲酶膜可以用水简单洗涤而多次循环使用。
为了更好地理解本发明的权利要求书，前述的内容略微广泛地叙述了本发明的特征和技术要点。具有本发明所属的技术领域的普通知识的人员将能够理解可以不改变本发明的技术思想或者必要特征而以其他具体形态实施。因此，应当理解以上叙述的实施例在所有方面均为示例性而非限定性的。本发明的范围通过权利要求书而示出，而非通过上述详细说明而示出，应当解释为从权利要求书的范围以及其等同概念导出的所有改变或者变形的形态包括于本发明的范围。
