一种盐酸多塞平及其制剂中六种杂质的含量测定方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种盐酸多塞平及其制剂中六种杂质的含量测定方法。
背景技术
盐酸多塞平又名多虑平，是一种常用的三环类抗抑郁药，为非选择性单胺摄取抑制剂，可通过抑制去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)再摄取而增加突触间隙的浓度，临床上主要用于治疗抑郁症、抑郁性神经症及精神分裂症的抑郁状态。
盐酸多塞平检测方法在国内外药典中均有收载，盐酸多塞平片只在中国药典中有收载，但无有关物质检测方法。《中国药典》2015版使用HPLC法，以多塞平顺、反式异构体两峰面积之和计算含量，同时还规定顺式异构体(Z)的比例应为17～23％，有关物质检查中，规定供试品色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰的面积不得大于对照溶液多塞平两主峰面积的和(0.2％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液多塞平两主峰面积和的2.5倍(0.5％)。
USP40版标准使用HPLC法，以多塞平顺、反式异构体两峰面积之和计算含量，同时还规定顺式异构体(Z)的比例应为13.6～18.1％，反式异构体(E)的比例应为81.4～88.2％，有关物质检查中，规定杂质A不得大于0.10％，杂质B不得大于0.10％，杂质C不得大于0.20％，其他单个杂质不得大于0.10％。EP8.0版标准有关物质检测方法与USP40一致，杂质A、杂质B、杂质C的限度要求也与USP一样，另外对总杂限度进行了规定，要求总杂不得大于0.30％。
受生产条件限制，盐酸多塞平及其制剂中常常会被引入A、B、C、D、E、F等多个杂质，但USP或EP均只对杂质A、B、C进行了检测，申请人经研究发现，按照现有USP或EP的检测方法，A、B、C、D、E、F等多个杂质无法在HPLC色谱图中得到很好的分离，不能实现对更多杂质进行全面、有效地质量监控。
发明内容
本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种盐酸多塞平及其制剂中六种杂质的含量测定方法，旨在更加全面地控制产品质量，同时提高检测的准确性和精密度。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种盐酸多塞平及其制剂中六种杂质的含量测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的配制：取盐酸多塞平10mg，用30～70％甲醇水溶液超声溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照品溶液的配制：取盐酸多塞平对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品、杂质F对照品适量，配制成一定浓度的对照品溶液。
3)检测：将供试品溶液和对照品溶液分别用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为215nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为Waters XBridge C18色谱柱，流动相A为pH8.0～9.0的0.01mol/L磷酸氢二钠溶液、流动相B为甲醇乙腈混合液，采用梯度洗脱程序，柱温为25～35℃，进样量10～50μl，所述六种杂质的结构式如下：
优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为50％。
优选地，所述Waters XBridge C18色谱柱的规格为4.6mm×250mm，粒径5μm。
优选地，所述流动相A为pH8.5的0.01mol/L磷酸氢二钠溶液。
优选地，所述流动相B为体积比5:2的甲醇乙腈混合液。
优选地，所述梯度洗脱程序如下：
。
优选地，所述柱温为30℃，进样量20μl。
本发明的有益效果是：采用本发明提供的方法不仅能同时检测出盐酸多塞平及其制剂中常见的六种杂质含量，从而使产品质量得到更加全面、有效地控制，而且所采用的色谱条件使杂质色谱峰的分离度更高，拖尾因子更小，出峰时间更短，从而提高了检测的准确性和精度，缩短了检测时间，从而使盐酸多塞平及其制剂的质量更加可控。
附图说明
图1是杂质A定位的色谱图。
图2是杂质B定位的色谱图。
图3是杂质C定位的色谱图。
图4是杂质D定位的色谱图。
图5是杂质E定位的色谱图。
图6是杂质F定位的色谱图。
图7是盐酸多塞平定位的色谱图。
图8是盐酸多塞平和杂质A、B、C、D、E、F混合对照品溶液的色谱图。
图9是盐酸多塞平制剂和杂质A、B、C、D、E、F混合分离度溶液的色谱图。
图10是盐酸多塞平自制制剂(190102批)供试品溶液的色谱图。
图11是盐酸多塞平自制制剂(190103批)供试品溶液的色谱图。
图12是盐酸多塞平自制制剂(190104批)供试品溶液的色谱图。
图13是盐酸多塞平参比制剂(56450批)供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1色谱柱的选择
试验样品1：盐酸多塞平对照品以及六种有关物质ABCDEF对照品，分别用50％甲醇水溶液制成至少10倍限度浓度的单一组分的定位溶液。
试验样品2：盐酸多塞平片以及六种有关物质ABCDEF对照品，用50％甲醇水溶液制成每1ml中含1mg盐酸多塞平和限度浓度的杂质ABCDEF的混合组分分离度溶液。
试验样品3：盐酸多塞平对照品以及六种有关物质ABCDEF对照品，用50％甲醇水溶液制成每1ml中含限度浓度的盐酸多塞平以及限度浓度的杂质ABCDEF的混合对照品溶液。
仪器：Waters e2695-2489型高效液相色谱仪系列(沃特世科技有限公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Empower色谱工作站)
色谱柱：(1)菲罗门Titank C18，4.6*250mm，5μm
(2)Waters XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm
流动相：A：0.01M磷酸氢二钠溶液(pH7.7)B：甲醇-乙腈＝5:2
A：B＝30:70
柱温：30℃
检测波长：215nm
进样量：20μl
表1单一组分定位溶液的色谱图信息(菲罗门Titank C18)
表2混合组分分离度溶液的色谱图信息(菲罗门Titank C18)
表3混合组分分离度溶液的色谱图信息(Waters XBridge C18)
结果：从表1、表2中可以看出，使用菲罗门Titank C18，4.6*250mm，5μm色谱柱，分离度溶液的色谱图中主成分(盐酸多塞平)峰形较差，与杂质F无法分离。而使用WatersXBridge C18，4.6mm×250mm，5μm色谱柱后，从表3可以看出，主成分峰与各杂质峰保留时间均提前，且主成分峰与杂质F分离效果显著改善，但杂质D(5.571min)与右侧一未知单杂分离度较差，基线未完全分离。相比之下，Waters XBridge C18色谱柱分离效果明显优于菲罗门Titank C18色谱柱，故选择Waters XBridge C18柱进一步优化方法。
实施例2流动相的选择
流动相：(1)A：B＝30:70
(2)A：B＝35:65
(3)A：B＝40:60
(4)梯度洗脱程序：
色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm
其它条件与实施例1相同。
表4流动相比例1(A：B＝30:70)考察结果(分离度溶液)
表5流动相比例2(A：B＝35:65)考察结果(分离度溶液)
表6流动相比例3(A：B＝40:60)考察结果(分离度溶液)
表7梯度洗脱考察结果(混合对照品溶液)
结果：从表4～7中可以看出，流动相比例(A：B＝30:70)的等度洗脱中，杂质D与右侧一未知单杂分离度较差，基线未分离，影响了检测结果的准确性(表4)。流动相比例(A：B＝35:65)的等度洗脱中，杂质D与右侧一未知单杂刚刚基线分离，且杂质A与杂质C基线未完全分离(表5)。流动相比例(A：B＝40:60)的等度洗脱中，杂质A与杂质C重叠在一起，其他有关物质及主成分峰与前后峰分离度良好，但保留时间过长，35min色谱峰未完全出峰完成(表6)。而在梯度洗脱程序中，混合对照品溶液中的盐酸多塞平与各杂质之间分离度均提高，保留时间相对较短；但11.420min的已知杂质峰形较差，拖尾严重，与12.513min的已知杂质刚刚基线分离(表7)。故选择梯度洗脱程序进一步优化方法。
实施例3流动相A缓冲盐pH的选择
流动相：(1)0.01M磷酸氢二钠溶液(pH7.7)
(2)0.01M磷酸氢二钠溶液(pH8.0)
(3)0.01M磷酸氢二钠溶液(pH8.5)
(4)0.01M磷酸氢二钠溶液(pH9.0)
梯度洗脱程序
其它条件与实施例2相同。
表8缓冲盐pH7.7考察结果(混合对照品溶液)
表9缓冲盐pH8.0考察结果(混合对照品溶液)
表10缓冲盐pH8.5考察结果(混合对照品溶液)
表11缓冲盐pH9.0考察结果(混合对照品溶液)
结果：从表8～11中可以看出，在缓冲盐pH7.7条件下，11.420min的已知杂质峰形较差，拖尾严重，与12.513min的已知杂质刚刚基线分离，影响了检测结果的准确性。缓冲盐pH8.0、pH8.5和pH9.0条件下，六个已知杂质与盐酸多塞平峰分离度均大于1.5，且各个峰之间的基线均完全分离。但pH8.0时，14.040min已知杂质拖尾因子为1.24，稍有拖尾；pH8.5和pH9.0时，六个已知杂质峰拖尾因子均不大于1.2，峰形更好。考虑到缓冲盐的pH值越高，对色谱柱的损害越大，故选择最佳缓冲盐pH值为8.5。
实施例4方法验证
(1)测定方法
对照品溶液的配制：取盐酸多塞平对照品20mg、杂质A对照品50mg、杂质B对照品10mg、杂质C对照品20mg、杂质D对照品20mg、杂质E对照品10mg、杂质F对照品10mg，精密称定于100mL量瓶，用50％甲醇水溶液溶解并定容，摇匀。准确移取该溶液1mL于100mL量瓶，用50％甲醇水溶液溶解并制成每1ml中分别含2μg盐酸多塞平、5μg杂质A、1μg杂质B、2μg杂质C、2μg杂质D、1μg杂质E、1μg杂质F的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的配制：取本品20片，研细，精密称定适量(约相当于多塞平10mg)，置10mL量瓶中，加50％甲醇水溶液5mL，超声使盐酸多塞平溶解，用50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)色谱条件
仪器：Waters e2695-2489型高效液相色谱仪系列(沃特世科技有限公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Empower色谱工作站)
色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm
流动相：A：0.01M磷酸氢二钠溶液(pH8.5)B：甲醇-乙腈＝5:2
梯度洗脱程序：
柱温：30℃
检测波长：215nm
进样量：20μl
(3)计算方法：
Cs为对照品溶液中杂质的浓度(μg/mL)
Cu为供试品溶液的浓度(μg/mL)
RU为供试品溶液中杂质的峰面积
RS为对照品溶液中杂质的峰面积
(3)验证内容
按上述液相色谱条件分别进样测定。
1.六种有关物质的定位与系统适应性试验
配制杂质A、B、C、D、E、F定位溶液和系统适用性溶液进行测试，每个溶液进样1针，要求盐酸多塞平与各杂质之间最小分离度不小于1.5。结果见表12～13。
表12六种杂质的定位结果表
表13六种杂质的系统适应性试验(混合对照品溶液)结果表
2.线性
在定量限浓度至不低于200％限度浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，由相关系数R2证实良好的线性关系，要求该线性回归系数R2的数值应不小于0.990，结果见表14。
表14六种杂质的标准曲线、相关系数及校正因子
3.重复性
配制6个相同浓度的样品溶液并进行测试，每个溶液进样1针，要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于10.0％，结果见表15。
表15六种杂质含量测定的重复性试验结果
结果表明：各成分的RSD值在要求范围内，表明检测方法的重复性结果良好。
4.准确度
通过加入已知量的各组分，再测定加样样品中已知组分的测定结果和理论值的比值，从而计算出回收率，以百分率％表达，要求回收率在90.0％～110.0％之间，12次回收率的RSD不得大于10.0％，结果见表16。
表16六种杂质的回收率测定结果
结果表明：该方法测定各有关物质的准确度良好。
实施例5样品测定
(1)供试品溶液的制备：取本品20片，研细，精密称定适量(约相当于多塞平10mg)，置10mL量瓶中，加50％甲醇水溶液5mL，超声使盐酸多塞平溶解，用50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取盐酸多塞平对照品20mg、杂质A对照品50mg、杂质B对照品10mg、杂质C对照品20mg、杂质D对照品20mg、杂质E对照品10mg、杂质F对照品10mg，精密称定于100mL量瓶，用50％甲醇水溶液溶解并定容，摇匀。准确移取该溶液1mL于100mL量瓶，用50％甲醇水溶液溶解并制每1ml中分别含2μg盐酸多塞平、5μg杂质A、1μg杂质B、2μg杂质C、2μg杂质D、1μg杂质E、1μg杂质F的溶液，作为对照品溶液。
(3)色谱条件与系统适应性：仪器：Waters e2695-2489型高效液相色谱仪系列(沃特世科技有限公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Empower色谱工作站)
色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm
流动相：A：0.01M磷酸氢二钠溶液(pH8.5)B：甲醇-乙腈＝5:2
梯度洗脱程序：
柱温：30℃
检测波长：215nm
进样量：20μl
要求盐酸多塞平与各杂质之间最小分离度不小于1.5。
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，测定。
(5)计算公式：见实施例4中(3)。
(6)结果计算
表16六种有关物质的测定结果
