荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒。
背景技术
单克隆抗体是通过采用细胞融合技术，使小鼠脾免疫细胞与小鼠骨髓瘤细胞相互融合形成杂交瘤细胞，在体外培养的条件下分泌产生的针对单一抗原决定簇的抗体。B淋巴细胞在抗原的刺激下，可以分化、增殖形成具有针对这种抗原的特异性抗体。可以将体外生长繁殖的非分泌型的骨髓瘤细胞与这种B淋巴细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞既具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力又具有骨髓瘤的体外无限生长的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或是注射入动物体内就能获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术就是单克隆抗体技术。这类单克隆抗体不仅具有相同的特异性，且其Ig的类、亚类型都是相同的，因为它是由单个B淋巴细胞(即基因完全相同的杂交瘤细胞)增殖形成的细胞系产生，具有特异性高、可复制性、可重复性、检测灵敏性等优点。
免疫荧光技术又被称为荧光抗体探针技术，免疫荧光技术是先将特异性的抗原注入实验动物体内，使动物产生抗体，将抗体免疫球蛋白从动物的血清中分离出来，用荧光探针染料标记抗体，制成荧光标记抗体溶液，用荧光标记的抗体和特异性抗原发生抗原-抗体特异性反应，利用荧光显微镜技术可以非常灵敏的观察抗体-抗原复合物在组织内的分布情况。免疫荧光技术具有较高的特异性和敏感性。
单克隆抗体免疫荧光技术是单克隆抗体技术和免疫荧光技术的一种结合，把不影响单克隆抗体免疫学特性的荧光探针染料与单克隆抗体结合，然后使用荧光显微、激光扫描共聚焦显微等方法进行检测，即单克隆抗体免疫荧光技术。因其特有的优点，在流感病毒的诊断、病原微生物的检测等方面都有着广泛的应用。
专利CN111308063A提供了一种藻红蛋白免疫荧光探针标记的方法，采用胺-巯基交联剂活化目标蛋白，同时对藻红蛋白进行巯基化处理，然后将活化后的目标蛋白与巯基化的藻红蛋白交联，从而获得免疫荧光探针。专利CN111044732A提供了一种CD45抗原检测的试剂盒，将活化的荧光蛋白与活化的抗体交联后，可用于CD45抗原的检测。传统的标记通常是采用SMCC交联剂偶连抗体和荧光蛋白或其他偶连蛋白上的氨基和巯基，其缺点为SMCC会产生抗体与抗体，偶连蛋白/荧光蛋白之间的交联产物，交联效率较低，荧光标记蛋白的信号较差。现有技术中还有一种实施步骤(赵亚杰,等.荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体.微生物学免疫学进展[J].2006,34(2):32-34.)：采用SPDP和SMCC分别活化PE和目标蛋白，然后将活化的PE巯基化，再将巯基化的PE与活化后的目标蛋白交联。这种方法导致在进行荧光检测时，最终获得的目标蛋白PE标记物的阴阳信号信噪比较差，背景信号较强。
因此，亟需开发一种特异性强、操作简单、检测效率更高的标记方法。
发明内容
术语：
除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
PE(R-Phycoerythrin,R-PE)：藻红蛋白；
PERCP(Peridinin-Chlorophyll-Protein Complex)：多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物；
APC(Allophycocyanin)：别藻蓝素；
NEM(Maleimide)：马来酰亚胺；
Sulfo-SMCC(S-SMCC)：4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；
PBS(phosphate buffered solution)：磷酸盐缓冲液；
McAb(monoclonal antibody)：单克隆抗体；
Cys(Cysteine)：半胱氨酸；
TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)：三(2-羧乙基)膦；
Sulfo-LC-SPDP(succinimidyl 6-[3(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate，S-LC-SPDP)：琥珀酰亚胺6-[3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸盐，异型双功能交联剂水溶LC-SPDP；
SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)：琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐；
LC-SPDP(succinimidyl 6-[3(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate)：琥珀酰亚胺6-[3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸盐，非水溶性交联剂；
GMBS(4-Maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester)：4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯；
MBS(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester)：3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯；
PDPH(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide)：3-(2-二硫吡啶基)丙酸酰肼。
针对上述不足，本发明通过巯基封闭剂，交联剂及二硫键还原剂实现了抗体与荧光蛋白和/或偶联蛋白之间的定向偶联，提高了荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体标记的交联效率，并进一步提高了荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体标记的特异性，增强了荧光信号。
本申请的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体的标记方法，包括以下步骤：
(1)荧光蛋白和/或偶联蛋白经脱盐处理后与巯基封闭剂发生反应；
(2)步骤(1)得到的巯基封闭的荧光蛋白和/或偶联蛋白的氨基与交联剂A发生反应；
(3)单克隆抗体的巯基化反应，所述的单克隆抗体的巯基化反应包括单克隆抗体与交联剂B的反应，及单克隆抗体-交联剂B与二硫键还原剂的还原反应；
(4)步骤(3)得到的巯基化的单克隆抗体与步骤(2)得到的交联荧光蛋白和/或偶联蛋白进行定向偶联反应，反应完全后，经NEM、Cys及PBS处理步骤，得到荧光标记抗体。
具体地，所述的荧光蛋白和/或偶联蛋白包括PERCP、PE、PECy5、PECy5.5、PECy7、PerCPCy5.5、APCCy5.5、APCCy7或者APC等。
具体地，步骤(1)中，所述荧光蛋白和/或偶联蛋白脱盐处理是为了将荧光蛋白和/或偶联蛋白置换到含有EDTA的PBS缓冲液中，防止荧光蛋白和/或偶联蛋白悬浊液中含有的游离氨基干扰反应。
脱盐处理步骤包括：
1)将荧光蛋白和/或偶联蛋白悬浊液震荡混合均匀，离心，去上清；
2)向沉淀中加入含有EDTA的PBS缓冲液，待充分溶解后离心，取上清；
3)将上清液移至超滤管内，采用PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液对上清液进行超滤处理，获得脱盐后的荧光蛋白和/或偶联蛋白。
具体地，步骤(1)中所述的巯基封闭剂包括氨乙基化试剂、碘乙酰胺、NEM、BMPA或者MMTS。
进一步具体地，步骤(1)中所述的巯基封闭剂为NEM。
具体地，步骤(1)中所述的荧光蛋白和/或偶联蛋白与巯基封闭剂的摩尔比为1:3-1:1000。
进一步具体地，步骤(1)中所述的荧光蛋白和/或偶联蛋白与巯基封闭剂的摩尔比为1:50。
具体地，步骤(1)中所述的荧光蛋白和/或偶联蛋白与巯基封闭剂的反应条件为25℃反应1.5h。
具体地，步骤(2)中所述的交联剂A包括S-SMCC、磺基化SMCC、聚乙二醇化SMCC或者LC-SMCC。
进一步具体地，步骤(2)中所述的交联剂A为S-SMCC。
具体地，步骤(2)中所述的巯基封闭的荧光蛋白和/或偶联蛋白与交联剂A的摩尔比为1:5-1:100。
进一步具体地，步骤(2)中所述的巯基封闭的荧光蛋白和/或偶联蛋白与交联剂A的摩尔比为1:20。
具体地，步骤(2)中所述的巯基封闭的荧光蛋白和/或偶联蛋白与交联剂A的反应条件为25℃反应1.5h。
具体地，步骤(3)中所述的交联剂B包括S-LC-SPDP、SPDP、LC-SPDP、PDPH、MBS或者GMBS。
进一步具体地，步骤(3)中所述的交联剂B为S-LC-SPDP。
具体地，步骤(3)中所述的单克隆抗体与所述的交联剂B的摩尔比为1:10-1:50。
进一步具体地，步骤(3)中所述的单克隆抗体与交联剂B的反应条件为25℃反应1h。
具体地，步骤(3)中所述的二硫键还原剂包括二硫苏糖醇DTT、β-巯基乙醇或者TCEP。
进一步具体地，步骤(3)中所述的二硫键还原剂为TCEP。
具体地，步骤(3)中所述的二硫键还原剂与单克隆抗体-交联剂B的反应终浓度为10-50mM。
进一步具体地，步骤(3)中所述的二硫键还原剂与单克隆抗体-交联剂B的反应终浓度为20mM。
进一步具体地，步骤(3)中所述的单克隆抗体-交联剂B与二硫键还原剂的反应条件为25℃反应1.5h。
具体地，步骤(4)中所述的步骤(3)得到的巯基化的单克隆抗体与步骤(2)得到的交联荧光蛋白和/或偶联蛋白的摩尔比为1:0.5-1:100。
具体地，步骤(4)中所述的步骤(3)得到的巯基化的单克隆抗体与步骤(2)得到的交联荧光蛋白和/或偶联蛋白的摩尔比为1:5。
具体地，步骤(4)中所述的步骤(3)得到的巯基化的单克隆抗体与步骤(2)得到的交联荧光蛋白和/或偶联蛋白的反应条件为25℃反应3h。
具体地，步骤(4)中所述的NEM处理步骤为巯基化的单克隆抗体与交联荧光蛋白和/或偶联蛋白反应完全后，加入1/10体积的NEM，25℃反应1.5h。
具体地，步骤(4)中所述的Cys处理步骤为NEM处理完全后，加入1/10体积的Cys溶液，4℃反应过夜。
具体地，步骤(4)中所述的PBS处理步骤为Cys处理完全后，加入适量PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)缓冲液，使抗体终浓度为0.25mg/mL。
另一方面，本发明提供了一种用于荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体的标记的试剂盒，所述用于荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体的标记的试剂盒包括单克隆抗体、荧光蛋白和/或偶联蛋白、交联剂A、交联剂B、巯基封闭剂、二硫键还原剂、NEM、Cys、PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液、PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)缓冲液。其中，所述交联剂A为S-SMCC、磺基化SMCC、聚乙二醇化SMCC或者LC-SMCC；所述交联剂B为S-LC-SPDP、SPDP、LC-SPDP、PDPH、MBS或者GMBS；所述巯基封闭剂为氨乙基化试剂、碘乙酰胺、NEM、BMPA或者MMTS；所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇DTT、β-巯基乙醇或者TCEP。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明采用巯基封闭剂处理荧光蛋白和/或偶联蛋白封闭巯基，封闭巯基后交联剂A仅与荧光蛋白和/或偶联蛋白的氨基发生反应，制备得到的荧光蛋白-交联剂A和/或偶联蛋白-交联剂A将定向与单克隆抗体的巯基反应，实现了单克隆抗体与荧光蛋白和/或偶联蛋白的定向偶联，提高了荧光蛋白和/或偶联蛋白与单克隆抗体反应的特异性。
(2)本发明将单克隆抗体与交联剂B发生反应，使单克隆抗体蛋白的氨基与交联剂B结合，再进一步采用二硫键还原剂与单克隆抗体-交联剂B进行反应还原二硫键，通过上述步骤制备的单克隆抗体不仅具有本身二硫键还原形成的巯基，还包括单克隆抗体的氨基与交联剂B结合转换形成的巯基。因此，单个单克隆抗体上结合的荧光蛋白和/或偶联蛋白的数量明显提升，荧光信号强度明显增强。
附图说明
图1为采用本发明的单克隆抗体标记方法标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图2为采用本发明的单克隆抗体标记方法(单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图3为采用试剂盒(赛默飞,Invitrogen,SiteClick R-PE Antibody LabelingKit)标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图4为采用本发明的单克隆抗体标记方法标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
图5为采用本发明的单克隆抗体标记方法(单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
图6为采用试剂盒(赛默飞,Invitrogen,SiteClick R-PE Antibody LabelingKit)标记的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
图7为采用本发明的单克隆抗体标记方法标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图8为采用本发明的单克隆抗体标记方法(单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图9为采用试剂盒(Abcam,PerCP Conjugation Kit–Lightning Kit)标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测散点图。
图10为采用本发明的单克隆抗体标记方法标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
图11为采用本发明的单克隆抗体标记方法(单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
图12为采用试剂盒(Abcam,PerCP Conjugation Kit–Lightning Kit)标记的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞的流式检测出峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1CD4[GK1.5]-PE的制备(采用本发明所述的单克隆抗体标记方法)
1.PE悬浊液预处理
(1)将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀。
(2)取0.5mgPE沉淀悬浊液放置于1.5mL离心管内，12000g离心5min，用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀。
(3)取100μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的PE沉淀，然后12000g离心5min，吸取PE上清溶液。
(4)选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，再加入400μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，12000g离心5min并除去滤出液，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作3次。
(5)收集脱盐后PE溶液定容到50μL，得到10mg/mL PE溶液。
2.PE巯基封闭反应
(1)将50mM NEM从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)向50μL PE(10mg/mL)中加入3.5μL 50mM NEM溶液(nPE:nNEM＝1:50)，25℃反应1.5h，使得NEM分子与PE分子中的游离巯基结合，封闭PE分子中的游离巯基。
3.PE-NEM与S-SMCC交联反应
(1)将S-SMCC(溶解度为10mM，母液溶于无菌纯水)从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)溶解50mg S-SMCC溶解于11.46mL无菌水内，配置成10mM母液(母液100μL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向每50μLPE-NEM(10mg/mL)溶液中加入6.69μL 10mg/mL S-SMCC溶液(nPE-NEM:nS-SMCC＝1:20)，25℃反应1.5h，使S-SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使蛋白中未反应S-SMCC残余量为蛋白总量的10-3倍以下，尽可能较多地稀释。
(5)收集脱盐后高浓度交联蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将蛋白溶液体积定容为40μL(10mg/mL)。
4.单克隆抗体(McAb)巯基化反应
(1)将2mg Sulfo-LC-SPDP溶解于200μL去离子水中，制备20mM的溶液。向120μgMcAb(2mg/mL)中加入1.5μL S-LC-SPDP，25℃反应1h，将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μLPBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μLPBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。将抗体体积定容为50μL(2mg/mL)。
(2)称取适量TCEP，按照1g TCEP溶解于6mL去离子水溶解TCEP，pH2.5，用10N NaOH调节pH至7.0，定容至7mL，得到0.5M TCEP(母液100μL/管分装保存于-20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向50μL抗体中加入2μLTCEP，TCEP终浓度约为20mM，25℃室温避光反应1.5h。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
(5)收集脱盐后高浓度巯基化单抗溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，以80％蛋白回收率预估抗体浓度，将抗体蛋白溶液体积定容为40μL(2mg/mL)，获得McAb-SH中间体。
5.PE与抗体交联反应
将步骤3与步骤4得到的PE交联蛋白和巯基化单抗溶液按照摩尔比nMcAb-SH:nNEM-PE-S-SMCC＝1:5比例混合均匀，40μL(2mg/mL)巯基化单抗内加入40μL(10mg/mL)S-SMCC交联NEM-PE，25℃避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积(8μL)的NEM(50mM)，25℃反应1.5h，反应后再加入8μL1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)溶液，定容至320μL，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4℃长期保存。
在进行流式检测时按照1:100将交联反应后的抗体溶液进行稀释后检测，检测反应体系为：流式缓冲液(PBS+0.5％FBS+0.2％EDTA)100μL，CD4-PE[GK1.5]终浓度为2.5μg/mL，CD8-FITC[53-6.72]终浓度为5μg/mL，小鼠(C57)脾细胞10^6cells；反应条件为：25℃水浴避光反应15min，流式缓冲液1mL清洗3次，定容500μL；设门方法：lymph+。
检测结果如图1所示，采用本实施例制备的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD8-淋巴细胞(Q4)区域占比69.1％，CD4+淋巴细胞(Q3)区域占比为21.0％，CD8+淋巴细胞(Q1)区域占比为9.73％，占比正常。
对比例1CD4[GK1.5]-PE的制备(采用本发明所述的单克隆抗体标记方法，但单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)
1.PE悬浊液预处理
(1)将试剂管中PE悬浊液用涡旋振荡器震荡混匀。
(2)取0.5mgPE沉淀悬浊液放置于1.5mL离心管内，12000g离心5min，用移液枪完全吸走上清液，注意不要吸走沉淀。
(3)取100μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液加入离心管内充分溶解离心管底部的PE沉淀，然后12000g离心5min，吸取PE上清溶液。
(4)选择50Kd超滤离心管，将PE上清溶液移至超滤管内，再加入400μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀，12000g离心5min并除去滤出液，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作3次。
(5)收集脱盐后PE溶液定容到50μL，得到10mg/mL PE溶液。
2.PE巯基封闭反应
(1)将50mM NEM从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)向50μL PE(10mg/mL)中加入3.5μL 50mM NEM溶液(nPE:nNEM＝1:50)，25℃反应1.5h，使得NEM分子与PE分子中的游离巯基结合，封闭PE分子中的游离巯基。
3.PE-NEM与S-SMCC交联反应
(1)将S-SMCC(溶解度为10mM，母液溶于无菌纯水)从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)溶解50mg S-SMCC溶解于11.46mL无菌水内，配置成10mM母液(母液100μL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向每50μLPE-NEM(10mg/mL)溶液中加入6.69μL 10mg/mL S-SMCC溶液(nPE-NEM:nS-SMCC＝1:20)，25℃反应1.5h，使S-SMCC分子中琥珀酰酯与PE分子中伯氨基反应结合。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使蛋白中未反应S-SMCC残余量为蛋白总量的10-3倍以下，尽可能较多地稀释。
(5)收集脱盐后高浓度交联蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将蛋白溶液体积定容为40μL(10mg/mL)。
4.单克隆抗体(McAb)巯基化反应
(1)称取适量TCEP，按照1g TCEP溶解于6mL去离子水溶解TCEP，pH2.5，用10N NaOH调节pH至7.0，定容至7mL，得到0.5M TCEP(母液100μL/管分装保存于-20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(2)向50μL抗体(2mg/mL)中加入2μL TCEP，TCEP终浓度约为20mM，25℃室温避光反应1.5h。
(3)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
(4)收集脱盐后高浓度巯基化单抗溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，以80％蛋白回收率预估抗体浓度，将抗体蛋白溶液体积定容为40μL(2mg/mL)，获得McAb-SH中间体。
5.PE与抗体交联反应
将步骤3与步骤4得到的PE交联蛋白和巯基化单抗溶液按照摩尔比nMcAb-SH:nNEM-PE-S-SMCC＝1:5比例混合均匀，40μL(2mg/mL)巯基化单抗内加入40μL(10mg/mL)S-SMCC交联NEM-PE，25℃避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积(8μL)的NEM(50mM)，25℃反应1.5h，反应后再加入8μL1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)溶液，定容至320μL，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4℃长期保存。
在进行流式检测时按照1:100将交联反应后的抗体溶液进行稀释后检测，检测反应体系为：流式缓冲液(PBS+0.5％FBS+0.2％EDTA)100μL，CD4-PE[GK1.5]终浓度为2.5μg/mL，CD8-FITC[53-6.72]终浓度为5μg/mL，小鼠(C57)脾细胞10^6cells；反应条件为：25℃水浴避光反应15min，流式缓冲液1mL清洗3次，定容500μL；设门方法：lymph+。
检测结果如图2所示，采用本对比例制备的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD8-淋巴细胞(Q4)区域占比67.2％，CD4+淋巴细胞(Q3)区域占比为22.1％，CD8+淋巴细胞(Q1)区域占比为10.7％，占比正常。
对比例2
本对比例标记方法采用试剂盒(赛默飞,Invitrogen,SiteClick R-PE AntibodyLabeling Kit)进行，标记完成后采用与本实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果如图3所示。
由图3可知，采用本对比例制备的CD4-PE[GK1.5]与CD8-FITC[53-6.72]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD8-淋巴细胞(Q4)区域占比68.4％，CD4+淋巴细胞(Q3)区域占比为19.2％，CD8+淋巴细胞(Q1)区域占比为12.3％，占比正常。
进一步对实施例1、对比例1-2的流式检测结果进行对比，结果如图4-6所示。
由图4-6可知，本发明所述的标记方法，采用Sulfo-LC-SPDP交联的荧光信号值(110442)明显高于不采用Sulfo-LC-SPDP交联的信号值(66250)，此外，采用本发明所述的标记方法的信号值，明显高于采用试剂盒(赛默飞,Invitrogen,SiteClick R-PE AntibodyLabeling Kit)标记的信号值(55184)。
实施例2CD4[GK1.5]-PERCP的制备(采用本发明所述的单克隆抗体标记方法)
1.PERCP巯基封闭反应
(1)将50mM NEM从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)向25μL PERCP(10mg/mL)中加入7.5μL 50mM NEM溶液(nPERCP:nNEM＝1:50)，25℃反应1.5h，使得NEM分子与PERCP分子中的游离巯基结合，封闭PERCP分子中的游离巯基。
2.PERCP-NEM与S-SMCC交联反应
(1)将S-SMCC(溶解度为10mM，母液溶于无菌纯水)从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)溶解50mg S-SMCC溶解于11.46mL无菌水内，配置成10mM母液(母液100μL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向每32.5μL PERCP-NEM(10mg/mL)溶液中加入13.75μL 10mg/mL S-SMCC溶液(nPERCP-NEM:nS-SMCC＝1:20)，25℃反应1.5h，使S-SMCC分子中琥珀酰酯与PERCP分子中伯氨基反应结合。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使蛋白中未反应S-SMCC残余量为蛋白总量的10-3倍以下，尽可能较多地稀释。
(5)收集脱盐后高浓度交联蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将蛋白溶液体积定容为32μL(7.2mg/mL)。
3.单克隆抗体(McAb)巯基化反应
(1)将2mg Sulfo-LC-SPDP溶解于200μL去离子水中，制备20mM的溶液。向120μgMcAb(2mg/mL)中加入1.5μL S-LC-SPDP，25℃反应1h，将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。将抗体体积定容为50μL(2mg/mL)。
(2)称取适量TCEP，按照1g TCEP溶解于6mL去离子水溶解TCEP，pH2.5，用10N NaOH调节pH至7.0，定容至7mL，得到0.5M TCEP(母液100μL/管分装保存于-20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向50μL抗体中加入2μL TCEP，TCEP终浓度约为20mM，25℃室温避光反应1.5h。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
(5)收集脱盐后高浓度巯基化单抗溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，以80％蛋白回收率预估抗体浓度，将抗体蛋白溶液体积定容为40μL(2mg/mL)，获得McAb-SH中间体。
4.PERCP与抗体交联反应
将步骤3与步骤4得到的PERCP交联蛋白和巯基化单抗溶液按照摩尔比nMcAb-SH:nNEM-PERCP-S-SMCC＝1:5比例混合均匀，40μL(2mg/mL)巯基化单抗内加入32μL(7.2mg/mL)S-SMCC交联NEM-PERCP，25℃避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积(8μL)的NEM(50mM)，25℃反应1.5h，反应后再加入8μL 1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)溶液，定容至320μL，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4℃长期保存。
在进行流式检测时按照1:100将交联反应后的抗体溶液进行稀释后检测，检测反应体系为：流式缓冲液(PBS+0.5％FBS+0.2％EDTA)100μL，CD4-PERCP[GK1.5]终浓度为2.5μg/mL，CD3-FITC[145-2C11]终浓度为5μg/mL，小鼠(C57)脾细胞10^6cells；反应条件为：25℃水浴避光反应15min，流式缓冲液1mL清洗3次，定容500μL；设门方法：lymph+。
检测结果如图7所示，采用本实施例制备的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD3-淋巴细胞(Q4)区域占比68.5％，CD4+淋巴细胞(Q2)区域占比为16.8％，CD3+淋巴细胞(Q2+Q3)区域占比为30.6％，占比正常。
对比例3 CD4[GK1.5]-PERCP的制备(采用本发明所述的单克隆抗体标记方法，但单克隆抗体未与Sulfo-LC-SPDP进行交联反应)
1.PERCP巯基封闭反应
(1)将50mM NEM从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)向25μL PERCP(10mg/mL)中加入7.5μL 50mM NEM溶液(nPERCP:nNEM＝1:50)，25℃反应1.5h，使得NEM分子与PERCP分子中的游离巯基结合，封闭PERCP分子中的游离巯基。
2.PERCP-NEM与S-SMCC交联反应
(1)将S-SMCC(溶解度为10mM，母液溶于无菌纯水)从低温状态下拿出后放置于室温环境中，待瓶子温度平衡至室温时再将瓶盖打开，以免瓶子内出现冷凝水。
(2)溶解50mg S-SMCC溶解于11.46mL无菌水内，配置成10mM母液(母液100μL/管分装保存于-20℃)，该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(3)向每32.5μL PERCP-NEM(10mg/mL)溶液中加入13.75μL 10mg/mL S-SMCC溶液(nPERCP-NEM:nS-SMCC＝1:20)，25℃反应1.5h，使S-SMCC分子中琥珀酰酯与PERCP分子中伯氨基反应结合。
(4)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次，通过脱盐使蛋白中未反应S-SMCC残余量为蛋白总量的10-3倍以下，尽可能较多地稀释。
(5)收集脱盐后高浓度交联蛋白溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，将蛋白溶液体积定容为32μL(7.2mg/mL)。
3.单克隆抗体(McAb)巯基化反应
(1)称取适量TCEP，按照1g TCEP溶解于6mL去离子水溶解TCEP，pH2.5，用10N NaOH调节pH至7.0，定容至7mL，得到0.5M TCEP(母液100μL/管分装保存于-20℃)。该试剂使用时每次新融化一支，不要反复冻融使用，使用后剩余试剂请丢弃。
(2)向50μL抗体(2mg/mL)中加入2μL TCEP，TCEP终浓度约为20mM，25℃室温避光反应1.5h。
(3)将反应完成后的溶液移至超滤离心管内，再加入500μL PBS(含有0.25mMEDTA)缓冲液，12000g离心5min并除去滤液，再加入500μL PBS(含有0.25mM EDTA)缓冲液混匀离心，重复此操作5次。
(4)收集脱盐后高浓度巯基化单抗溶液，可用移液器量取收集的溶液体积，以80％蛋白回收率预估抗体浓度，将抗体蛋白溶液体积定容为40μL(2mg/mL)，获得McAb-SH中间体。
4.PERCP与抗体交联反应
将步骤3与步骤4得到的PERCP交联蛋白和巯基化单抗溶液按照摩尔比nMcAb-SH:nNEM-PERCP-S-SMCC＝1:5比例混合均匀，40μL(2mg/mL)巯基化单抗内加入32μL(7.2mg/mL)S-SMCC交联NEM-PERCP，25℃避光反应3h，然后向反应体系内加入1/10体积(8μL)的NEM(50mM)，25℃反应1.5h，反应后再加入8μL 1M Cys溶液并混合均匀，然后放置于4℃过夜反应。反应完成后向反应体系内加入适量PBS(含有0.1％叠氮化钠，0.1％明胶)溶液，定容至320μL，使抗体终浓度为0.25mg/mL，操作完成后将抗体放置于4℃长期保存。
在进行流式检测时按照1:100将交联反应后的抗体溶液进行稀释后检测，检测反应体系为：流式缓冲液(PBS+0.5％FBS+0.2％EDTA)100μL，CD4-PERCP[GK1.5]终浓度为2.5μg/mL，CD3-FITC[145-2C11]终浓度为5μg/mL，小鼠(C57)脾细胞10^6cells；反应条件为：25℃水浴避光反应15min，流式缓冲液1mL清洗3次，定容500μL；设门方法：lymph+。
检测结果如图8所示，采用本对比例制备的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD3-淋巴细胞(Q4)区域占比70.8％，CD4+淋巴细胞(Q2)区域占比为16.9％，CD3+淋巴细胞(Q2+Q3)区域占比为28.5％，占比正常。
对比例4
本对比例标记方法采用试剂盒(Abcam,PerCP Conjugation Kit–Lightning Kit)进行，标记完成后采用与本实施例1相同的方法进行流式检测，检测结果如图3所示。
由图9可知，采用本对比例制备的CD4-PERCP[GK1.5]与CD3-FITC[145-2C11]共染小鼠(C57)脾细胞时，出现了明显的细胞分群，且阴性细胞群CD4-CD3-淋巴细胞(Q4)区域占比69.3％，CD4+淋巴细胞(Q2)区域占比为17.5％，CD3+淋巴细胞(Q2+Q3)区域占比为30.3％，占比正常。
进一步对实施例2、对比例3-4的流式检测结果进行对比，结果如图10-12所示。
由图10-12可知，本发明所述的标记方法，采用Sulfo-LC-SPDP交联的PERCP荧光信号值(9025)明显高于不采用Sulfo-LC-SPDP交联的信号值(6655)，此外，采用本发明所述的标记方法的信号值，明显高于采用试剂盒(Abcam,PerCP Conjugation Kit–LightningKit)标记的信号值(4228)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
