一种具有持续抗菌效果的双纳米酶抗菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米酶抗菌剂，具体涉及一种具有持续抗菌效果的双纳米酶抗菌剂及其制备方法，属于抗菌材料的制备技术领域。
背景技术
创伤愈合(wound healing)是指机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损后的愈复过程，损伤的程度及组织的再生能力决定修复的方式、愈合的时间及瘢痕的大小。通过人体自身的愈合能力来实现伤口的痊愈耗时长且容易受外界影响。例如，在身体表面产生创伤后如不及时处理伤口暴露在空气中，不仅会与外界接触时对伤口产生进一步伤害，伤口表面残留的细菌或者外界的细菌病毒更有可能进入伤口导致伤口感染恶化。各种致病微生物及其变异使创伤愈合更具挑战性，造成伤口感染延缓伤口愈合时间，这已影响了数百万人并造成数十亿的经济损失。应对感染伤口的抗菌材料需要及时清楚外来感染细菌和病毒，同时不会对伤口产生危害，促进伤口的愈合。因此，促进创面愈合的优质抗菌材料一直是国内外学者关注的热点。
对于促进伤口愈合的药物，抗生素因其高效的抗菌性而被广泛使用，在数十年的临床医疗应用中挽救了无数患者的生命，带来了革命性的影响，并且至今还在大范围的使用着。但经过几十年的使用以至滥用，产生的一系列耐药菌、超级细菌却产生了更大的问题。拥有广谱抗菌活性的银离子或银纳米粒子由此被研究以用于替代抗生素成为新的抗菌剂，但其较高的毒性限制了在实际创伤中的应用。即使在众多的研究中成功在保留部分抗菌活性的同时尽量抑制毒性，它对于伤口本身还是有着损伤。除此以外，市面上普通的伤口敷料会存在黏附伤口的问题，在去除敷料时将附着撕裂伤口，会对伤口产生二次伤害。
研究发现，在细胞代谢过程中，氧参与一系列反应，最终转化为活性氧(ROS)，如羟基自由基(·OH)、过氧化氢自由基(·OOH)、H2O2等。这些ROS是细胞在创面周围原位产生的，由于其高氧化能力，具有抗菌活性，可促进创面愈合。其中·OH是一种有效的抗菌剂，已应用于正常伤口愈合。虽然细胞自然产生的·OH在体内含量相对较低，但在葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶等特殊的天然酶的作用下，可由外源性底物葡萄糖或H2O2代偿产生。这种与上述两种酶协同作用的生产过程称为级联反应，葡萄糖分子首先转化为H2O2，然后再转化为·OH。在·OH的作用下，细菌的细胞膜容易与其他细胞还原性分子反应而破坏，增加氧化应激，从而抑制细菌的感染。
在决定使用·OH作为抗菌的有效因子后，如何使用易失活不易保存的·OH成为一个重要难题。·OH的产生可以由酶类的催化活性分解底物进行获得，而双氧水也有着易失活不易保存的特点，由此葡萄糖可作为双氧水的上一级底物，通过分解产生双氧水再次分解产生·OH进行抗菌。在上述过程中，可以由酶的级联反应轻松完成，即由葡萄糖氧化酶催化分解葡萄糖产生双氧水，再由过氧化物酶催化分解双氧水产生·OH进行抗菌。然而其中葡萄糖酶与过氧化物酶可以由自然界提取，但天然酶有自身的活性范围，容易受外界环境的影响导致失活，同时天然酶的提纯复杂、成本高昂和不易保存的问题使得纳米酶被用于作为天然酶的替代品模拟上述酶的活性进行生产。
两种纳米酶之间的协同作用，即一种酶的产物是另一种酶的底物，被成为级联反应，但是在这两种酶之间并非只有促进和协同，两种酶之间也存在着相互影响。并且虽然纳米酶相较天然酶具有对外界条件更好的稳定性，但是本身会随着时间流失由于粒子间的团聚而造成失活现象。因此，纳米酶之间的协调与活性的稳定也是必须解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种双纳米酶抗菌剂，该双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs内含金纳米与四氧化三铁两种纳米酶，其中金纳米酶能够模拟葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，而四氧化三铁纳米酶能够与金纳米协同反应，模拟过氧化物酶催化过氧化氢生成具有强氧化性的羟基自由基，氧化损伤细菌的细胞膜致使其破裂死亡。
除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种双纳米酶抗菌剂，其特征在于：所述双纳米酶抗菌剂(Au-Fe3O4@DMSNs)是在树突状介孔二氧化硅(DMSNs)的孔道中通过两次原位还原负载金纳米酶和四氧化三铁纳米酶制备而成。
研究发现，在树突状介孔二氧化硅(DMSNs)的孔道中通过两次原位还原负载金纳米酶和四氧化三铁纳米酶制备双纳米酶抗菌剂时，若同时负载金纳米酶(Au)和四氧化三铁(Fe3O4)纳米酶，两种纳米酶之间相互作用会导致团聚，失去活性；而先负载金纳米酶，再负载四氧化三铁纳米酶会导致Au粒子被包裹，无法发挥作用；先负载四氧化三铁纳米酶，再负载金纳米酶，级联反应则不受影响。优选的，所述双纳米酶抗菌剂是在树突状介孔二氧化硅的孔道中通过两次原位还原负载金纳米酶和四氧化三铁纳米酶制备而成；负载的金纳米与四氧化三铁两种纳米酶之间产生级联反应生成羟基自由基·OH进行杀菌；其中先负载四氧化三铁纳米酶，再负载金纳米酶。
上述双纳米酶抗菌剂中，负载四氧化三铁纳米酶的步骤为：先将含树突状介孔二氧化硅(DMSNs)的FeCl2和FeCl3混合溶液加入到NaOH溶液中，然后在N2气氛下搅拌反应20-40min，得到树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶(Fe3O4@DMSNs)。进一步，所述负载四氧化三铁纳米酶的步骤为先将含0.1M FeCl2和0.2M FeCl3的5mL溶液与0.1g树突状介孔二氧化硅混合，再加入到50mL NaOH溶液中，然后在N2气氛下搅拌反应30min，得到树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶。
上述双纳米酶抗菌剂中，负载金纳米酶的步骤为：将HAuCl4溶液与树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶(Fe3O4@DMSNs)混合，在400-800rpm下搅拌10-15h，然后将上述溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在N2气氛下混合，除去设备中的O2，将NaBH4加入到溶液中，反应10-30min，得到双纳米酶抗菌剂(Au-Fe3O4@DMSNs)。进一步，所述负载金纳米酶的步骤为将1.25x10-4M的HAuCl4与20mg树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶混合，在500rpm下搅拌12h，然后将上述溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在N2气氛下混合，除去设备中的O2；将NaBH4加入到溶液中，反应20min，得到双纳米酶抗菌剂。更进一步，上述NaBH4用量为NaBH4:Au＝5:1，以质量比计。
上述双纳米酶抗菌剂中，树突状介孔二氧化硅的制备步骤为：将三乙醇胺(TEA)溶于水中，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和水杨酸(NaSal)作为模板，将正硅酸四乙酯(TEOS)加入上述溶液中，反应2h，收集产物，用乙醇洗涤，去除残留的反应物；然后用HCl和CH3OH提取洗涤后的产品，干燥即得树突状介孔二氧化硅(DMSNs)。进一步，树突状介孔二氧化硅的制备步骤为将0.068g三乙醇胺(TEA)溶于水中，在80℃下搅拌0.5h，加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸(NaSal)作为模板，继续搅拌1h；然后将4ml正硅酸四乙酯(TEOS)加入上述溶液中，并保持300rpm搅拌2h，收集产物，用乙醇洗涤，去除残留的反应物；最后用HCl和CH3CH2OH的混合溶液在60℃下提取洗涤后的产品至少3次，干燥即得树突状介孔二氧化硅。
具体的说，一种双纳米酶抗菌剂的制备方法，采用如下步骤：
(1)树突状介孔二氧化硅的制备
将0.068g三乙醇胺(TEA)溶于水中，在80℃下搅拌0.5h，加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸(NaSal)作为模板，继续搅拌1h；然后将4ml正硅酸四乙酯(TEOS)加入上述溶液中，并保持300rpm搅拌2h，收集产物，用乙醇洗涤，去除残留的反应物；最后用HCl和CH3CH2OH的混合溶液在60℃下提取洗涤后的产品至少3次，干燥即得树突状介孔二氧化硅(DMSNs)；
(2)负载四氧化三铁纳米酶
先将含0.1M FeCl2和0.2M FeCl3的5mL溶液与0.1g DMSNs混合后加入50mL NaOH溶液中，然后在N2气氛下搅拌反应30min，得到树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶(Fe3O4@DMSNs)；
(3)负载金纳米酶的步骤
将1.25x10-4M的HAuCl4与20mg树突状介孔二氧化硅中负载的四氧化三铁纳米酶(Fe3O4@DMSNs)混合，在500rpm下搅拌12h，然后将上述溶液与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在N2气氛下混合，除去设备中的O2；将NaBH4加入到溶液中反应20min，其中NaBH4用量为NaBH4:Au＝5:1，以质量比计；即得双纳米酶抗菌剂(Au-Fe3O4@DMSNs)。
有益效果：
本发明提供一种双纳米酶抗菌剂(Au-Fe3O4@DMSNs)，通过负载的金纳米与四氧化三铁两种纳米酶之间的级联反应生成羟基自由基·OH进行杀菌。本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs是利用两种纳米酶的级联反应，将外加葡萄糖催化生成羟基自由基进行抗菌。本发明Au-Fe3O4@DMSNs双纳米酶抗菌剂能够在有充足的葡萄糖来源的情况下持续稳定的生成羟基自由基进行抗菌，其中Au纳米酶可以模拟葡萄糖氧化酶将葡萄糖催化为过氧化氢及葡萄糖酸，而Fe3O4纳米酶则可以模拟过氧化物酶催化中间产物过氧化氢生成羟基自由基。本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs由于使用了纳米酶，避免了天然酶受环境影响容易失活的问题。本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs的制备方法是通过在DMSNs上先负载Fe3O4纳米酶，然后负载Au纳米酶，两种纳米酶分散负载在介孔二氧化硅中保证了纳米酶之间的联系能够进行级联反应，同时因为介孔二氧化硅的阻隔避免了纳米酶常见的因团聚而导致的失活现象。本发明制备方法简单，适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明Au-Fe3O4@DMSNs的制备流程图；
图2是本发明Au-Fe3O4@DMSNs的使用原理图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所述原料及试剂均为市售产品。
(一)本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs的制备
Au-Fe3O4@DMSNs的制备流程如图1所示，将三乙醇胺(TEA)溶于水中(步骤①)，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和水杨酸(NaSal)作为模板(步骤②)，将正硅酸四乙酯(TEOS)加入上述溶液中(步骤③)，萃取洗净后制得树突状介孔二氧化硅(DMSNs)，然后先负载四氧化三铁纳米酶，再负载金纳米酶。
实施例1
本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs的制备步骤如下：将0.068g三乙醇胺(TEA)溶于水中，在80℃下轻轻搅拌0.5h，然后加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸(NaSal)作为模板，再搅拌1h。然后，将4ml正硅酸四乙酯(TEOS)加入上述溶液中，并保持300rpm搅拌2h，收集产物，并用乙醇洗涤，去除残留的反应物。最后，用混合溶液(HCl和CH3CH2OH)在60℃下提取洗涤后的产品至少3次，在烤箱中干燥后即为产物DMSNs。纳米酶的负载即先将含0.1M FeCl2和0.2M FeCl3的5mL溶液与0.1g DMSNs混合后加入50mL NaOH溶液中。然后溶液在N2气氛下高速搅拌反应30min，在DMSNs上生成四氧化三铁(Fe3O4)，形成Fe3O4@DMSNs；然后将1.25x10-4M的HAuCl4与20mg DMSNs混合，在500rpm下搅拌12h。将上述溶液与过量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在N2气氛下混合，除去设备中的O2。将NaBH4(NaBH4:Au＝5:1)加入到溶液中，反应20min，生成纳米金粒子(AuNPs)，制备成Au-Fe3O4@DMSNs双纳米酶抗菌剂。
参照实施例1，发明人考察了两种酶的负载顺序对制备的Au-Fe3O4@DMSNs双纳米酶抗菌剂的影响。结果发现，同时负载金纳米酶(Au)和四氧化三铁(Fe3O4)纳米酶，两种纳米酶之间相互作用会导致团聚，失去活性；而先负载金纳米酶，再负载四氧化三铁纳米酶会导致Au粒子被包裹，无法发挥作用；先负载四氧化三铁纳米酶，再负载金纳米酶，级联反应则不受影响。
参照实施例1，发明人考察了制备DMSNs过程中甲醇/盐酸＝1/1-10/1(体积比，38％浓盐酸)作为萃取液，以及乙醇/盐酸＝1/1-10/1(体积比，38％浓盐酸)作为萃取液对反应结果的影响，结果发现：乙醇/盐酸＝10/1(体积比，38％浓盐酸)在保证效果的同时能尽量减少成本及危险。
参照实施例1，发明人考察了制备Au纳米酶过程中还原条件对金纳米粒子形成的影响。发明人考察了①氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2s内快速加入还原氯金酸，醋酸作为保护剂；②氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2s内快速加入还原氯金酸，PVP作为保护剂；③氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2min内逐滴缓慢加入还原氯金酸，醋酸作为保护剂；④氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2min内逐滴缓慢加入还原氯金酸，PVP作为保护剂；⑤氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2s内快速加入还原氯金酸，PVP作为保护剂，共五种还原条件，结果发现：氮气环境下，在搅拌中硼氢化钠在2s内快速加入还原氯金酸，PVP作为保护剂，能够制备具有葡萄糖氧化酶活性的小粒径金纳米粒子。
(二)本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs的抗菌实验
本发明双纳米酶抗菌剂的原理如右图2所示，Au-Fe3O4@DMSNs内含金纳米与四氧化三铁两种纳米酶，其中金纳米酶能够模拟葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，而四氧化三铁纳米酶能够与金纳米协同反应，模拟过氧化物酶催化过氧化氢生成具有强氧化性的羟基自由基，金纳米与四氧化三铁通过级联反应生成的产物羟基自由基能够氧化损伤细菌的细胞膜致使其破裂死亡，防止伤口进一步感染促进伤口愈合。
发明人进行了酶活性检测实验，实验方法为：将0.2g葡萄糖配制成1ml溶液备用，将200μl/mg的样品取750μl加入到葡萄糖溶液中，将混合溶液培养4h，离心去除样品，取上清液进行检测。将3.85mgTMB配制成1ml溶液，取50μl溶液加入到750μl的上清液中，将混合溶液培养10min并观察颜色变化。OPD、ABTS显色反应实验方法同TMB。在最终溶液中，双纳米酶抗菌剂能够在葡萄糖的存在下催化生成·OH，TMB被氧化成蓝色，OPD氧化为橙红色，ABTS氧化为绿色，并且分别在紫外分光光度计检测下在655nm、450nm、420nm有明显峰值。
发明人进行了体外溶血试验，实验方法为：将一只新西兰大白兔的新鲜血液(5mL)加入抗凝用的3.8％柠檬酸钠，再加入PBS(10mL)中，然后以2500rpm离心5min，除去血清后获得红细胞RBCs。样品以不同的浓度和3mlPBS在37℃预热，然后加入60μL RBCs。混合物在37℃培养1h。PBS(3ml)与60μL RBCs被设置为消极对照组(-)，呈现澄清状态，3ml去离子水与60μLRBCs被设置为积极对照组(+)，表现为浑浊。培养后，将织物样品从混合物中取出，然后以2500rpm离心5分钟。用紫外-可见分光光度计在545nm波长下测定混合物上清液的吸光度。溶血率计算公式如下：溶血率(％)＝(Abs(s)-Abs(-))/(Abs(+)-Abs(-))×100％，其中，Abs(s)为样品的吸光度；Abs(+)为积极对照的吸光度；Abs(-)为消极对照的吸光度。结果显示，不同样品的溶血率保持在≤1％，与红细胞具有良好的生物相容性。
发明人进行了生物相容性实验，实验方法为：为了评估细胞毒性，L929小鼠成纤维细胞系(ATCC，cc-1)在Dulbecco改良的Eagle’s medium中与10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌药物培养。样品浸泡在无血清培养基(2ml)在37℃下培养24h，然后将去除样品的浸提液(100μL)分布到96孔板后。然后，将1×104 L929细胞在37℃下的浸出液中培养24h和48h，以纯细胞作为对照。四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液(10μL)被添加到每个孔中；4h后，二甲亚砜(100μL)进一步添加进溶液培养4h以溶解甲瓒晶体。最后，记录样品在490nm波长的吸光度。为了直观观察生物相容性，先用Calcein-AM/PI双染色试剂盒(40747ES76，YeasenBiological Technology Co.，Ltd.，Shanghai，China)同时染色活细胞和死细胞，再用荧光显微镜(Nikon TS 100，Tokyo，Japan)观察。实验结果显示：与样品培养的细胞生长状况良好，细胞存活率均在80％以上，并且在细胞染色中并没有太多死亡细胞。
发明人进行了动物实验，实验方法为：采用新西兰大白兔作为动物实验模型。所有家兔均注射盐酸甲苯噻嗪，剃须后在背部造4个直径2cm的全层圆形创口。伤口感染金黄色葡萄球菌(约107CFU/mL)，用无菌纱布覆盖，培养24h。其中2个伤口用Au-Fe3O4@DMSNs涂抹，分别添加双氧水与葡萄糖，一个伤口设置为空白，1个伤口商业化的抗菌剂敷料涂抹。随后，将兔子单独饲养在兔舍的笼子中，温度保持在25℃左右(每天进行检查以确保动物健康)。在感染后第5、10、15天分别测量伤口面积后实施安乐死。将伤口组织标本切下，用10％甲醛浸泡，在4℃保存，进行切片分析。实验结果显示：本发明双纳米酶抗菌剂在同组实验中表现出更加优异的抗菌效果及伤口愈合效果，在不同天数下的伤口细菌数也减少的最为明显，表现了其优异的持续抗菌效果，使用本发明双纳米酶抗菌剂Au-Fe3O4@DMSNs样品的伤口均比空白较快消除感染及愈合。
