一种基于鼻腔真核微生物相对丰度的评价保育猪个体所处生长环境温湿状态的方法
技术领域
本发明属于生猪养殖环境评定技术领域，具体涉及一种基于鼻腔真核微生物相对丰度的评价保育猪个体所处生长环境温湿状态的方法，本发明的思想也可以推广到其他动物乃至人的环境体感温湿状态评价领域。
背景技术
养殖环境是决定生猪养殖生产力的因素之一，对生猪养殖的贡献率高达25％，改善养殖环境是提高生猪养殖生产力必要的手段。温湿状态是养殖环境最重要的部分，它可以由温湿指数来表示。温湿环境可以从多角度影响生猪养殖生产力，冷应激和热应激的温湿环境下生猪的免疫力降低，高温下生猪的脂肪沉积降低肉质，处于非舒适环境温湿状态区域的生猪需要消耗更多能量维持恒定体温导致饲料转化率降低。目前调节养殖场生猪养殖温湿环境的设备有水帘风机降温系统和保温灯暖风机保暖系统，可以调节功率和产热量的保温灯已经被生产，精准养殖概念也被提出并且精准环境控制是精准养殖中的一部分。
生猪养殖环境的准确评价是进行精准环境控制的先决条件，目前生猪养殖过程中环境评价的温湿环境部分一般由温度计和湿度计完成。工人使用温度计和湿度计测量猪舍的温度和湿度再利用温湿指数计算公式计算出温湿指数并以之评定养殖舍的温湿环境,温湿指数可由干球温度(Td,℃)、湿球温度(Tw,℃)、露点(Tdp,℃)和相对湿度(RH,％)中的任意两个值，选用下列各计算公式之一计算：THI＝Td+0.36Tdp+41.2或THI＝0.81Td+(0.99Td-14.3)RH+46.3或THI＝0.72(Td+Tw)+40.6。这种方法能判定某一个时间点养殖舍的温湿环境状态，但对于一段时间内生猪所处的温湿环境状态无法准确评价。养殖舍的温湿状态一般随着时间改变而动态变化，同一畜舍的不同区域温湿状态也有差异，这导致温度计和湿度计在定时定点测量并计算的温湿指数难以评价一段时间内一定区域活动的生猪所处的温湿状态。环境温湿状态会影响真核微生物的生长，这在不同种类和水平的真核微生物上有不同体现，环境温湿状态会影响属水平真核微生物的生长，这在不同种类的真核微生物上有不同体现，酵母菌属(Saccharomyces)生长的最适温度条件为20-30℃，镰刀菌属(Fusarium)能够在1-39℃条件下生长但它的最适生长温度为25-30℃，根霉菌属(Rhizopus)适宜的生长温度较高为30-37℃，念珠菌属(Candida)的耐热性却不强。已有研究显示，冬季北方有暖气的室内温度过高，但相对湿度较低使得大量致病菌在呼吸道生长。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于鼻腔真核微生物相对丰度的评价保育猪个体所处生长环境温湿状态的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于鼻腔真核微生物相对丰度的评价保育猪个体所处生长环境温湿状态的方法是通过同时定量检测保育猪鼻腔真核微生物相对于鼻腔总真核微生物的相对丰度，并利用其或其组合评价保育猪生长所处环境温湿状态，所述真核微生物包括：Arthropoda菌门；Liliopsida菌纲、酵母菌纲(Saccharomycetes)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、金藻纲(Chrysophyceae)、色矛纲(Chromadorea)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)、Arachnida菌纲、共球藻纲(Trebouxiophyceae)、单巢纲(Monogononta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、Malasseziomycetes菌纲、隐藻纲(Cryptophyceae)、旋毛纲(Spirotrichea)、水螅纲(Hydrozoa)；Poales菌目、酵母菌目(Saccharomycetales)、双胃线虫目(Diplogasterida)、肉座菌目(Hypocreales)、Trichosporonales菌目、Neocallimastigales菌目、茶渍目(Lecanorales)、散囊菌目(Eurotiales)、Brassicales菌目、Rosales菌目、Chlamydomonadales菌目、马拉色菌目(Malasseziales)、Solanales菌目、线黑粉菌目(Filobasidiales)、Stolidobranchia菌目、Fagales菌目、环藻目(Sphaeropleales)、表壳目(Arcellinida)、银耳目(Tremellales)、丝藻目(Ulotrichales)、Pyramimonadales菌目、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、篓海绵目(Clathrinida)、Cystofilobasidiales菌目、眼虫目(Euglenida)、棕鞭藻目(Ochromonadales)、Rhizophlyctidales菌目、Anthoathecata菌目、未分类环藻目(unidentified_Sphaeropleales)、散囊菌目(Onygenales)；酵母菌科(Saccharomycetaceae)、Trichosporonaceae菌科、丛赤壳科(Nectriaceae)、Malasseziaceae菌科、Phaffomycetaceae菌科、赤革菌科(Hymenochaetaceae)、Mrakiaceae菌科、Lichtheimiaceae菌科、Rhizophlyctidaceae菌科；Zea菌属、单胞酵母属(Kazachstania)、棕鞭藻属(Ochromonas)、帚枝霉属(Sarocladium)、Bromeliothrix菌属、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、马拉色菌属(Malassezia)、Malus菌属、根霉菌属(Rhizopus)、Naganishia菌属、假丝酵母菌属(Candida)、Sterkiella菌属、Hemiptelea菌属、Spencermartinsiella菌属、根毛霉属(Rhizomucor)、Chlamydonella菌属、多形藻属(Distigma)、Tausonia菌属、锈齿革菌属(Hydnochaete)、四膜虫属(Tetrahymena)、Oryza菌属、毛孢子菌属(Trichosporon)、Hordeum菌属、Arabis菌属、肾形虫属(Colpoda)、Aegilops菌属、Pedospumella菌属、根囊壶菌属(Rhizophlyctis)、共球藻属(Trebouxia)；Zea_mays菌种、Kazachstania_telluris菌种、Tetrahymena_corlissi菌种、Rhabditidoides_humicolus菌种、Blastocystis_sp._subtype_3菌种、白色念珠菌(Candida_albicans)、Trebouxia_jamesii菌种、Naganishia_vishniacii菌种、Diutina_rugosa菌种、Hemiptelea_davidii菌种、Spencermartinsiella_europaea菌种、Bahusakala_longispora菌种、Distigma_proteus菌种、Tausonia_pullulans菌种、Hydnochaete_duportii菌种、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、Zea_mays.1菌种、Aegilops_tauschii菌种、Chlamydonella_irregularis菌种、Pedospumella_encystans菌种、Lasioseius_sp._APGD.2010菌种、Ammopiptanthus_mongolicus菌种。
所述方法的具体步骤为：
(1)建立并选取鼻腔微生物相对丰度与反映保育猪生长所处的温湿环境状态的保育猪所处环境温湿指数的回归模型(选取标准：R2>0.8，涉及p值的要求p<0.05)如下：
①纲水平：THI＝77.04-12.85x1-82.96x2+38.29x3+93.41x4-8.59x5-562.97x6-853.91x7+772.03x8+1543.54x9-24754.73x10+1117.40x11-4959.84x12+6713.67x13+212386.71x14-3805.85x15+30401.80x16；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.8613；
其中，THI为保育猪所处环境的温湿指数，x1至x16分别为保育猪鼻腔真核微生物Liliopsida菌纲、酵母菌纲、寡膜纲、金藻纲、色矛纲、粪壳菌纲、银耳纲、盘菌纲、Arachnida菌纲、共球藻纲、单巢纲、绿藻纲、Malasseziomycetes菌纲、隐藻纲、旋毛纲、水螅纲相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
②目水平：THI＝76.43-17.68x1-125.78x2-245.52x3-669.06x4-1091.73x5+1195.59x6-4130.28x7+3832.18x8+5401.91x9-22665.39x10-1262.74x11+6273.57x12-1213.96x13+94177.67x14-8138.89x15+778026.7x16+4940.84x17+95728.04x18-20800.44x19-104152.25x20+72337.23x21-260723.7x22+1.47x23-44706.57x24；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.8613；
其中，THI为保育猪所处环境的温湿指数，x1至x24分别为保育猪鼻腔真核微生物Poales菌目、酵母菌目、双胃线虫目、肉座菌目、Trichosporonales菌目、Neocallimastigales菌目、茶渍目、散囊菌目、Brassicales菌目、Rosales菌目、Chlamydomonadales菌目、马拉色菌目、Solanales菌目、线黑粉菌目、Stolidobranchia菌目、Fagales菌目、环藻目、表壳目、银耳目、丝藻目、Pyramimonadales菌目、锈革孔菌目、篓海绵目、Cystofilobasidiales菌目相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
③科水平：THI＝74.69403-118.91x1-114.10x2-293.41x3+577.06x4-718.67x5-130563.55x6-8165.30x7；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.8301；
其中，THI为保育猪所处环境的温湿指数，x1至x7为保育猪鼻腔真核微生物酵母菌科、Trichosporonaceae菌科、丛赤壳科、Malasseziaceae菌科、Phaffomycetaceae菌科、赤革菌科、Mrakiaceae菌科相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
④属水平：THI＝78.76-30.35x1-36.64x2+16.03x3-1109.55x4-2820.99x5-206.42x6+354.05x7-44705.11x8-22761.51x9+21032.98x10-35505.62x11-33058.75x12-27239.03x13-13604.5x14+165745.7x15-1.78x16-93578.76x17-41798.36x18-190048.3x19；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.9861；
其中，THI为保育猪所处环境温湿指数，x1至x19分别为保育猪鼻腔真核微生物Zea菌属、单胞酵母属(Kazachstania)、棕鞭藻属(Ochromonas)、帚枝霉属(Sarocladium)、Bromeliothrix菌属、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、马拉色菌属(Malassezia)、Malus菌属、根霉菌属(Rhizopus)、Naganishia菌属、假丝酵母菌属(Candida)、Sterkiella菌属、Hemiptelea菌属、Spencermartinsiella菌属、根毛霉属(Rhizomucor)、Chlamydonella菌属、多形藻属(Distigma)、Tausonia菌属、锈齿革菌属(Hydnochaete)相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
⑤种水平：THI＝77.30-26.08x1-101.62x2+12.81x3-393.02x4+5037.59x5-2847.75x6-18478.26x7+42621.47x8-31045.96x9-49866.91x10-49842.29x11+7253.92x12-80561.46x13-17228.1x14-59962.73x15；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.9741；
其中，THI为保育猪所处环境温湿指数，x1至x15分别为保育猪鼻腔真核微生物Zea_mays菌种、Kazachstania_telluris菌种、Tetrahymena_corlissi菌种、Rhabditidoides_humicolus菌种、Blastocystis_sp._subtype_3菌种、白色念珠菌、Trebouxia_jamesii菌种、Naganishia_vishniacii菌种、Diutina_rugosa菌种、Hemiptelea_davidii菌种、Spencermartinsiella_europaea菌种、Bahusakala_longispora菌种、Distigma_proteus菌种、Tausonia_pullulans菌种、Hydnochaete_duportii菌种相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
⑥门、纲、目、科、属、种总水平：THI＝80.43+509.55x1-112454.19x2-150.30x3-27328.24x4+69.95x5+11819.60x6+292830.3x7+7566.22x8-657.14x9-246075.5x10+32726.74x11-5440.98x12-15061.11x13+16105.21x14-45.89x15+110.18x16-42.21x17+26.51x18-5.98x19-31.19x20-1325.87x21+782.44x22+108.99x23-40055.25x24-132290.1x25+1083.27x26+11120.24x27-44335.50x28+2783.59x29-29868.41x30-3012.42x31-137311.8x32+1149.58x33-31.01x34-3115.54x35-6.96x36-49597.7x37-3632.9x38-377.93x39-232.58x40-12.80x41+39827.06x42-1074.11x43+1585.58x44+30.82x45-1343.39x46-91516.32x47-198.74x48+59262.55x49-9029.64x50-197163.71x51；该模型为LASSO模型，决定系数R2＝0.9925；
其中，THI为保育猪所处环境温湿指数，x1至x51为保育猪鼻腔真核微生物Arthropoda菌门、眼虫目、色矛纲、共球藻纲、棕鞭藻目、Brassicales菌目、Fagales菌目、环藻目、Rhizophlyctidales菌目、散囊菌目、Anthoathecata菌目、丝藻目、Cystofilobasidiales菌目、Lichtheimiaceae菌科、Rhizophlyctidaceae菌科、未分类环藻目、Zea菌属、四膜虫属、Oryza菌属、毛孢子菌属、帚枝霉属、Hordeum菌属、Arabis菌属、共球藻属、Malus菌属、肾形虫属、Naganishia菌属、假丝酵母菌属、Aegilops菌属、Sterkiella菌属、Hemiptelea菌属、Spencermartinsiella菌属、根毛霉属、Chlamydonella菌属、Pedospumella菌属、根囊壶菌属、多形藻属、Tausonia菌属、Rhabditidoides_humicolus菌种、丝孢酵母、Zea_mays.1菌种、Blastocystis_sp._subtype_3菌种、Trebouxia_jamesii菌种、Naganishia_vishniacii菌种、Aegilops_tauschii菌种、Spencermartinsiella_europaea菌种、Chlamydonella_irregularis菌种、Pedospumella_encystans菌种、Lasioseius_sp._APGD.2010菌种、Distigma_proteus菌种、Ammopiptanthus_mongolicus菌种相对于鼻腔总真核微生物的的相对丰度，所述相对丰度的单位为：％；
(2)定量测定保育猪鼻腔真核微生物相对丰度，将测得的结果带入对应的回归模型，计算获得保育猪短期内所处环境温湿指数。
其中，所述鼻腔真核微生物相对丰度指标基于IonS5TMXL测序平台的18S rDNA测序获得
下面对本发明作进一步说明：
保证保育猪养殖过程中的饲粮和品种一致，使用呼吸测热舱保证猪处于稳定的环境温湿状态并设计重复，鼻腔真核微生物相对丰度的波动只受到环境温湿状态的影响。本发明将不同温湿环境状态试验条件下保育猪每种鼻腔真核微生物相对丰度指标分别与对应环境的温湿指数做相关性分析，选取与温湿环境状态相关性较强的鼻腔真核微生物单指标建立模型(选取标准：相关性分析∣r∣>0.6，p<0.05)，也将鼻腔真核微生物相对丰度指标综合与对应的温湿指数利用Matlab软件建立并选取模型(选取标准：R2>0.8，涉及p值的要求p<0.05)，寻找能够准确反应温湿环境状态的鼻腔真核微生物相对丰度指标组合，使用鼻腔真核微生物相对丰度指标评价一段时间内保育猪所处的温湿环境状态并用温湿指数预测值表示，这使得保育猪生长的温湿状态评价更客观合理。
本发明中所述的动物为保育猪，亦可推广至生猪其他生长阶段乃至其他动物和人，本发明中提及的鼻腔真核微生物相对丰度检测方法并非唯一，其他能够实现准确地检测鼻腔真核微生物相对丰度的技术手段可以代替。
本发明中未提及的其他保育猪鼻腔真核微生物相对丰度单指标和指标组合，能够通过一元或者多元回归分析与环境温湿指数值构建模型的；其他猪的生产阶段(育肥猪、育成猪等)，能够通过保育猪鼻腔真核微生物单指标和指标组合通过一元或者多元回归分析与环境温湿指数值构建模型并用来评价环境温湿状态的；亦在本发明保护之内。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过测定保育猪对应的鼻腔真核微生物相对丰度并利用模型可以准确评价保育猪在过去短时间内所处的温湿环境(以温湿指数值表示)。计算得到的保育猪所处环境温湿指数对管理者调节保育猪舍的温度、湿度等因子具有指导意义，结合保育猪生长环境标准可以在生产过程中控制保育猪生长温湿环境始终处于最佳状态。
附图说明
图1为试验过程中的温湿指数变化趋势：横坐标为时间，纵坐标为温湿指数值，试验从第一日12:00开始到次日6:00结束，观测时间间隔均匀为30min(观测时间段内呼吸舱的温湿环境已处于稳定状态)，图中的温湿指数值由试验呼吸舱温度传感器和湿度传感器测量的干球温度与相对湿度经公式THI＝0.81Td+(0.99Td-14.3)RH+46.3计算得到，图中小框内的温湿指数值为试验总过程中的平均值(试验时间段内观测的温湿指数值求平均获得)。
具体实施方式
下述实施实例中所使用的实验方法、材料和试剂如无特殊说明，均为常规方法、材料和试剂，均可从商业途径得到。
1.试验动物
选择体重无显著差异的大白-长白二元杂保育猪40头并随机分为5组，每组8头(n＝8),每组中每头试验保育猪都单栏饲养于呼吸舱中，供给足够的饮水，提供相同的参照NRC标准配置饲料，自由采食。
2.试验过程和样品采集
控制试验保育猪在呼吸测热舱中的温湿环境，每组的温湿环境一样，在该试验中温湿环境是通过空调控制的。经后期计算，试验周期内5组试验猪生长的环境温湿指数分别为57.5、62.1、74.4、81.8、83.7(计算过程详见附图说明)。每头试验猪在稳定的温湿环境下饲养约20h，之后使用医用灭菌棉刮取保育猪鼻腔前庭以收集保育猪鼻腔真核微生物样品。
3、鼻腔微生物样品检测和数据分析
利用IonS5TMXL测序平台的18S rDNA测序检测鼻腔微生物样本的真核各个水平的相对丰度。利用IBM SPSS Statistics软件将单个鼻腔真核微生物相对丰度与试验温湿指数做相关性分析并选取与温湿环境状态相关性较强的鼻腔真核微生物单指标建立模型(选取标准：相关性分析∣r∣>0.6，p<0.05)，然后将鼻腔真核微生物相对丰度指标综合与对应的温湿指数利用Matlab软件建立并选取模型(选取标准：R2>0.8，涉及p值的要求p<0.05)，寻找能够准确反应温湿环境状态的血液代谢物指标组合。
4、试验结果(见表1和图1)
表1利用保育猪鼻腔真核微生物指标计算保育猪所处环境温湿指数回归方程
鼻腔真核微生物相对丰度单指标无法与环境温湿指数建立符合选取标准的回归模型，但利用鼻腔真核微生物指标组合评价保育猪短时期所处的环境温湿指数是可行的。利用鼻腔真核微生物组合评价保育猪生长所处环境温湿状态的最佳模型为：THI＝80.43+509.55x1-112454.19x2-150.30x3-27328.24x4+69.95x5+11819.60x6+292830.3x7+7566.22x8-657.14x9-246075.5x10+32726.74x11-5440.98x12-15061.11x13+16105.21x14-45.89x15+110.18x16-42.21x17+26.51x18-5.98x19-31.19x20-1325.87x21+782.44x22+108.99x23-40055.25x24-132290.1x25+1083.27x26+11120.24x27-44335.50x28+2783.59x29-29868.41x30-3012.42x31-137311.8x32+1149.58x33-31.01x34-3115.54x35-6.96x36-49597.7x37-3632.9x38-377.93x39-232.58x40-12.80x41+39827.06x42-1074.11x43+1585.58x44+30.82x45-1343.39x46-91516.32x47-198.74x48+59262.55x49-9029.64x50-197163.71x51(门、纲、目、科、属、种水平综合，LASSO模型，决定系数R2＝0.9925)，其中，THI为保育猪所处环境温湿指数，x1至x51分别为保育猪鼻腔真核微生物Arthropoda菌门、眼虫目(Euglenida)、色矛纲(Chromadorea)、共球藻纲(Trebouxiophyceae)、棕鞭藻目(Ochromonadales)、Brassicales菌目、Fagales菌目、环藻目(Sphaeropleales)、Rhizophlyctidales菌目、散囊菌目(Onygenales)、Anthoathecata菌目、丝藻目(Ulotrichales)、Cystofilobasidiales菌目、Lichtheimiaceae菌科、Rhizophlyctidaceae菌科、未分类环藻目(unidentified_Sphaeropleales)、Zea菌属、四膜虫属(Tetrahymena)、Oryza菌属、毛孢子菌属(Trichosporon)、帚枝霉属(Sarocladium)、Hordeum菌属、Arabis菌属、共球藻属(Trebouxia)、Malus菌属、肾形虫属(Colpoda)、Naganishia菌属、假丝酵母菌属(Candida)、Aegilops菌属、Sterkiella菌属、Hemiptelea菌属、Spencermartinsiella菌属、根毛霉属(Rhizomucor)、Chlamydonella菌属、Pedospumella菌属、根囊壶菌属(Rhizophlyctis)、多形藻属(Distigma)、Tausonia菌属、Rhabditidoides_humicolus菌种、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、Zea_mays.1菌种、Blastocystis_sp._subtype_3菌种、Trebouxia_jamesii菌种、Naganishia_vishniacii菌种、Aegilops_tauschii菌种、Spencermartinsiella_europaea菌种、Chlamydonella_irregularis菌种、Pedospumella_encystans菌种、Lasioseius_sp._APGD.2010菌种、Distigma_proteus菌种、Ammopiptanthus_mongolicus菌种相对于鼻腔总真核微生物的相对丰度(单位：％)。
