一种保持α1-微球蛋白稳定的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物诊断试剂领域，具体涉及制备α1-微球蛋白的检测试剂盒时保持α1-微球蛋白稳定的组合物及其制备方法。
背景技术
α1-微球蛋白(alpha-1-microglobuIin,α1-MG)是人体内的一种相对分子量较小的糖蛋白，又称人复合蛋白(human%20complex-forming%20protein，HC%20protein),由Ekstr%20m等于20世纪70年代初首先从镉中毒患者的尿液中分离、提纯,因电泳时位于α1区带故而得名。国内外学者对α1-MG的来源，生化特性以及临床应用价值等进行了大量研究。
α1-MG是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成。与人类白细胞抗原HLA-A11，HLA-B20和HLA-51等抗原决定簇有交叉反应。α1-MG广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1-MG以两种形式存在，即游离的α1-MG和与IgA结合的α1-MG(a%20lMG-lgA)。正常情况下，α1-MG-1gA约占血液中总α1-MG的40-70％，血液中免疫球蛋白水平对α1-MG及α1-MG-1gA之间的比例有影响。血液中游离的α1-MG可自由通过肾小球滤过膜，95％-99％在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出；而结合型的α1-MG则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度为零。
目前临床上研究较多的是血清及尿液中α1-MG的测定，血、尿α1-MG的定性检查主要用胶乳凝集法，定量法则可以单向免疫扩散法(SRID)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELASA)及胶乳凝集免疫反应法，不同的检测方法所得的α1-MG值略有差异，但相同检测方法所得的结果相近，血清中α1-MG的含量为10---42mg/L.尿中<6mg/L。.血清α1-MG升高多见于各种原因所致肾小球谑过功能损伤，也见于IgA型骨髓瘤、肝癌等。在判断肾小球滤过功能损伤上，血清α1-MG与血清胱抑素C的诊断性能相当。血清α1-MG降低提示重度肝功能损害致其生成减少。游离的α1-MG可自由通过肾小球滤过膜，95％-99％在肾近曲小管重吸收和代谢。正常情况下尿中α1-MG含量甚微，当肾小管受损时，尿中α1-MG排泌增高。血清或尿液中的α1-微球蛋白的检测，对于肾功能疾病的诊断、进展评估和预后都具有重要意义。
胶乳免疫比浊法是一种新型的免疫检测技术，试剂中的抗体或抗原包被于聚苯乙烯粒子上，通常直径在50～300nm左右，样本中的抗原或抗体与试剂中包被于聚苯乙烯粒子上的抗体或抗原结合，形成不溶性免疫复合物，该免疫复合物由于包被的聚苯乙烯粒子而使浊度进一步放大，在抗原或抗体足量的情况下，其浊度与人血清中抗原或抗体含量成正比，与相同条件下操作的校准品比较，通过剂量/反应曲线求出样品中待检物的含量。
为使校准品中的蛋白保持稳定以提高测量的准确度，现有技术主要通过外部手段来维持蛋白的构象以保护蛋白的稳定、抑制非特异结合，避免微生物分解，主要通过添加抑菌剂、赋形剂、表面活性剂、无机盐等物质、或采用冻干等技术手段来保持目的蛋白的活性。对一些蛋白稳定性较好的蛋白能起到较好的效果，但是目前很多抗原抗体稳定性较差，即使添加赋形剂、PEG等也很难保持蛋白的稳定，而采用冻干技术制备，必然带来复溶这一过程，增加试剂的操作难度和成本。因此本领域亟需获得一种能够有效保持蛋白稳定的保持α1-微球蛋白稳定的组合物及其制备方法。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明采用了以下技术方案：
本发明一方面提供了一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，包括：试剂1和试剂2；其中，所述试剂1包括：蛋白类物质、糖类物质、缓冲液、表面活性剂以及防腐剂；所述试剂2包括：改性剂；
进一步的，所述蛋白类物质选自牛血清白蛋白(即BSA)，酪蛋白，免疫球蛋白中的一种或多种；进一步优选的，所述蛋白类物质为牛血清白蛋白(即BSA)；
更进一步的，所述蛋白类物质占所述组合物的浓度为30～100g/L；优选的，所述蛋白类物质占所述组合物的浓度为70g/L；
进一步的，所述糖类物质选自海藻糖，山梨醇，岩藻糖，蔗糖，果糖，乳糖中的一种或多种；进一步优选的，所述糖类物质为乳糖；
更进一步的，所述糖类物质占所述组合物的浓度为10～50g/L；优选的，所述糖类物质占所述组合物的浓度为40g/L；
进一步的，所述缓冲液为两性离子缓冲液；更进一步的，所述缓冲液选自N-(2-羟乙基)哌嚓-N-(2-乙磺酸)(即HEPES)，3-(环己胺)-1-丙磺酸(即CAPS)，N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(即Bicine)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(即TAPS)中的任意一种或几种；进一步的，所述缓冲液的pH为7～11；进一步优选的，所述缓冲液为3-(环己胺)-1-丙磺酸(即CAPS)，其pH为9.5；
更进一步的，所述缓冲液占所述组合物的浓度为10～100mmol/L；优选的，所述缓冲液占所述组合物的浓度为50mmol/L；
进一步的，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂，优选甘油，吐温，曲拉通X-100(即TX-100)，聚氧乙烯与聚氧丙稀的ABA型嵌段共聚物(即缩写为PEG-PPG-PEG)中的一种或几种；进一步优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物(即缩写为PEG-PPG-PEG)、且其平均分子量为5000，其中聚氧乙烯占所述共聚物质量分数的60％；
更进一步的，所述表面活性剂占所述组合物的浓度为1～10g/L；优选的，所述表面活性剂占所述组合物的浓度为5g/L；
进一步的，所述防腐剂选自叠氮钠，邻乙汞硫基苯酸钠，proclin300中的一种或几种；进一步优选的，所述防腐剂为叠氮钠；
更进一步的，所述防腐剂占所述组合物的浓度为0.1～1.0g/L；优选的，所述防腐剂占所述组合物的浓度为0.5g/L；
进一步的，所述改性剂为氨基-聚乙二醇-羧酸(即NH2-PEG-COOH)、且其平均分子量为5000；
更进一步的，所述改性剂1～10g/L；优选的，所述改性剂占所述组合物质量百分含量5g/L；
本发明的第二方面还提供了一种上述任一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1制备试剂1：按照上述组合物中浓度取配方量的缓冲液，然后按照上述组合物中各物质浓度配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，定容至组合物中所有物质均达到配方浓度，即得；
S2制备试剂2：按照上述组合物配方中浓度取一定质量的氨基-聚乙二醇-羧酸，即得；
本发明的第三方面提供了一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的方法，包括以下步骤：
S1：按照上述方法制备保持所述α1-微球蛋白稳定的组合物；
S2：分别配制浓度比为1:4～1:15的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)两种溶液备用；优选的，所述EDC和NHS溶液浓度比为1:10；
S3：取浓度为1～2g/L的α1微球蛋白溶液，调节其pH至7～8，然后先后向所述α1微球蛋白溶液中加入NHS溶液和EDC溶液，且α1微球蛋白溶液：NHS溶液：EDC溶液体积比为5:1:1，将上述反应体系在室温下震荡20～60min，转至透析袋中，室温下震荡透析20～60min，停止透析；优选的，所述pH为7.4；优选的，所述室温震荡时间为30min；优选的，所述透析时间为30min；
S4：向步骤S3获得的反应体系中加入步骤S1获得的试剂2NH2-PEG-COOH，震荡反应100～150min，停止反应，然后再将上述反应体系震荡透析40～90min；优选的，所述反应时间为120min；优选的，所述透析时间为60min；
S5：向步骤S4获得的的反应体系中加入步骤S1获得的试剂1，即得。
有益效果
首先，本发明所述的保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，通过在组合物中添加合理配比的、特定的表面活性剂以及改性剂，能够显著保持α1-微球蛋白稳定，进而保持校准品稳定，减少外界干扰，保持测试结果的稳定，由实施例的实验结果来看，测试结果是十分稳定的；其次，本发明的制备条件以及制备工艺简单，并未利用冻干工艺，不存在复溶这一技术难题，利于实施和工业化生产，降低工艺难度以及成本，能够有效了解血清或尿液中的α1-微球蛋白的检测，对于肾功能疾病的诊断、进展评估都具有重要意义，具有良好的市场应用前景。
具体实施方式
实施例1：
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下组分：试剂1：牛血清白蛋白7g、果糖4g、Bicine%2050mmol/L(pH%208.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG(且其平均分子量为5000、共聚物中聚氧乙烯质量百分含量为60％)0.5g以及proclin300%200.05g；试剂2：NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g；制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方中浓度取缓冲液Bicine%20100mmol/L(pH%208.5、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，然后加水定容至100mL，即得；S2制备试剂2：按照上述配方中浓度称取NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g，即得。
实施例2
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：试剂1：酪蛋白7g、乳糖4g、TAPS%2050mmol/L(pH%209.2、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG(且其平均分子量为5000、共聚物中聚氧乙烯质量百分含量为60％)0.5g以及叠氮钠0.05g；试剂2：NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g；制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方中浓度取缓冲液TAPS%20100mmol/L(pH%209.2、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，然后加水定容至100mL，即得；S2制备试剂2：按照上述配方中浓度称取NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g，即得。
实施例3
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：试剂1：牛血清白蛋白3g、乳糖1g、CAPS%2020mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG(且其平均分子量为5000、共聚物中聚氧乙烯质量百分含量为60％)0.1g以及叠氮钠0.01g；试剂2：NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.1g；制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方的质量百分比取CAPS%2040mmol/L(pH%209.5、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，然后加水定容至100mL，即得；S2制备试剂2：按照上述配方的质量百分比称取NH2-PEG-COOH1g，即得。
实施例4
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：试剂1：牛血清白蛋白10g、乳糖5g、CAPS%20100mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG(且其平均分子量为5000、共聚物中聚氧乙烯质量百分含量为60％)1g以及叠氮钠0.1g，试剂2：NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)1g；制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方中浓度取缓冲液液CAPS%20200mmol/L(pH%209.5、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，然后加水定容至100mL，即得；S2制备试剂2：按照上述配方中浓度称取NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g，即得；
实施例5
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：试剂1：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG(且其平均分子量为5000、共聚物中聚氧乙烯质量百分含量为60％)0.5g以及叠氮钠0.05g；试剂2：NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g；
(1)制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方配方中浓度取缓冲液CAPS%20100mmol/L(pH%209.5、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，然后加水定容至100mL，即得；S2制备试剂2：按照上述配方中浓度称取NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g，即得；
(2)保持α1-微球蛋白稳定的方法，包括以下步骤：
S1：按照(1)所述的制备方法制备保持所述α1-微球蛋白稳定的组合物；S2：分别配制浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和浓度为100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)两种溶液备用；S3：取α1微球蛋白溶液(1～2mg/mL、5mL)，调节其pH至7.4，然后加入S2制备的两种溶液各1ml，将上述反应体系在室温下震荡30min，转至透析袋中，震荡透析30min，停止透析；S4：向步骤S3获得的反应体系中加入步骤S1获得的试剂2NH2-PEG-COOH%200.5g，震荡反应120min，停止反应，然后再将上述反应体系震荡透析60min；S5：向步骤S4获得的的反应体系中加入步骤S1获得的试剂1，即得。
对比例1
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、以及叠氮钠0.05g；
(1)制备方法包括以下步骤：按上述配方的质量百分比取缓冲液50mL、100mM、pH9.5的CAPS，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质以及防腐剂，混合使其充分溶解，加水定容至100ml，即得；
(2)保持稳定和检测的方法包括以下步骤：用步骤(1)用配制好的组合物稀释α1-微球蛋白溶液(初浓度为1～2g/L)，分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将上述140、112、84、56、28、14mg/Lα1-微球蛋白溶液均分体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
对比例2
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG%200.5g以及叠氮钠0.05g；
(1)制备方法包括以下步骤：按上述配方的质量百分比取缓冲液50mL、100mM、pH9.5的CAPS，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，加水定容至100ml，即得；
(2)保持稳定和检测的方法包括以下步骤：用步骤(1)用配制好的组合物稀释α1-微球蛋白溶液(初浓度为1～2g/L)，分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将上述140、112、84、56、28、14mg/Lα1-微球蛋白溶液均分体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
对比例3
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，100mL组合物中，包括以下质量的各组分：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂PEG-PPG-PEG%200.5g、还原剂TCEP%200.2mmol以及叠氮钠0.05g；
(1)制备方法包括以下步骤：按上述配方的质量百分比取缓冲液50mL、100mM、pH9.5的CAPS，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂、防腐剂以及还原剂，混合使其充分溶解，加水定容至100ml，即得；
(2)保持稳定和检测的方法包括以下步骤：用步骤(1)用配制好的组合物稀释α1-微球蛋白溶液(初浓度为1～2g/L)，分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将上述140、112、84、56、28、14mg/Lα1-微球蛋白溶液均分体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
对比例4
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，包括以下质量的各组分：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、表面活性剂TX-100%200.5g以及叠氮钠0.05g；
(1)制备方法包括以下步骤：按上述配方的质量百分比取缓冲液50mL、100mM、pH9.5的CAPS，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂以及防腐剂，混合使其充分溶解，加水定容至100ml，即得；
(2)保持稳定和检测的方法包括以下步骤：用步骤(1)用配制好的组合物稀释α1-微球蛋白溶液(初浓度为1～2g/L)，分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将上述140、112、84、56、28、14mg/Lα1-微球蛋白溶液均分体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
对比例5
一种保持α1-微球蛋白检测试剂盒中α1-微球蛋白稳定的组合物，包括以下质量的各组分：牛血清白蛋白7g、乳糖4g、CAPS%2050mmol/L(pH%209.5、50ml)、NH2-PEG-COOH(且其平均分子量为5000)0.5g以及叠氮钠0.05g；
(1)制备方法包括以下步骤：
S1制备试剂1：按上述配方的质量百分比取缓冲液CAPS%20100mmol/L(pH%209.5、50ml)，然后按照上述配比加入所述蛋白类物质、糖类物质以及防腐剂，混合使其充分溶解，即得；S2制备试剂2：按照上述配方的质量百分比称取NH2-PEG-COOH%200.5g，即得；
(2)保持α1-微球蛋白稳定的方法，包括以下步骤：
S1：按照(1)所述的制备方法制备保持所述α1-微球蛋白稳定的组合物；S2：分别配制浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和浓度为100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)两种溶液备用；S3：取α1微球蛋白溶液(1～2mg/mL、5mL)，调节其pH至7.4，然后加入S2制备的两种溶液各1ml，将上述反应体系在室温下震荡30min，转至透析袋中，震荡透析30min，停止透析；S4：向步骤S3获得的反应体系中加入步骤S1获得的试剂2NH2-PEG-COOH%200.5g，震荡反应120min，停止反应，然后再将上述反应体系震荡透析60min；S5：向步骤S4获得的的反应体系中加入步骤S1获得的试剂1，即得。
(3)检测方法包括以下步骤：现将步骤(2)制备获得α1微球蛋白溶液分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将140、112、84、56、28、14mg/L的α1-微球蛋白溶液平均体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
实验例：稳定性实验
1.1检测方法
1.1.1对于实施例5的检测：现将步骤(2)制备获得的稳定的α1微球蛋白溶液分别稀释至140、112、84、56、28、14mg/L一系列梯度；然后将140、112、84、56、28、14mg/L的α1-微球蛋白溶液平均体积后分别分装在1.5mL离心管中；然后采用α1-微球蛋白测定试剂盒定标测样本，测完之后每个梯度平均分成两组，分别标记样品“4℃”、“37℃”，分别置于相应温度环境中，并放置3天、7天后检测，比较37℃热加速后α1-微球蛋白的稳定性。
1.1.2对对比例1～5的检测参见对比例1～5。
1.2检测结果：反映在以下表1中。
表1
注：表格中“1、2、3”列各列分别表示：4℃第0天、4℃第3天、37℃第7天α1-微球蛋白的吸光度。
从实验结果可以看出：
(1)在4℃条件下，各实施例和对比例α1微球蛋白的稳定性较好，且实施例5的α1微球蛋白稳定性最好；
(2)对比例5、实施例5获得的α1-微球蛋白在37℃热加速后，其相对于4℃的结果相对偏差较小，保持稳定；
(3)未加入改性剂的对比例1、2、3、4稳定性随着37℃热加速处理后，蛋白活性损失较大，对比例5加入了改性剂，α1微球蛋白的稳定性较好；在对比例5的基础上加入表面活性剂，α1微球蛋白的活性可以进一步得到较好保护。
由此可见，采用本发明专利技术方案，可以明显保持α1-微球蛋白稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，均在本发明的保护范围内。
