确定体内受体占有率的测定
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技术领域
本发明涉及直接测量在血液裂解物中共价结合的化合物的实时体内受体占有率的方法。更具体地，本发明涉及实时体内BTK受体占有率测量作为药效学生物标记物以用于临床药物开发。
背景技术
药物发现和开发是一个长期而高风险的过程。由于无数候选药物在早期发现和开发过程中失败，开发成功的新药的平均成本估计高达26亿美元，并且估计进入临床研究的候选药物的总存活率低于12％(PhRMA报告,“Biopharmaceutical Research&Development:The Process Behind New Medicines”,2015)。导致这些候选药物失败的主要问题与开发后期期间，特别是概念验证(II期)临床试验期间的临床功效不足或缺乏有关(Kola,I.,等人,J.Nature Reviews.Drug Discovery 2004,3,711-715；Arrowsmith,J.,NatureReviews.Drug Discovery 2011,10,87；Morgan,P.,等人,Drug Discovery Today 2012,17,419-424)。
许多正在开发中的小分子药物和生物制剂已被设计来介导免疫系统。这样，这些候选药物通常需要非常低的剂量水平来触发所需的反应。因此，对这些候选药物的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性的早期了解对于确定用于临床试验的适当剂量范围至关重要(Topalian,S.L.,等人,The New England Journal of Medicine 2012,366,2443-2454；Brahmer,J.R.,等人,The New England Journal of Medicine 2012,366,2455-2465；Tolcher,A.W.,等人,Journal of Clinical Oncology:Official Journal of theAmerican Society of Clinical Oncology 2009,27,5800-5807；Hua,F.,等人,Journalof Clinical Pharmacology 2014,54,14-22；Rutgeerts,P.J.,等人,Gut 2013,62,1122-1130)。为了在药物开发阶段期间提高临床效率并降低成本，PD曲线的定量测量与PK曲线对于临床试验的合理设计同样重要。当PD曲线随多个剂量变化时尤其如此。
受体占有率(RO)测定测量分子与其受体蛋白(或靶标)的结合，并提供可用于产生PD曲线的定量数据(Liang,M.,等人,Cytometry B Clin Cytom 2016,90,117-127)。在临床前动物模型和临床研究中，RO的测量是将功效与机制相关联的关键测定。在实践中，RO在首次人体(FIH)研究中在作出剂量递增决策时特别有用。
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)在经由B细胞受体、Fc受体和RANKL途径的信号转导和激活中起关键作用(Seiler,T.,等人,Expert Opin Investig Drugs 2017,26,909-915；Whang,J.A.,等人,Drug Discovery Today 2014,19,1200-1204)。对于基于抗体的药物，通常通过流式细胞术使用与靶分子竞争的抗体测量游离受体和使用非竞争抗体测量总受体来监测RO(Liang,M,等人,Cytometry B Clin Cytom 2016,90,117-127；Woska,J.R.,Jr.,等人,Journal of immunological methods 2003,277,101-115)。然而，对于小分子拮抗剂，没有存在用于通过流式细胞术直接检测被占有的受体的抗体试剂。以前，依鲁替尼在外周血单核细胞(PBMC)中的BTK RO是通过以下方式确定的：使用与游离(未被占有的)BTK的活性占有位点结合的荧光亲和探针，然后使用SDS/PAGE和荧光凝胶扫描进行检测(Honigberg,L.A.；J.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2010,107,13075-13080)。基于荧光亲和探针的测定只能确定游离BTK的量，因此，需要一种使用蛋白质印迹的其他测定来测量总BTK。由于临床研究中产生了大量样品，因此使用两个测定平台是不切实际的。另外，所述方法缺乏在未结合测量值与总测量值之间的直接可比性，从而导致较高的测定变化性。
最近，已经报道了使用生物素化共价探针的基于ELISA的BTK RO测定，并已用于阿卡卢替尼(acalabrutinib)和CC-292临床研究中(Barf,T.,等人,The Journal ofpharmacology and experimental therapeutics 2017；Evans,E.K.,等人,The Journalof pharmacology and experimental therapeutics 2013,346,219-22)。在这种方法中，在洗掉药物结合的BTK(DB-BTK)时，仅检测游离BTK。使用给药前的样品确定总BTK浓度，其中假定在样品之间的总BTK水平保持一致。
可替代地，可以针对游离和总BTK使用分开的基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的测定来估计外周血单核细胞(PBMC)中的BTK占有率(Lutz,J.D.N.,等人,华盛顿州贝尔维尤市第七届美国药效学会议(ACoP7)上的海报展示(Poster presentation atthe 7th American Conference on Pharmacometrics(ACoP7)).十月23-26,2016.2016)。然而，在同一样品中游离和总BTK水平是独立测量而不是同时测量的，并且发现总BTK水平在样品之间有显著变化(Honigberg,L.A.,同上)。因此，基于ELISA或TR-FRET的方法受到方法选择导致的固有可变性的限制。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定由于其出色的测定选择性和多路复用能力而在蛋白质定量方面展现出潜力(Neubert,H.,等人,Bioanalysis 2014,6,1731-1733)。特别是，结合了免疫捕获富集然后进行LC-MS/MS检测的“杂合”LBA-LC-MS测定已成为强大的技术平台，其以极高的检测选择性来测量蛋白质生物标记物或治疗剂(Stevenson,L.,等人,Bioanalysis 2013,5,2903-2918)。LC-MS测定的主要益处是其能够同时定量同一样品中的DB-BTK和游离BTK二者。因此，RO测定对样品或运行变化的敏感度要低得多。
然而，LC-MS测定的发展提出了许多挑战。首先，来自被给予药物的动物或人的血液样品可含有过量的药物，这些药物会与游离受体离体反应形成药物结合的受体，从而导致RO的高估。其次，LC-MS/MS通常不如ELISA测定灵敏。
发明内容
本发明涉及用于监测和测量目的药物与受体结合的测定。在此测定中，将从被给予目的化合物的受试者收集的血液样品与含有淬灭剂的裂解溶液一起孵育。然后从裂解的血液样品分离药物结合和淬灭剂结合的受体。消化所分离的药物结合和淬灭剂结合的受体以产生替代的药物结合和淬灭剂结合的肽。确定替代肽的量。可以通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定受体占有率。
在本发明的一个实施方案中，目的化合物与受体共价结合。
在本发明的另一个实施方案中，淬灭剂在与目的化合物所结合位点相同的位点与目的化合物竞争性地不可逆地结合受体。
在本发明的另一个实施方案中，将淬灭剂以比目的化合物摩尔过量的水平添加至裂解缓冲液。在本发明的另一个实施方案中，基于内源性受体浓度，将淬灭剂以过量105至1000倍的量添加至裂解缓冲液。
在本发明的另一个实施方案中，在收集血液样品后立即添加具有淬灭剂的裂解溶液。在本发明的另一个实施方案中，在血液样品收集的5分钟内添加具有淬灭剂的裂解溶液。
在本发明的另一个实施方案中，使用免疫捕获步骤分离药物结合和淬灭剂结合的受体。在本发明的另一个实施方案中，受体与被固定在固体支持物(例如，磁珠、琼脂糖珠或柱填充材料)上的捕获剂特异性地结合，并因此与未与捕获抗体非常紧密结合的其他内源性蛋白质和肽分离[Fung,E.N.等人,Bioanalysis 2016,8,847-856]。
在本发明的另一个实施方案中，在消化步骤之前，将药物结合和淬灭剂结合的受体从免疫捕获基底中去除。
在本发明的另一个实施方案中，药物结合和淬灭剂结合的受体被消化，同时仍与免疫捕获基底缔合。
在本发明的另一个实施方案中，在消化步骤期间使用的蛋白酶选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。蛋白酶的例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Lys-N蛋白酶、Asp-N蛋白酶、Arg-C蛋白酶。
在本发明的另一个实施方案中，通过单次LC-MS/MS运行同时测量药物结合和淬灭剂结合的替代肽。
在本发明的另一个实施方案中，通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来计算受体占有率。
在本发明的一个实施方案中，通过以下方式测量受体的占有率：1)从被给予不可逆地结合受体的目的化合物的受试者收集血液，2)立即向收集的血液添加裂解溶液，所述裂解溶液含有不可逆地结合与目的化合物所结合位点相同的位点的淬灭剂化合物，3)使用免疫捕获步骤将药物结合和淬灭剂结合的受体与裂解和淬灭的血液样品分离，4)消化分离的药物结合和淬灭剂结合的受体，同时仍与免疫捕获基底结合，5)在单次LC-MS/MS运行中同时测量药物结合和淬灭剂结合的替代肽的量，并且6)通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定受体占有率。
在上述实施方案的一个优选方面，受体是BTK，目的化合物示于图1A中，并且相应的淬灭剂示于图1B中。
在上述实施方案的另一个优选方面，免疫捕获基底是链霉亲和素T1捕获珠。
在以上实施方案的另一个优选方面，mAb克隆#MAB 5807或mAb克隆#MAB D3H5是附接至免疫捕获基底的抗BTK抗体。
在上述实施方案的另一个优选方面，所分离的淬灭剂结合和药物结合的BTK被胰蛋白酶消化，同时仍与免疫捕获珠缔合。
在上述实施方案的另一个优选方面，通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来计算BTK受体占有率。
在本发明的一个实施方案中，通过以下方式测量BTK受体占有率：1)从被给予示于图1A中的化合物的受试者收集血液，2)立即添加含有示于图1B中的淬灭剂化合物的裂解溶液，3)使用免疫捕获步骤分离药物结合和淬灭剂结合的BTK，4)用胰蛋白酶消化所分离的药物结合和淬灭剂结合的BTK，同时仍与免疫捕获珠缔合，5)在单次LC-MS/MS运行中同时测量药物结合和淬灭剂结合的替代肽的量，并且6)通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定BTK受体占有率。
附图说明
图1A和1B示出A)化合物A；B)淬灭剂化合物的结构。
图2分别示出来自人和猴(Rhesus/Cyno)的BTK蛋白的序列比对。方框指示用于分析的胰蛋白酶消化肽。在氨基酸序列内，Cys 481(由箭头标记)与化合物A(DB-BTK)或淬灭剂化合物(QB-BTK)结合。与图1A或1B的化合物结合的胰蛋白酶消化肽QRPIFIITEYMANGCLLNYLR(SEQ ID NO:1，如表1所示)用于定量。
图3示出通过免疫捕获-LC-MS/MS进行的BTK RO测定的示意图。使用的替代肽是药物结合的肽(DB-QRP)和淬灭剂结合的肽(QB-QRP)。
图4示出来自不同供应商的捕获抗体(■mAb-D3H5，□mAb-MAB5807)在人血液中的内源性BTK与重组BTK(用作校准物)之间具有不同的免疫捕获性能。
图5A-5D示出在50℃(5A和5C)或60℃(5B和5D)下，胰蛋白酶浓度、消化时间对从DB-BTK(5A和5B)和QB-BTK(5C和5D)产生的替代肽的LC-MS/MS响应的影响。通过Thermo的QExactiveTM Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM质谱仪上的LC-HRMS测量替代肽DB-QRP或QB-QRP。对于每种条件，一式三份进行实验。
图6示出DB-BTK(■)和QB-BTK(□)每个电荷阶段的信号响应的比较。
图7A-7C示出从Sciex的Triple Quad 5500质谱仪获得的(7A)DB-QRP肽在m/z967.4处的[M+3H]3+的电喷雾正离子MS/MS产物离子谱；(7B)QB-QRP肽在m/z 962.5处的[M+3H]3+的电喷雾正离子MS/MS产物离子谱；以及(7C)SIL-QB-QRP肽(内标)在m/z 965.9处的[M+3H]3+的电喷雾正离子MS/MS产物离子谱。
图8A-8F示出DB-QRP(DB-BTK的替代肽)(8A-8C)和QB-QRP(QB-BTK的替代肽)(8D-8F)以及它们的内标(IS)的多反应监测(MRM)色谱图；(8A和8D)从空白猴血液裂解物获得的分析物的色谱图，其中通过单独用淬灭剂或药物进行预处理消除了内源性BTK的影响；(8B和8E)从含有LLOQ处的分析物及其IS的猴血液裂解物获得的分析物的色谱图；(8C和8F)从仅含有IS的猴血液裂解物获得的IS的色谱图。(c和f)[13C9,15N]-QB-QRP用作DB-QRP和QB-QRP的IS。
图9A-9D示出从猴#5149、#5151和#5169获得的PK和PD结果，这些猴被以两种不同剂量0.10mg/kg或0.5mg/kg给予示于图1A中的化合物(BMS-986195)。在第1天的第1、3、5、7和24h收集血液样品以用于PK评价(数据示于9A和9B中)，并在给药前、第1、3、5、7、24、48、72、144和168h收集血液样品以用于PD评价(数据示于9C和9D中)(参见实施例2)。通过EFS-WEB电子提交的序列表的引用
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具体实施方式
通过参考本发明的优选实施方案和本文包括的实施例的以下详细描述可以更容易地理解本发明。
如本文所用，术语“不可逆地结合”是指一类化合物通过与活性位点形成共价键或可替代地仅通过与活性位点紧密结合以使得在相关的时间尺度上解离速率有效为零而永久地结合受体。
如本文所用，术语“目的化合物”和“药物”可互换使用，并且是指结合目的靶标的分子。
如本文所用，当提及RO测定的焦点时，术语“靶标”和“受体”可互换使用。
如本文所用，在提及将含有淬灭剂分子的裂解溶液添加至血液样品的时刻时，术语“立即”意指在收集血液样品之后尽可能快。可替代地，在收集血液样品后的前5分钟内，添加含有淬灭剂分子的裂解溶液。
本发明描述了体内受体占有率测定的开发，更具体地说，描述了体内布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)受体占有率(RO)测定的开发。测定灵敏度是确定在非常高或非常低的占有率水平(结合的或游离的靶标可能小于5％)时的RO的关键。
本发明是一种方法，所述方法包括以下步骤：a)从用目的化合物治疗的受试者收集血液样品，b)将含有受体特异性淬灭剂的裂解溶液添加至血液样品，c)分离目的受体，d)消化所分离的受体以产生替代肽，e)测量替代肽的量，并通过将药物结合的替代肽的量与药物结合和淬灭剂结合的替代肽的总量进行比较来确定受体占有率。
从被给予目的化合物的受试者收集血液样品。
在本发明的一个实施方案中，目的化合物不可逆地结合受体的至少一个氨基酸。目的化合物的一个例子是示于图1A中的化合物，所述化合物不可逆地结合BTK。
将含有受体特异性淬灭剂的裂解溶液添加至血液样品
有许多挑战影响受体占有率(RO)测定开发的选择性和灵敏性。特别地，血液样品中的游离药物和游离受体的存在可在裂解步骤期间离体产生药物结合的受体，这将导致RO的高估。发现在裂解步骤期间添加受体特异性淬灭剂可将游离受体迅速转化为淬灭剂结合的(QB)受体，从而阻断离体形成药物结合的受体。
在一个实施方案中，RO测定包括在淬灭剂的存在下裂解血液样品，以将内源性受体转化为淬灭剂结合的受体，从而防止形成内源性的药物结合的受体。
在本发明的一个实施方案中，淬灭剂不可逆地结合与目的化合物所结合氨基酸相同的氨基酸。优选地，淬灭剂与目的化合物竞争结合受体。在本发明的另一个实施方案中，将淬灭剂以比目的化合物过量的摩尔量添加至裂解溶液。在本发明的另一个实施方案中，在收集血液样品后立即添加含有淬灭剂的裂解溶液。
本领域技术人员了解细胞裂解溶液。可商购的细胞裂解缓冲液包括NP-40裂解缓冲液(TheromFisher Scientific)、RIPA裂解缓冲液(Abbexa)、ACK裂解缓冲液(TheromFisher Scientific)、细胞裂解缓冲液(10x)(目录号：9803，Cell SignalingTechnology)。裂解缓冲液用于在非变性条件下裂解细胞
淬灭剂化合物的一个例子是示于图1B中的化合物，所述化合物不可逆地结合BTK。
从细胞裂解溶液分离药物结合和淬灭剂结合的受体
免疫捕获是一种高度选择性的样品净化方法，它利用了靶蛋白和捕获剂的独特免疫亲和力(Stevenson,L.,等人,Bioanalysis 2013,5,2903-2918)。选择对内源性靶标具有高免疫捕获效率的合适捕获抗体是测定成功的关键。如果特异性抗体不可商购，本领域技术人员会知道如何产生对靶蛋白具有特异性的抗体。
为了评价免疫捕获效率，使用药物结合和淬灭剂结合的靶标筛选抗体。基于对药物结合和淬灭剂结合的靶标二者的高亲和力选择抗体。例如，为了选择对BTK具有特异性的抗体，评价了可商购的mAb克隆#MAB5807和mAb克隆#D3H5的免疫捕获能力。出乎意料的是，尽管mAb克隆#MAB5807显示出对重组BTK、DB-BTK或QB-BTK的高亲和力，但所述克隆无法以所需的灵敏度检测内源性BTK、DB-BTK或QB-BTK。如图4所示，当使用mAb克隆#5807时来自内源性BTK的LC-MS响应太低，而另一个克隆mAb克隆#D3H5对药物结合和淬灭剂结合的重组BTK给出了中等响应，并且对药物结合和淬灭剂结合的内源性BTK给出了更大响应。由于最终目的是确定人血液中药物结合和淬灭剂结合的内源性BTK，因此选择克隆#D3H5用于BTKRO测定。
产生药物结合和淬灭剂结合的受体替代肽
所产生的用于RO测定的受体替代肽必须含有目的化合物的结合位点。另外，替代肽必须对LC-MS检测敏感。
在本发明的一个实施方案中，用一种或多种选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的蛋白酶消化所分离的药物结合和淬灭剂结合的受体。可接受的蛋白酶的例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Lys-N蛋白酶、Asp-N蛋白酶、Arg-C蛋白酶。
表1描述了用各种蛋白酶消化BTK时产生的替代肽。
表1.用各种蛋白酶处理时产生的BTK肽
由于药物结合的靶标和淬灭剂结合的靶标的定量基于代表性替代肽的MS响应，因此这些替代肽的消化产率可对检测灵敏度具有重大影响。
在本发明的一个实施方案中，消化步骤在从免疫捕获基底洗脱药物结合和淬灭剂结合的受体之前或之后进行。优选地，在靶标结合免疫捕获基底时进行消化步骤。例如，将药物结合和淬灭剂结合的BTK通过胰蛋白酶消化处理，同时仍由免疫捕获珠结合。
测量替代肽的量
在本发明的一个实施方案中，可以通过在单次LC-MS/MS运行中同时测量淬灭剂结合和药物结合的替代肽来确定受体占有率。
在最初的方法开发过程中，使用Q Exactive HF高分辨质谱(HRMS)分析了反应产生的DB-BTK和QB-BTK。通过使用从替代肽预期的准确质量，鉴定了所有替代肽。每个电荷阶段的信号丰度示于图6中。数据显示，DB-BTK和QB-BTK在三个电荷阶段给出最高响应，因此，[M+3H]3+离子用于DB-QRP(DB-BTK的替代肽)和QB-QRP(QB-BTK的替代肽)二者作为用于MRM检测的母离子。如图7A-7C所示，MS/MS谱中示出若干种产物离子。与y2离子(m/z约288)和b6离子(对于DB-QRP和QB-QRP，m/z约755，对于IS，m/z约765)对应的产物离子示出用于MRM检测的较好强度，其中y2离子较b6离子更佳。由于m/z为约288的y2离子具有示于DB-QRP和QB-QRP的MRM通道中的干扰峰，因此b6离子被用作用于MRM检测的产物离子。
来自空白猴血液裂解物(加标有DB-BTK和QB-BTK的空白猴血液裂解物)的DB-QRP、QB-QRP和IS的典型MRM色谱图示于图8a、8b、8d和8e中，其中DB-BTK处于LLOQ的浓度0.250nM并且QB-BTK为0.125nM。来自仅具有IS的空白猴血液裂解物的[13C9,15N]-QB-QRP的典型MRM质谱图示于图8c和8f中。在分析空白对照猴血液裂解物时，在DB-QRP、QB-QRP或IS的保留时间或离子通道中，没有发现来自空白猴裂解物的显著干扰峰。从UHPLC柱上以分别为5.02、4.87和4.87min的保留来洗脱DB-QRP、QB-QRP以及它们的IS。
定量下限
DB-QRP和QB-QRP的定量下限(LLOQ)为0.250nM和0.125nM，这是标准曲线中两种分析物的最低浓度。如图8b和8e所示，在LLOQ浓度水平下，DB-QRP或QB-QRP的信噪比(S/N)为至少3或更高。
校准曲线线性以及QC的准确度和精密度
对于量化血液裂解物中的BTK RO的方法验证，将所有标准曲线拟合到1/x加权二次回归模型，其中DB-BTK的标准曲线范围为0.250至12.5nM，并且QB-BTK的标准曲线范围为0.125至12.5nM。在每次运行中，对于至少三分之二的校准标准品，反算浓度与其标称值的偏差在±20.0％之内(LLOQ水平下为±25.0％)。如表2至3所示，对于三次准确度和精密度运行，DB-BTK的反算浓度与其标称值的偏差在±11.1％内，并且QB-BTK的反算浓度与其标称值的偏差在±19.8％内。使用质量控制样品评价准确度和精密度。
表2.从用于DB-BTK测定的标准曲线样品的精密度和准确度获得的数据汇总
表3.从用于QB-BTK测定的标准曲线样品的精密度和准确度获得的数据汇总
表4.测定验证：从具有25％、50％和90％BTK占有率的猴血液裂解物获得的质量控制数据
如表4所示，除了在运行2中六个QC_25％RO样品中的一个和六个QC_50％RO样品中的一个的测量值与理论值之间的差异>5％之外，对于所有QC的所有三次运行，测量的BTKRO％与理论BTK RO％之间的差异均在±5％内。
除了一个QC_25％RO具有-16.2％的偏差％之外，所有QC在三次运行中的变异系数％和偏差％均在10％内(表5)。结果证明，该方法对于分析猴血液裂解物中的BTK RO％是准确且精密的。
表5.从具有25％、50％和90％BTK占有率(n＝6)的猴血液裂解物获得的质量控制数据汇总。
稳定性评价
表6中汇总了已建立的猴血液裂解物中的DB-BTK和QB-BTK的稳定性。结果指示，DB-BTK和QB-BTK的稳定性对BTK RO％没有影响或影响很小，因为对于所有QC，测量的BTKRO％与理论BTK RO％之间的差异在±5％内，而与DB-BTK或QB-BTK的绝对浓度在-80℃在2个冻融循环后降低或在室温储存24h或在-80℃储存224天后降低无关。
表6.质量控制样品在BTK RO％为25％和90％时的稳定性评价
免疫捕获LC-MS/MS受体占有率测定的用途
在临床前动物模型和临床研究中，RO的测量是将功效与机制相关联的关键测定。在实践中，RO在首次人体(FIH)研究中在作出剂量递增决策时特别有用。
实施例1
制备药物结合的BTK(DB-BTK)和淬灭剂结合的BTK(QB-BTK)标准品和质量控制样品
试剂和材料
分别示于图1A和1B中的药物和淬灭剂化合物是由Bristol-Myers Squibb(新泽西州普林斯顿)的研发部门合成的。生物素化兔抗BTK单克隆抗体(批号：D3H5，目录号：12624)和10x裂解缓冲液(目录号：9803)购自Cell Signaling Technology(马萨诸塞州丹佛)。Dynabeads Myone链霉亲和素T1珠(目录号：65602)购自ThermoFisher Scientific(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。重组BTK蛋白(目录号：PV3587)购自Life Technologies(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。蛋白酶抑制剂(目录号：539134)购自Millipore Sigma(马萨诸塞州比勒利卡)。用于测定的内标(IS)为在N末端和C末端均含有侧翼氨基酸的[13C9,15N]-QB-QRP(表8)，是由Bristol-Myers Squibb(BMS)(美国新泽西州普林斯顿)的化学合成部门合成的。猴ACD-A全血购自Bioreclamation公司(纽约州韦斯特伯里)。所有其他试剂均为分析级。MagnaBot 96磁分离装置(目录号：V8151)购自Promega公司(威斯康星州麦迪逊)。
制备药物结合的BTK(DB-BTK)的参考标准品
将重组BTK(5.9μM，200μL)与400μL PBS合并，然后加标15μL的在乙腈中的1.0mg/mL药物溶液(示于图1A中的化合物)(2701μM药物，15μL)。然后将溶液在室温下孵育1h，得到的DB-BTK浓度为1919nM。DB-BTK浓度基于反应中使用的总游离BTK量，因为在过量药物的存在下，游离BTK向DB-BTK的转化约为100％。
制备淬灭剂结合的BTK(QB-BTK)的参考标准品
将重组BTK(5.9μM，200μL)与400μL PBS合并，然后加标15μL的在乙腈中的1.0mg/mL淬灭剂溶液(示于图1B中的化合物)(2806μM淬灭剂，15μL)。将溶液在室温下孵育1h，得到的QB-BTK浓度为1919nM。QB-BTK浓度基于反应中使用的总游离BTK量，因为在过量淬灭剂的存在下，游离BTK向QB-BTK的转化约为100％。
制备含有淬灭剂的裂解缓冲液混合物：2x裂解缓冲液，以及0.0133x蛋白酶抑制剂和1.5μM淬灭剂溶液：
将一个含有15mL 10x裂解缓冲液的小瓶与1.0mL蛋白酶抑制剂和80μL 0.5mg/mL淬灭剂溶液(示于图1B中的化合物)(在DMSO中)混合。然后将溶液用59mL去离子水稀释，总体积为75mL。
制备含有药物的裂解缓冲液混合物：2x裂解缓冲液，以及0.0133x蛋白酶抑制剂和1.5μM药物溶液
将一个含有15mL 10x裂解缓冲液的小瓶与1.0mL蛋白酶抑制剂和83μL 0.5mg/mL药物溶液(示于图1A中的化合物)(在DMSO中)混合。然后将溶液用59mL去离子水稀释，总体积为75mL。
从猴血液制备裂解物+433(100％QB-BTK)
将猴ACD-A全血(3.5mL)与7mL含有1.5μM淬灭剂(示于图1B中的化合物)的裂解缓冲液合并。将样品在室温下摇动1小时。
从猴血液制备裂解物+195(100％DB-BTK)
将猴ACD-A全血(3.5mL)与7mL含有1.5μM药物(示于图1A中的化合物)的裂解缓冲液合并。将样品在室温下摇动1小时。
使用含有内源性BTK的血液裂解物制备质量控制样品(QC)
通过混合不同百分比的裂解物+433和裂解物+195来制备BTK RO QC。通过将裂解物+433/裂解物+195分别以2250/750、1500/1500、300/2700(v/v)混合来制备BTK RO％为25％、50％和90％的较低QC(LQC)、中等QC(MQC)和高QC(HQC)，如表7所示。
表7.使用含有内源性BTK的猴血液裂解物制备质量控制样品
a 通过用淬灭剂溶液(图1B)预处理猴裂解物获得裂解物+433。
b 通过用药物溶液(图1A)预处理猴裂解物获得裂解物++195。
准备DB-BTK(BTK+195)标准曲线：使用猴血液裂解物+433
通过独立稀释DB-BTK储备溶液(1919nM于缓冲液中)，在含有0％DB-BTK的猴血液裂解物中制备DB-BTK为0.250、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0和12.5nM的校准标准品(STD)。在制备过程中，通过用血液裂解物+433稀释1919nM的DB-BTK储备溶液来制备DB-BTK的200nM和20nM的中间稀释物，然后进一步稀释成最终的STD样品。标称浓度基于血液体积，由于稀释系数为3，血液裂解物中的实际浓度为各浓度的1/3。
准备QB-BTK(BTK++433)标准曲线：使用猴血液裂解物++195
通过独立稀释QB-BTK储备溶液(1919nM于缓冲液中)，在含有0％QB-BTK的猴血液裂解物中制备QB-BTK为0.125、0.250、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0和12.5nM的校准标准品(STD)。在制备过程中，通过用血液裂解物++195稀释1919nM的QB-BTK储备溶液来制备QB-BTK的200nM和20nM的中间稀释物，然后进一步稀释成最终的STD样品。标称浓度基于血液体积，由于稀释系数为3，血液裂解物中的实际浓度为各浓度的1/3。
用抗BTK生物素化抗体制备链霉亲和素T1捕获珠。用于免疫沉淀的DynabeadsMyone链霉亲和素T1珠的浓度为10mg/mL。生物素化mAb的结合能力是20μg mAb/mg珠。将总计25mL的链霉亲和素T1珠等分到10个试管中，每个试管中2.5mL。用3mL PBST溶液洗涤样品。DynaMagTM-5磁体用于从液体样品基质分离磁珠。丢弃最后的洗液后，将珠在每个管中重悬于2.5mL PBST中，然后添加0.500mL生物素化抗BTK抗体(1mg/mL，批号：D3H5)。将10个试管中的样品(0.500mL)在室温孵育1h。从溶液分离珠，并用3mL PBST洗涤每个管中的珠。将试管中的珠重悬于2.5mL PBST中。最终的抗BTK抗体浓度为0.2μg/μL珠。将样品储存在4℃下以备将来使用。
进行免疫捕获以便从血液裂解物富集药物结合的BTK(DB-BTK)和淬灭剂结合的BTK(QB-BTK)。针对对照猴血液裂解物、校准标准品、质量控制样品或猴研究样品，在室温下对3000μL血液裂解物样品的等分试样进行离心。将珠上的抗BTK捕获抗体(60μL，0.2μgmAb/μL珠)添加至离心样品的上清液，将样品在室温下孵育120分钟，然后离心。去除上清液，并将PBST添加至珠样品。将样品转移到TECAN液体处理器上的LowBind 96孔板中，并置于MagnaBot 96磁分离装置的顶部。将珠用800μL PBST洗涤两次，然后用500μL 25mMNH4OAc和0.05％吐温-20洗涤。去除洗涤缓冲液后，将LowBind 96孔板中的珠用于胰蛋白酶消化，如下所述。
胰蛋白酶消化。除了空白裂解物(向其中添加100μL的具有0.05％吐温-20的25mMNH4OAc)之外，在向96孔板中的珠添加IS(100μL的在具有0.05％吐温-20的25mM NH4OAc中的0.5μg/mL SIL-QB-QRP)后，将25μL 100mM NH4HCO3添加至每个样品。将样品通过添加25μL的在100mM NH4HCO3中的160ng/μL新鲜制备的胰蛋白酶溶液来消化，并在50℃孵育30min，然后用20μL 50％/50％MeOH/甲酸(v/v)淬灭。将样品短暂涡旋，然后放在MagnaBot 96装置顶部，将上清液转移至新的96孔板中，然后以4000rpm离心2分钟。通过LC-MS/MS分析样品。
UHPLC-MS/MS分析。对于测定验证和样品分析，来自Sciex(加利福尼亚州福斯特城)的AB Sciex Triple Quad 5500质谱仪用于LC-MS/MS数据采集。
以下LC-MS/MS条件用于测定验证和PD样品分析。对于每个处理的样品，将50μL体积的消化物注入超高效液相色谱(UHPLC)系统(型号LC-30AD，Shimadzu ScientificInstruments公司，马里兰州哥伦比亚)。以下描述的UHPLC-MS/MS条件专门用于定量猴血液裂解物中被占有和淬灭的BTK。使用Waters CORTECSTM UPLC C18+柱(2.1×100mm，1.6μm，Waters公司，马萨诸塞州米尔福德)来分析DB-QRP和QB-QRP肽。流动相A由0.1％甲酸于水中的溶液构成；而流动相B是0.1％甲酸于乙腈中的溶液。使用以下梯度洗脱进行UHPLC分离：从15％B开始并保持0.5min，随后％B在2.5min内从15％改变至30％，然后％B在4.9min内从30％改变至45％，然后％B在0.1min内从45％增加至90％并保持1min，然后％B在0.1min内从95％降低至15％，保持1.0min，并且在10.0min处停止。流速为0.600mL/min，并且柱温为60℃。在切换阀配置下，将UHPLC洗脱剂以3.0-6.5min的时间窗引入从AB Sciex(加利福尼亚州福斯特城)获得的配备有涡轮离子喷雾源的Triple Quad 5500TM质谱仪中。质谱仪在具有以下设置的正电喷雾电离模式下运行：气帘气体，30个单位；CAD气体，9个单位；气体1，65个单位；气体2，65个单位；涡轮离子喷雾电压为正4000V，以及涡轮探针温度为600℃。对于QB-QRP、DB-QRP和SIL-QB-QRP(IS)，质谱仪在m/z跃迁分别为962.493>755.40、967.174>755.40和965.825>765.50的MRM模式下运行(表8)。使用
表8.用于LC-MS/MS检测替代肽及其稳定同位素标记的内标的MRM跃迁。
a 根据胰蛋白酶消化肽中21个氨基酸的前三个氨基酸符号，将替代肽命名为QRP。DB-QRP＝药物结合的QRP肽；QB-QRP＝淬灭剂结合的QRP肽。
b F*的符号代表[13C9,15N]-苯丙氨酸。带下划线的肽区段是胰蛋白酶消化肽，并在LC-MS/MS测定中进行监测。
测定验证。测定验证由以下组成：三次准确度和精密度运行，以及另外的稳定性评价(包括BTK RO QC的冻融、RT和长期稳定性)。在所有验证运行中，使用七个DB-BTK(0.250nM-12.5nM)或八个QB-BTK(0.125nM-12.5nM)校准曲线点评估方法的线性。使用加权为1/x的二次回归模型进行定量。验收标准如下：在每次运行中，对于至少三分之二的校准标准品，反算浓度与其标称值的偏差在±20.0％之内(LLOQ水平下为±25.0％)。对于BTKRO QC，对于每个级别的至少50％的QC，测量的BTK RO％与理论BTK RO％之间的差异应在±5％内。例如，对于BTK RO QC_25％，测量的BTK RO％应在25.0±5.0％内。仅使用空白血液裂解物QC0(仅具有IS的空白裂解物)评估测定的选择性。
实施例2
在猴PD研究中的应用。
为了评估通过LC-MS/MS进行的BTK RO测定与建立的基于ELISA的测定相比的实用性和鲁棒性，进行了示于图1A中的化合物的单一递增剂量研究。向食蟹猴口服给予0.1、0.2和0.5mg/kg的药物化合物1A。使用通过LC-MS/MS以及实施例3中描述的配体结合测定(LBA)进行的BTK RO测定，在第1天的第1、3、5、7和24h收集血液样品以进行PK评价，并在给药前、1、3、5、7、24、48、72、144和168h收集血液样品以进行PD评价。
用于通过LC-MS/MS进行BTK RO测定的PD样品。
在PD样品收集之前，制备了以下含有2x裂解缓冲液以及0.0133x蛋白酶抑制剂和1.5μM淬灭剂(示于图1B中的化合物)溶液的裂解缓冲液混合物：将一个含有15mL 10x裂解缓冲液的小瓶与1.0mL蛋白酶抑制剂和80μL 0.5mg/mL淬灭剂化合物1B(在DMSO中)混合。然后将溶液用59mL去离子水稀释，总体积为75mL。
如上所述，在设定的时间点收集2mL血液样品。将1.5mL收集的血液用3mL的含有淬灭剂化合物1B的裂解缓冲液混合物裂解。混合后立即将样品在室温下摇动1小时。将血液裂解物样品在收集后立即储存在-70℃或更低的温度下。将样品用于采用LC-MS/MS测定的免疫捕获。
实施例3
通过LBA进行的BTK RO测定
给药后在设定的时间点收集经ACD-A处理的猴全血，并添加至96孔V型底部2ml板(Costar，目录号3960)中，并用含有蛋白酶抑制剂(Calbiochem，目录号539134)和生物素化探针(BMT-105186)的2x裂解缓冲液(Cell Signaling，目录号9803)裂解。将裂解物转移至链霉亲和素包被的板(ThermoFisher Scientific，
通过LC-MS进行的药代动力学分析
在设定的时间点收集0.5mL猴血液用于PK评价。将每个血液样品进行离心以分离血浆。将10μL 125μM淬灭剂溶液(示于图1B中的化合物)立即添加到200μL血浆中。混合后，将样品储存在-20℃并用于LC-MS/MS分析。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 确定体内受体占有率的测定
<130> 12728-WO-PCT
<150> 62/669442
<151> 2018-05-10
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(21)
<223> 在位置15处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 1
Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu
1 5 1015
Leu Asn Tyr Leu Arg
20
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> 在位置5处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 2
Met Ala Asn Gly Cys Leu Leu Asn Tyr
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(13)
<223> 在位置6处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 3
Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu
1 5 10
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(37)
<223> 在位置15处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 4
Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu
1 5 1015
Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg His Arg Phe Gln Thr Gln Gln Leu
202530
Leu Glu Met Cys Lys
35
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(37)
<223> 在位置16处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 5
Lys Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys
1 5 1015
Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg His Arg Phe Gln Thr Gln Gln
202530
Leu Leu Glu Met Cys
35
<210> 6
<211> 64
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(64)
<223> 在位置42处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 6
Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Val Met Met Asn Leu Ser His Glu
1 5 1015
Lys Leu Val Gln Leu Tyr Gly Val Cys Thr Lys Gln Arg Pro Ile Phe
202530
Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg
354045
Glu Met Arg His Arg Phe Gln Thr Gln Gln Leu Leu Glu Met Cys Lys
505560
<210> 7
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(65)
<223> 在位置59处的Cys是不可逆淬灭剂或目的化合物的结合位点
<400> 7
Gly Gln Tyr Asp Val Ala Ile Lys Met Ile Lys Glu Gly Ser Met Ser
1 5 1015
Glu Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Val Met Met Asn Leu Ser His
202530
Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Gly Val Cys Thr Lys Gln Arg Pro Ile
354045
Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu Leu Asn Tyr Leu
505560
Arg
65
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在位置7处的Phe是[13C9,15N]-苯丙氨酸；在位置17处的Cys是
不可逆淬灭剂的结合位点
<400> 8
Thr Arg Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly
1 5 1015
Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Ala
2025
<210> 9
<211> 659
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Ala Ala Val Ile Leu Glu Ser Ile Phe Leu Lys Arg Ser Gln Gln
1 5 1015
Lys Lys Lys Thr Ser Pro Leu Asn Phe Lys Lys Arg Leu Phe Leu Leu
202530
Thr Val His Lys Leu Ser Tyr Tyr Glu Tyr Asp Phe Glu Arg Gly Arg
354045
Arg Gly Ser Lys Lys Gly Ser Ile Asp Val Glu Lys Ile Thr Cys Val
505560
Glu Thr Val Val Pro Glu Lys Asn Pro Pro Pro Glu Arg Gln Ile Pro
65707580
Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Glu Met Glu Gln Ile Ser Ile Ile Glu
859095
Arg Phe Pro Tyr Pro Phe Gln Val Val Tyr Asp Glu Gly Pro Leu Tyr
100 105 110
Val Phe Ser Pro Thr Glu Glu Leu Arg Lys Arg Trp Ile His Gln Leu
115 120 125
Lys Asn Val Ile Arg Tyr Asn Ser Asp Leu Val Gln Lys Tyr His Pro
130 135 140
Cys Phe Trp Ile Asp Gly Gln Tyr Leu Cys Cys Ser Gln Thr Ala Lys
145 150 155 160
Asn Ala Met Gly Cys Gln Ile Leu Glu Asn Arg Asn Gly Ser Leu Lys
165 170 175
Pro Gly Ser Ser His Arg Lys Thr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Thr Pro
180 185 190
Glu Glu Asp Gln Ile Leu Lys Lys Pro Leu Pro Pro Glu Pro Ala Ala
195 200 205
Ala Pro Val Ser Thr Ser Glu Leu Lys Lys Val Val Ala Leu Tyr Asp
210 215 220
Tyr Met Pro Met Asn Ala Asn Asp Leu Gln Leu Arg Lys Gly Asp Glu
225 230 235 240
Tyr Phe Ile Leu Glu Glu Ser Asn Leu Pro Trp Trp Arg Ala Arg Asp
245 250 255
Lys Asn Gly Gln Glu Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Thr Glu Ala
260 265 270
Glu Asp Ser Ile Glu Met Tyr Glu Trp Tyr Ser Lys His Met Thr Arg
275 280 285
Ser Gln Ala Glu Gln Leu Leu Lys Gln Glu Gly Lys Glu Gly Gly Phe
290 295 300
Ile Val Arg Asp Ser Ser Lys Ala Gly Lys Tyr Thr Val Ser Val Phe
305 310 315 320
Ala Lys Ser Thr Gly Asp Pro Gln Gly Val Ile Arg His Tyr Val Val
325 330 335
Cys Ser Thr Pro Gln Ser Gln Tyr Tyr Leu Ala Glu Lys His Leu Phe
340 345 350
Ser Thr Ile Pro Glu Leu Ile Asn Tyr His Gln His Asn Ser Ala Gly
355 360 365
Leu Ile Ser Arg Leu Lys Tyr Pro Val Ser Gln Gln Asn Lys Asn Ala
370 375 380
Pro Ser Thr Ala Gly Leu Gly Tyr Gly Ser Trp Glu Ile Asp Pro Lys
385 390 395 400
Asp Leu Thr Phe Leu Lys Glu Leu Gly Thr Gly Gln Phe Gly Val Val
405 410 415
Lys Tyr Gly Lys Trp Arg Gly Gln Tyr Asp Val Ala Ile Lys Met Ile
420 425 430
Lys Glu Gly Ser Met Ser Glu Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Val
435 440 445
Met Met Asn Leu Ser His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Gly Val Cys
450 455 460
Thr Lys Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly
465 470 475 480
Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg His Arg Phe Gln Thr Gln
485 490 495
Gln Leu Leu Glu Met Cys Lys Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr Leu
500 505 510
Glu Ser Lys Gln Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu
515 520 525
Val Asn Asp Gln Gly Val Val Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg
530 535 540
Tyr Val Leu Asp Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Pro
545 550 555 560
Val Arg Trp Ser Pro Pro Glu Val Leu Met Tyr Ser Lys Phe Ser Ser
565 570 575
Lys Ser Asp Ile Trp Ala Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Tyr Ser
580 585 590
Leu Gly Lys Met Pro Tyr Glu Arg Phe Thr Asn Ser Glu Thr Ala Glu
595 600 605
His Ile Ala Gln Gly Leu Arg Leu Tyr Arg Pro His Leu Ala Ser Glu
610 615 620
Lys Val Tyr Thr Ile Met Tyr Ser Cys Trp His Glu Lys Ala Asp Glu
625 630 635 640
Arg Pro Thr Phe Lys Ile Leu Leu Ser Asn Ile Leu Asp Val Met Asp
645 650 655
Glu Glu Ser
<210> 10
<211> 659
<212> PRT
<213> 猕猴巨细胞病毒（Rhesus cytomegalovirus）
<400> 10
Met Ala Ala Val Ile Leu Glu Ser Ile Phe Leu Lys Arg Ser Gln Gln
1 5 1015
Lys Lys Lys Thr Ser Pro Leu Asn Phe Lys Lys Arg Leu Phe Leu Leu
202530
Thr Val His Lys Leu Ser Tyr Tyr Glu Tyr Asp Phe Glu Arg Gly Arg
354045
Arg Gly Ser Lys Lys Gly Ser Ile Asp Val Glu Lys Ile Thr Cys Val
505560
Glu Thr Val Val Pro Glu Lys Asn Pro Pro Pro Glu Arg Gln Ile Pro
65707580
Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Glu Met Glu Gln Ile Ser Ile Ile Glu
859095
Arg Phe Pro Tyr Pro Phe Gln Val Val Tyr Asp Glu Gly Pro Leu Tyr
100 105 110
Val Phe Ser Pro Thr Glu Glu Leu Arg Lys Arg Trp Ile His Gln Leu
115 120 125
Lys Asn Val Ile Arg Tyr Asn Ser Asp Leu Val Gln Lys Tyr His Pro
130 135 140
Cys Phe Trp Ile Asp Gly Gln Tyr Leu Cys Cys Ser Gln Thr Ala Lys
145 150 155 160
Asn Ala Met Gly Cys Gln Ile Leu Glu Asn Arg Asn Gly Ser Leu Lys
165 170 175
Pro Gly Ser Ser His Arg Lys Thr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Thr Pro
180 185 190
Glu Glu Asp Gln Ile Leu Lys Lys Pro Leu Pro Pro Glu Pro Ala Ala
195 200 205
Ala Pro Val Ser Thr Ser Glu Leu Lys Lys Val Val Ala Leu Tyr Asp
210 215 220
Tyr Met Pro Met Asn Ala Asn Asp Leu Gln Leu Arg Lys Gly Asp Glu
225 230 235 240
Tyr Phe Ile Leu Glu Glu Ser Asn Leu Pro Trp Trp Arg Ala Arg Asp
245 250 255
Lys Asn Gly Gln Glu Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Thr Glu Ala
260 265 270
Glu Asp Ser Ile Glu Met Tyr Glu Trp Tyr Ser Lys His Met Thr Arg
275 280 285
Ser Gln Ala Glu Gln Leu Leu Lys Gln Glu Gly Lys Glu Gly Gly Phe
290 295 300
Ile Val Arg Asp Ser Ser Lys Ala Gly Lys Tyr Thr Val Ser Val Phe
305 310 315 320
Ala Lys Ser Thr Gly Asp Pro Gln Gly Val Ile Arg His Tyr Val Val
325 330 335
Cys Ser Thr Pro Gln Ser Gln Tyr Tyr Leu Ala Glu Lys His Leu Phe
340 345 350
Ser Thr Ile Pro Glu Leu Ile Asn Tyr His Gln His Asn Ser Ala Gly
355 360 365
Leu Ile Ser Arg Leu Lys Tyr Pro Val Ser Gln Gln Asn Lys Asn Ala
370 375 380
Pro Ser Thr Ala Gly Leu Gly Tyr Gly Ser Trp Glu Ile Asp Pro Lys
385 390 395 400
Asp Leu Thr Phe Leu Lys Glu Leu Gly Thr Gly Gln Phe Gly Val Val
405 410 415
Lys Tyr Gly Lys Trp Arg Gly Gln Tyr Asp Val Ala Ile Lys Met Ile
420 425 430
Lys Glu Gly Ser Met Ser Glu Asp Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Val
435 440 445
Met Met Asn Leu Ser His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Gly Val Cys
450 455 460
Thr Lys Gln Arg Pro Ile Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly
465 470 475 480
Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg His Arg Phe Gln Thr Gln
485 490 495
Gln Leu Leu Glu Met Cys Lys Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr Leu
500 505 510
Glu Ser Lys Gln Phe Leu His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu
515 520 525
Val Asn Asp Gln Gly Val Val Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg
530 535 540
Tyr Val Leu Asp Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Pro
545 550 555 560
Val Arg Trp Ser Pro Pro Glu Val Leu Met Tyr Ser Lys Phe Ser Ser
565 570 575
Lys Ser Asp Ile Trp Ala Phe Gly Val Leu Met Trp Glu Ile Tyr Ser
580 585 590
Leu Gly Lys Met Pro Tyr Glu Arg Phe Thr Asn Ser Glu Thr Ala Glu
595 600 605
His Ile Ala Gln Gly Leu Arg Leu Tyr Arg Pro His Leu Ala Ser Glu
610 615 620
Lys Val Tyr Thr Ile Met Tyr Ser Cys Trp His Glu Lys Ala Asp Glu
625 630 635 640
Arg Pro Thr Phe Lys Ile Leu Leu Ser Asn Ile Leu Asp Val Met Asp
645 650 655
Glu Glu Ser
