一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种酶联免疫法检测新型冠状病 毒中和抗体的试剂盒及其检测方法。
背景技术
根据冠状病毒基因组结构与系统发生学分析，冠状病毒科分为α、β、γ和δ 四个属，α和β属病毒可感染哺乳动物和人。SARS-CoV-2属于β属的新型冠状病 毒，圆形或椭圆形，直径60-140nm，电镜下呈皇冠样形状。
据报道，有研究团队从10个康复病人记忆B细胞和浆细胞中筛选出399 种单克隆抗体，经过人体体外环境的抗原抗体亲和力检测，以及新冠活病毒和 假病毒的中和实验，筛选出多种中和抗体。大部分中和抗体，如2M-10B11和 ACE2-fc以S蛋白的RBD为靶点，并阻断其与ACE2结合，表现出中和活性。 而4A8抗体对SARS-CoV-2表现出高中和效力，其结合的表位为S蛋白的NTD， 并不抑制S蛋白与ACE2结合。该抗体的轻链远离RBD，推测可能通过抑制S 蛋白的构象变化来中和SARS-CoV-2。因此新型冠状病毒中和抗体靶标包括针 对S蛋白的RBD和S蛋白的NTD。
疫苗是预防传染性疾病的有效方法之一，基于前期在SARS-CoV以及 MERS-CoV疫苗上的安全性以及有效性验证，新冠疫苗拓展了新的平台技术， 具体的开发策略包括了灭活及减活病毒疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、 核酸疫苗和其他疫苗。据报道，全球在研的疫苗至少有142种，其中已有13 种候选疫苗进入了临床阶段，作为疫苗研制“第一梯队”，截止2020年6月24 日，我国已有6种疫苗进入临床研究，其中更是有三款疫苗即将进入临床Ⅲ期 试验。预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体液免疫，因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对于疫苗的研制和 质控具有重要意义。
对于突发重大传染性疾病的预防，中和抗体治疗是有效预防和治疗的一个 重要策略。抗体制剂不但可用于流行区的高危易感染群的紧急被动免疫，而且 对于临床患者也具有较好的治疗作用。从临床免疫机制来看，大部分新型冠状 病毒肺炎患者康复后，机体内会产生针对SARS-CoV-2的特异性抗体，能够有 效清除病毒。在目前缺乏疫苗和特效药物的特殊情况下，采用特免血浆制品治 疗SARS-CoV-2感染是最为有效的方法之一，能够明显降低危重患者的病死率。
重型和危重型新型冠状病毒肺炎诊断和治疗专家共识建议：“将含有新型冠 状病毒抗体的人恢复期血浆用于病情进展较快、重型和危重型患者，可以作为 特异性治疗的一种选择。如使用恢复期血浆，应检测血浆中保护性抗体滴度水 平”。
目前的中和抗体检测主要在生物安全三级实验室内进行。利用活病毒细胞 培养的中和试验检测，对实验室等级要求高，严重限制了临床大规模的推广使 用。开发出可在生物安全二级实验室或普通实验室开展的快速中和抗体检测方 法，具有重要意义。
因此，中和抗体检测方法及试剂盒的开发，利于疫病流行病学调查、免疫 抗体监测以及疫苗免疫效力评价。
发明内容
由于新型冠状病毒感染后的康复人群的中和抗体评价及疫苗的免疫效力评 价均需要中和抗体的检测，目前利用活病毒细胞培养的中和试验检测，对实验 室等级要求高，严重限制了疫苗临床大规模的推广使用和特免血浆制品临床治 疗。为解决上述问题，本发明通过具有灵敏度高、特异性好、重复性好等特点 的酶联免疫法进行试剂盒的开发，建立了一种检测新型冠状病毒RBD中和抗体 和NTD中和抗体的酶联免疫试剂盒。
本发明的目的在于提供一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂 盒。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述的试剂盒定量检测新型冠状病毒 中和抗体的方法。
根据本发明的目的，本发明提供一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗 体的试剂盒，所述试剂盒包括抗原包被的酶标板，所述酶标板为两个，其中一 个包被S蛋白的RBD抗原；另一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别 用封闭液进行封闭。
进一步的，所述封闭液为含牛血清白蛋白、酪蛋白的PBS溶液。
优选的，所述PBS溶液中牛血清白蛋白的浓度为1-5wt％。
所述封闭液为含牛血清白蛋白的Tris-HCl溶液。
优选的，所述Tris-HCl溶液中牛血清白蛋白的浓度为1-5wt％。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清；所述阳性对 照血清包括新型冠状病毒RBD疫苗免疫人获得的高免血清和NTD疫苗免疫兔 获得的高免血清。
优选的，所述阴性对照血清为未感染新型冠状病毒且未经免疫的人的血清。
更进一步的，所述试剂盒还包括定标品、样本稀释液、酶标二抗、显色液、 终止液和洗涤液。
具体的，所述定标品包括两个，其中一个定标品是用样本稀释液稀释的 RBD中和抗体；另一个定标品是用样本稀释液稀释的NTD中和抗体。
优选的，所述用样本稀释液稀释的RBD中和抗体或用样本稀释液稀释的 NTD中和抗体的浓度均为200-5000ng/mL。
进一步的，所述样本稀释液为含牛血清白蛋白的PBST溶液；优选的，所 述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.5wt％，所述样本稀释液中吐温20的含量为 0.05-1wt％。
进一步的，所述酶标二抗包括HRP标记的鼠抗人IgG抗体。
优选的，所述酶标二抗中鼠抗人IgG抗体的浓度为1:2000-1:10000。
进一步的，所述显色液为TMB底物液，所述终止液为硫酸溶液。
优选的，所述硫酸溶液的浓度为1.5mol/L-2mol/L；所述洗涤液含有 10mmol/L-50mmol/L的Tris-HCl和0.05％-1％的Tween-20。
具体的，所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH为8.5-9.5的碳酸 钠-碳酸氢钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD至1μg/mL-5μg/mL，分别包被至 两个酶标板中；每孔加入50μL-120μL，分别贴好盖板膜，分别在2-8℃包被 12h-20h后甩干，分别用洗涤液洗涤3-5次；每孔均加入封闭液250-300μL， 36-38℃封闭1.5-2.5h后甩干，分别用洗涤液洗涤3-5次，贴好盖板膜，即得所 述抗原包被的酶标板。
具体的，所述酶标二抗的制备方法，包括以下步骤：
A:将1mL的10-15mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL HRP水溶液于 2-8℃混合反应30min-60min，制成活化的HRP溶液；然后，向所述活化的HRP 溶液中加入0.5mL的90％乙二醇水溶液室温避光反应30min-60min，得到HRP 混合溶液；
B:将经过0.05-0.1moL/L pH为8.5-9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的 鼠抗人IgG抗体与步骤A得到的HRP混合溶液按质量比1:1-1:2进行混合，于 2-8℃透析过夜，得到透析好的抗体；
C.向步骤B得到的所述透析好的抗体中加入2-8mg/mL的NaBH4溶液 80-120μL，2-8℃反应2-4h，然后装入透析袋中，于10-50mM，pH为7.4PBS 溶液中2-8℃透析过夜；
D.在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵， 置2-8℃反应1h-2h；于3000-5000rpm，30-40min离心弃上清，沉淀物用半饱和 硫酸铵洗两次；然后将沉淀物溶于1mL 10-50mM的PBS溶液；将上述溶液于 10-50mM的PBS溶液中透析后，10000-12000rpm离心，去除沉淀，取上清液 即为酶标二抗。
一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的方法，采用所述试剂盒对新 型冠状病毒中和抗体进行检测，评价疫苗免疫效力。
优选的，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测血清按1:100-1:1000的比例稀释，取80-120μL稀释好的待测 血清和定标品分别加入酶标孔中，36-38℃孵育0.8-1.2h后甩干，用清洗液洗涤； 再加入1:2000-1:10000的酶标二抗80-120μL，36-38℃孵育0.5-1h后，甩干，用 PBST洗涤；
(2)每个步骤(1)的酶标孔中均加入显色液100μL，36-38℃孵育5-15min， 然后加入终止液终止反应；
(3)用酶标仪在450nm下读取OD值，将定标品进行不同浓度的稀释， 得到定标品稀释液，将定标品稀释液的浓度与OD拟合标曲，分别得到NTD中 和抗体和RBD中和抗体的浓度-OD标准曲线；
(4)将释好的待测血清所测OD代入标曲计算得到的值乘以稀释倍数，即 为待测血清中中和抗体浓度。
优选的，步骤(3)中，所述定标品稀释液为样品稀释液将定标品稀释至覆 盖线性范围的6个定标品。
酶联免疫法是基于抗原或抗体的固相化、抗原或抗体的酶标记结合的检测 方法，加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与样本中受 检物质的量直接相关，由此进行定量或定性分析。
本发明的有益效果为：
本发明提供的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方 法，应用灵敏度高、特异性好、重复性好的酶联免疫法，通过将抗原固相化， 利于洗涤去除非特异结合和分离未反应的物质。与传统的两步法，先加入待测 血清反应，洗涤后，加入酶标二抗进行反应相比，本发明采用一步法，即将待 测物与酶标二抗同时加入酶标板中反应，极大的缩短了反应时间，更利于高通 量的反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例5的RBD拟合标准曲线图；
图2是实施例5的NTD拟合标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施例中，所述一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和 抗体的试剂盒包括抗原包被的酶标板，所述酶标板为两个，其中一个包被S蛋 白的RBD抗原；另一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别用封闭液进 行封闭；所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、定标品、样本稀释 液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液；所述阳性对照血清包括新型冠状病 毒RBD疫苗免疫人获得的高免血清和NTD疫苗免疫兔获得的高免血清；所述 阴性对照血清为未感染新型冠状病毒且未经免疫的人的血清；
具体的，所述定标品包括两个，其中一个定标品是用样本稀释液稀释的 RBD中和抗体；另一个定标品是用样本稀释液稀释的NTD中和抗体；所述样 本稀释液为含牛血清白蛋白的PBST溶液；所述酶标二抗包括HRP标记的鼠抗 人IgG抗体；所述酶标二抗中鼠抗人IgG抗体的浓度为1:2000-1:10000；所述 显色液为TMB底物液，所述终止液为硫酸溶液；
所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH为8.5-9.5的碳酸钠-碳酸氢 钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD至1μg/mL-5μg/mL，分别包被至两个酶 标板中；每孔加入50μL-120μL，分别贴好盖板膜，分别在2-8℃包被12h-20h 后甩干，分别用洗涤液洗涤3-5次；每孔均加入封闭液250-300μL，36-38℃封 闭1.5-2.5h后甩干，分别用洗涤液洗涤3-5次，贴好盖板膜，即得所述抗原包 被的酶标板。
所述酶标二抗的制备方法，包括以下步骤：
A:将1mL的10-15mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL HRP水溶液于 2-8℃混合反应30min-60min，制成活化的HRP溶液；然后，向所述活化的HRP 溶液中加入0.5mL的90％乙二醇水溶液室温避光反应30min-60min，得到HRP 混合溶液；
B:将经过0.05-0.1moL/L pH为8.5-9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的 鼠抗人IgG抗体与步骤A得到的HRP混合溶液按质量比1:1-1:2进行混合，形 成待透析液，于2-8℃透析过夜，得到透析好的抗体；
C.向步骤B得到的所述待透析好的抗体中加入2-8mg/mL的NaBH4溶液 80-120μL，2-8℃反应2-4h，然后装入透析袋中，于10-50mM，pH为7.2-7.4PBS 溶液中2-8℃透析过夜；
D.在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵， 置2-8℃反应1h-2h，3000rpm-5000rpm离心30-40min，弃上清，沉淀物用半饱 和硫酸铵洗2次，然后将沉淀物溶于1mL 10-50mM的PBS溶液；将上述溶液 于10-50mM的PBS溶液中透析后，10000-12000rpm离心20-30min，去除沉淀， 取上清液即为酶标二抗。
一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的方法，采用所述试剂盒对新 型冠状病毒中和抗体进行检测，评价疫苗免疫效力；所述方法包括以下步骤：
(1)将待测血清按1:100-1:1000的比例稀释，取80-120μL稀释好的待测 血清和定标品分别加入酶标孔中，36-38℃孵育0.8-1.2h后甩干，用清洗液洗涤； 再加入1:2000-1:10000的酶标二抗80-120μL，36-38℃孵育0.5-1h后，甩干， 用PBST洗涤；
(2)每个步骤(1)的酶标孔中均加入显色液100μL，36-38℃孵育5-15min， 然后加入终止液终止反应；
(3)用酶标仪在450nm下读取OD值，将定标品进行不同浓度的稀释， 得到定标品稀释液，将定标品稀释液的浓度与OD拟合标曲，分别得到NTD中 和抗体和RBD中和抗体的浓度-OD标准曲线；
(4)将释好的待测血清所测OD代入标曲计算得到的值乘以稀释倍数，即 为待测血清中中和抗体浓度。
实施例1
本实施例提供了一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，所 述试剂盒包括抗原包被的酶标板、定标品、样本稀释液、酶标二抗、显色液、 终止液和洗涤液，所述酶标板为两个，其中一个包被S蛋白的RBD抗原；另 一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别用封闭液进行封闭；所述封闭液 为含牛血清白蛋白的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液中牛血清白蛋白的浓度 为3wt％；样本稀释液、显色液、终止液和洗涤液均为常规溶液；定标品包括 两个，其中一个定标品是用样本稀释液稀释的RBD中和抗体；另一个定标品是 用样本稀释液稀释的NTD中和抗体；酶标二抗包括HRP标记的鼠抗人IgG抗 体。
实施例2
本实施例提供了一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，所 述试剂盒包括抗原包被的酶标板、定标品、样本稀释液、酶标二抗、显色液、 终止液和洗涤液，所述酶标板为两个，其中一个包被S蛋白的RBD抗原；另 一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别用封闭液进行封闭，所述封闭液 为含牛血清白蛋白、酪蛋白的PBS溶液，所述PBS溶液中牛血清白蛋白的浓度 为3wt％；样本稀释液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液均为常规溶液； 定标品包括两个，其中一个定标品是用样本稀释液稀释的RBD中和抗体；另一个定标品是用样本稀释液稀释的NTD中和抗体。
实施例3
本实施例提供了一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，所 述试剂盒包括抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、定标品、样 本稀释液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液；所述酶标板为两个，其中一 个包被S蛋白的RBD抗原；另一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别 用封闭液进行封闭，所述封闭液为含牛血清白蛋白、酪蛋白的PBS溶液，所述 PBS溶液中牛血清白蛋白的浓度为1wt％，所述阳性对照血清包括新型冠状病 毒RBD疫苗免疫人获得的高免血清和NTD疫苗免疫兔获得的高免血清，阴性对照血清为未感染新型冠状病毒且未经免疫的人的血清；定标品包括两个，其 中一个定标品是用样本稀释液稀释的RBD中和抗体；另一个定标品是用样本稀 释液稀释的NTD中和抗体；所述用样本稀释液稀释的RBD中和抗体或用样本 稀释液稀释的NTD中和抗体的浓度均为5000ng/mL；所述样本稀释液为含牛血 清白蛋白的PBST溶液；牛血清白蛋白的浓度为0.1wt％，所述样本稀释液中吐 温20的含量为1wt％，所述酶标二抗包括HRP标记的鼠抗人IgG抗体，所述 酶标二抗中鼠抗人IgG抗体的浓度为1:2000显色液为TMB底物液，所述终止液为硫酸溶液，所述硫酸溶液的浓度为2mol/L；所述洗涤液含有10mmol/L的 Tris-HCl和1％的Tween-20；
具体的，所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH为9.5的碳酸钠- 碳酸氢钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD至1μg/mL，分别包被至两个酶标板 中；每孔加入120μL，分别贴好盖板膜，分别在2℃包被20h后甩干，分别用 洗涤液洗涤3次；每孔均加入封闭液300μL，36-38℃封闭1.5h后甩干，分别用 洗涤液洗涤5次，贴好盖板膜，即得所述抗原包被的酶标板；
具体的，所述酶标二抗的制备方法，包括以下步骤：
A:将1mL的10mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL HRP水溶液于8℃ 混合反应60min，制成活化的HRP溶液；然后，向所述活化的HRP溶液中加 入0.5mL的90％乙二醇水溶液室温避光反应30min，得到HRP混合溶液；
B:将经过0.05moL/L pH为9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的鼠抗人 IgG抗体与步骤A得到的HRP混合溶液按质量比1:1进行混合，于2-8℃透析 过夜，得到透析好的抗体；
C.向步骤B得到的所述待透析好的抗体中加入8mg/mL的NaBH4溶液 80μL，4℃反应4h，然后装入透析袋中，于20mM，pH为7.4PBS溶液中4℃ 透析过夜；
D.在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵， 置4℃反应1h，5000rpm离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次， 然后将沉淀物溶于20mM，pH为7.4PBS溶液；将上述溶液于10-50mM的PBS 溶液中透析后，10000rpm 30min离心，去除沉淀，取上清液即为酶标二抗。
实施例4
本实施例提供了一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，所 述试剂盒包括抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、定标品、样 本稀释液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液；所述酶标板为两个，其中一 个包被S蛋白的RBD抗原；另一个包被S蛋白的NTD；两个所述酶标板分别 用封闭液进行封闭，所述封闭液为含牛血清白蛋白、酪蛋白的PBS溶液，所述 PBS溶液中牛血清白蛋白的浓度为3wt％，所述阳性对照血清包括新型冠状病 毒RBD疫苗免疫人获得的高免血清和NTD疫苗免疫兔获得的高免血清，阴性对照血清为未感染新型冠状病毒且未经免疫的人的血清；定标品包括两个，其 中一个定标品是用样本稀释液稀释的RBD中和抗体；另一个定标品是用样本稀 释液稀释的NTD中和抗体；所述用样本稀释液稀释的RBD中和抗体或用样本 稀释液稀释的NTD中和抗体的浓度均为600ng/mL；所述样本稀释液为含牛血 清白蛋白的PBST溶液；牛血清白蛋白的浓度为0.3wt％，所述样本稀释液中吐 温20的含量为0.05-1wt％，所述酶标二抗包括HRP标记的鼠抗人IgG抗体， 所述酶标二抗中鼠抗人IgG抗体的浓度为1:6000显色液为TMB底物液，所述终止液为硫酸溶液，所述硫酸溶液的浓度为1.8mol/L；所述洗涤液含有 30mmol/L的Tris-HCl和0.5％的Tween-20；
具体的，所述酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH为9.0的碳酸钠- 碳酸氢钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD至3μg/mL，分别包被至两个酶标 板中；每孔加入85μL，分别贴好盖板膜，分别在6℃包被16h后甩干，分别 用洗涤液洗涤4次；每孔均加入封闭液280μL，37℃封闭2h后甩干，分别用 洗涤液洗涤4次，贴好盖板膜，即得所述抗原包被的酶标板；
具体的，所述酶标二抗的制备方法，包括以下步骤：
A:将1mL的13mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL HRP水溶液于6℃ 混合反应40min，制成活化的HRP溶液；然后，向所述活化的HRP溶液中加 入0.5mL的90％乙二醇水溶液室温避光反应45min，得到HRP混合溶液；
B:将经过0.5moL/L pH为9.0碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的鼠抗人 IgG抗体与步骤A得到的HRP混合溶液按质量比1:2进行混合，于6℃透析过 夜，得到透析好的抗体；
C.向步骤B得到的所述透析好的抗体中加入6mg/mL的NaBH4溶液100 μL，4℃反应3h，然后装入透析袋中，于35mM，pH为7.4PBS溶液中4℃透 析过夜；
D.在搅拌下，向步骤C得到的透析液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置 6℃反应1.5h，5000rpm离心25min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次， 然后将沉淀物溶于35mM，pH为7.4PBS溶液；将上述溶液于35mM的PBS 溶液中透析后，10000rpm 30min离心，去除沉淀，取上清液即为酶标二抗。
采用所述试剂盒对新型冠状病毒中和抗体进行检测，检测方法包括以下步 骤：
(1)将待测血清按1:100的比例稀释，取120μL稀释好的待测血清和定标 品分别加入酶标孔中，36℃孵育1.2h后甩干，用清洗液洗涤；再加入1:10000 的酶标二抗80μL，36-38℃孵育0.5h后，甩干，用PBST洗涤；
(2)每个步骤(1)的酶标孔中均加入显色液100μL，38℃孵育5min，然 后加入终止液终止反应；
(3)用酶标仪在450nm下读取OD值，将定标品进行不同浓度的稀释， 得到定标品稀释液，将定标品稀释液的浓度与OD拟合标曲，分别得到NTD中 和抗体和RBD中和抗体的浓度-OD标准曲线；
(4)将释好的待测血清所测OD代入标曲计算得到的值乘以稀释倍数，即 为待测血清中中和抗体浓度。
实施例5
本实施例提供了一种酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒，所 述试剂盒包括抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、定标品、样 本稀释液、酶标二抗、显色液、终止液和洗涤液；
一、制备抗原包被的酶标板
(1)用pH8.5-9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液分别稀释RBD抗原和NTD为 3μg/mL，每孔加入80μL，分别包被至两个酶标板中；贴好盖板膜，4℃包被16h 后甩干，用清洗液洗涤5次；
(2)酶标板中每孔加入封闭液280μL，36-38℃封闭2h后甩干，用清洗液洗涤 3次，贴好盖板膜，即完成抗原包被的酶标板的制备；
二、HRP标记的鼠抗人IgG抗体的制备：
(1)将1mL 13mg/mL NaIO4水溶液与1mL 5mg/mL HRP水溶液于4℃混 合反应50min制成活化的HRP溶液；加入0.5mL 90％乙二醇水溶液室温避光反 应50min；
(2)将经过0.5moL/L pH9.0碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的鼠抗人IgG 抗体与上述HRP溶液按质量比1:1混合，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析；加入 6mg/mL NaBH4溶液100μL，4℃反应3h。
(3)将上述溶液装入透析袋中，于20mM，pH7.4 PBS溶液中4℃透析过 夜(12小时)；
(4)在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置4℃反应1.5h，5000rpm 离心25min，弃上清。用半饱和硫酸铵洗2次，沉淀物溶于20mM，pH7.4 PBS 中；
(5)于20mM，pH7.4 PBS缓冲液中透析，去除铵离子，用萘氏试剂检 测，10000rpm30min去除沉淀，上清即为HRP标记的鼠抗人IgG抗体；
三、制备定标品：
(1)定标品配制：用样品稀释液分别将RBD中和抗体稀释至0、1ng/mL、 5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和NTD中和抗体稀释至覆盖线性范 围的6个定标品0、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；
(2)定标品测试：将配制好的定标品通过酶联免疫法检测，得到OD值；
(3)定量标准曲线的建立：根据校准品的制备浓度和OD值采用合适的拟 合方式生成该批试剂的校准曲线；结果如下表1和表2；将表1、表2数据拟合 成标准曲线，拟合标准曲线见图1和图2：
表1 RBD检测数据
表2 NTD检测数据
由图1和图2可以看出，本发明的试剂盒用于RBD中和抗体、NTD中和 抗体检测具有极好的线性，利于准确测定待测血清样本中的中和抗体含量。
四、样本稀释液的配制
样本稀释液的配方为：含0.1％-0.5％BSA的PBST溶液，Tween-20含量为 0.05％-1％Tween-20；
五、洗涤液的配制
洗涤液的配方为：10mmol/L-50mmol/L Tris-HCl，0.05％-1％Tween-20；
六、试剂盒的最低检测限检测
将样品稀释液作为空白样本，重复测试20次，计算平均信号值MN和标 准差SD，将MN+2SD代入标准曲线中，计算出对应的浓度值，即为试剂盒的 最低检测限；试剂盒最低检测限检测结果如表3所示：
表3试剂盒最低检测限检测结果
七、试剂盒的批内精密度测试
用样品稀释液将参考品稀释至低、中、高三个浓度，每个浓度重复测试10 次，计算平均信号值MN和标准差SD，分别计算CV(CV＝SD/MN×100％)， CV＜10％为合格；试剂盒批内精密度实验结果如表4所示：
表4试剂盒批内精密度实验结果
从表4中可见，本发明的试剂盒批内精密度符合标准，说明批内精密度良 好。
八、试剂盒的批间精密度测试
用样品稀释液将参考品稀释至高、中、低三个浓度，分别用三个不同批次 的试剂盒重复测试10次，分别计算不同浓度样本批间CV，CV＜15％为合格； 试剂盒批间精密度实验结果如表5和表6所示：
表5试剂盒批间精密度实验结果——RBD中和抗体
表6试剂盒批间精密度实验结果——NTD中和抗体
从表5和表6中可以看出，本发明的试剂盒批间精密度符合标准，说明批 间精密度良好。
九、回收率实验
将一定浓度的NTD中和抗体和RBD中和抗体参考品分别加入到低值临床 样本中，使其终浓度在10ng/mL左右，参考品的加入体积不得高于终体积的 1/20，用试剂盒测试低值样本浓度和加参考品后样本浓度，做3个平行测试。 分别根据以下公式1计算回收率R，回收率在80-120％判定为合格；
R——回收率；
V——加入参考品体积；
V0——样本的体积；
C——样本加入标准液后的测定浓度；
C0——样本的测定浓度；
Cs——标准溶液的浓度；
NTD中和抗体回收率和RBD中和抗体回收率结果如表7、表8所示：
表7 NTD中和抗体回收率实验结果
表8 RBD中和抗体回收率实验结果
从表7和表8中可以看出，NTD中和抗体回收率和RBD中和抗体回收 率均在80-120％之间。
十、检测临床样本符合性
使用300例临床注射新冠疫苗免疫样本，与临床中和实验比对，计算本发 明试剂盒测定结果与中和实验结果符合或差异程度的统计学指标，评价方法如 下表9：
表9评价方法
阳性符合率：受试试剂检出阳性的样本占标准检出阳性样本总数的比例， 即阳性符合率。
阴性符合率：受试试剂检出阴性的样本占标准检出阴性样本总数的比例， 即阴性符合率。
总符合率：临床检出结果一致的样本占总样本的比例，即总符合率。
一致率：计算Kappa系数，若Kappa系数≥0.75，表明一致率良好。
用下列公式表示：
阳性符合率＝A/(A+C)×100％阴性符合率＝D/(B+D)×100％
总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％
Kappa系数＝2×(A×D-B×C)/[(A+B)×(B+D)+(A+C)×(C+D)]
结果如表10、表11所示。
表10临床样本符合性结果——NTD中和抗体
从表10可以计算出：阳性符合率＝92.67％；阴性符合率＝96.67％；总符合 率＝94.67％；Kappa系数＝0.8933。
表11临床样本符合性结果——RBD中和抗体
从表11可以计算出：阳性符合率＝95.33％；阴性符合率＝100％；总符合率 ＝95.33％；Kappa系数＝0.9533。
以上试验说明，本发明提供的酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体的试 剂盒及其检测方法，用于新型冠状病毒疫苗评估，与临床中和实验比对，其灵 敏度、特异性均较好，利于临床准确评估疫苗效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。
