一种抗IgM单克隆抗体
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗IgM单克隆抗体。
背景技术
酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是一类常用的免疫酶技术。主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，得到定性或定量的结果。根据待测物不同(检测抗原或者检测抗体)以及测定原理的不同，ELISA又可以分为许多种类，如直接法、间接法、竞争法、夹心法等。
通过ELISA检测人血清中病原体特异性的IgM抗体，对于传染病感染者的临床早期诊断以及对整个传染病疫情的整体控制具有意义。在人体血清中IgM抗体的含量为0.6-2.0mg/ml，只占血清抗体总量的6-10％，比IgG、IgA的含量都低，并且IgM分子比较庞大，是以五聚体的形式存在的，因此检测IgM比检测IgG和IgA更为困难。现有技术中一般采用间接ELISA检测病原体特异性IgM抗体，其操作通常是把待检血清稀释后与包被在酶标板上的抗原结合，经洗涤后，加入酶标的抗人IgM二抗并利用底物显色。但是，由于血清中IgM含量比IgG、IgA低，且IgM分子比IgG、IgA大，IgM在与IgG、IgA竞争性结合酶标板上的抗原过程中处于劣势，检测结果的敏感性一般比较低。此外，用间接ELISA检测IgM抗体时，其使用酶标二抗大多为多抗(同时含有抗人IgM重轻链的抗体)，检测结果通常会存在较高的假阳性或者较高的背景。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗人IgM单克隆抗体及其制备方法，其可专一性捕获人IgM抗体，便于酶标抗原的结合，增加检测IgM的特异性，降低整个系统的背景。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗IgM单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：
分别如SEQ ID NO.26、28、30所示氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3；以及分别如SEQ ID NO.42、44、46所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。
进一步，所述重链可变区还包含：
如SEQ ID NO.32、34、36、38所示氨基酸序列的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；以及分别如SEQ ID NO.48、50、52、54所示氨基酸序列的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
进一步，所述重链可变区具有如SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.56所示的氨基酸序列。
进一步，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核苷酸序列。本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。
进一步，编码重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.27、29、31所示；编码轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.43、45、47所示。
进一步，编码重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列如SEQ IDNO.33、35、37、39所示；编码轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列如SEQ IDNO.49、51、53、55所示；
进一步，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。本发明对载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子，或包含本发明第三方面所述的载体。
本发明中的用于导入载体的细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK(人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。
本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。
本发明的第五方面提供了一种检测样品中IgM的方法，所述方法包括以下步骤：
1)使所述样品与第一特异性结合剂和第二特异性结合剂接触，其中，所述第一特异性结合剂为本发明第一方面所述的单克隆抗体；在足以形成第一特异性结合剂-IgM-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和
2)检测在1)中形成的复合体，从而检测所述样品中的IgM；
进一步，使用第一特异性结合剂包被酶标板。
进一步，所述第二特异性结合剂为抗原。
进一步，所述第二特异性结合剂被可检测的标记；所述标记为本领域的常规标记，包括但不限于荧光染料，如荧光素类型标记FITC，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；罗丹明类型的标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物等；发光染料，如化学发光染料鲁米诺，吖啶化合物，腔肠素和类似物，二氧杂环丁烷，基于过氧草酸的系统及其衍生物；电化学发光染料如基于钌和铱的电化学发光络合物；放射性标记如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi；金属螯合物。
本发明的第六方面提供了一种检测IgM的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的单克隆抗体。
作为一种可选择的实施方式，所述产品为试剂盒；所述试剂盒包括本发明所制备的抗体。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的试剂盒包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由(但并不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。
作为一种可选择的实施方式，所述产品为芯片，所述芯片包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的上述单克隆抗体或其片段。
在本发明中，用于检测或测定IgM的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体在免疫检测中的应用。免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
作为一种可选择的实施方式，本发明的单克隆可抗体可用于病毒的检测。检测方法如下：
1)使待测样品与第一特异性结合剂和第二特异性结合剂接触，其中，所述第一特异性结合剂为本发明第一方面所述的单克隆抗体；在足以形成第一特异性结合剂-IgM-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和
2)检测在1)中形成的复合体，从而检测所述样品中的IgM。
优选的，使用第一特异性结合剂包被酶标板，使用待检测病毒抗原作为第二特异性结合剂。
更为优选的，所述第二特异性结合剂被可检测的标记。
在本发明的具体实施方式中，所述可检测的标记为HRP标记。
在本发明中，术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区(区域也称为"域")。轻链和重链可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为"互补决定区"(CDR)。CDR主要负责结合到抗原的表位。各链的CDR通常为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，通常也用特定CDR所处的链标识。
本发明的单克隆抗体还包括该抗体的功能性变异体，所述功能性变异体可结合至IgM。
具体地，如果功能性变异体包括(但并不限于)：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。
可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至IgM。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对IgM可具有升高或降低的结合亲和力。
本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述抗IgM抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。抗IgM抗体之氨基酸序列变体是由向抗IgM抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括(例如)抗IgM抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变抗IgM抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。
优选的，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变和定点诱变)改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。
在本发明中，术语“样品”或“测试样品”在本文可互换使用，所述样品是体外样品，其将在体外进行分析，且不转移回体内。样品的实例包括但不限于流体样品，例如血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液和淋巴液，或固体样品，例如组织提取物、软骨、骨、滑膜和结缔组织。在一个实施方案中，样品选自血液、血清、血浆、滑液和尿。在一个实施方案中，样品选自血液、血清和血浆。在一个实施方案中，样品是血清或血浆。
如本文所用的术语“参考样品”是指以与测试样品基本相同的方式进行分析并且其信息与测试样品的信息进行比较的样品。因此，参考样品提供了一种标准，其允许评价从测试样品获得的信息。参考样品可以来自健康或正常组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态与测试样品的状态之间的差异可能为疾病发展的风险或这种疾病或病症的存在或进一步进展的征兆。参考样品可以来自异常或患病的组织、器官或个体，从而提供了组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态与测试样品的状态之间的差异可能为疾病发展的降低的风险或这种疾病或病症的不存在或改善的征兆。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种抗人IgM单克隆抗体，所述抗体用于检测IgM，可以降低整个反应体系的背景和放大特异性结合的信号，具有较高的灵敏性和特异性。
附图说明
图1是鉴定7株小鼠抗人IgM的结合特异性的免疫转印图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1小鼠抗人IgM单克隆抗体的制备
1、Balb/c小鼠免疫
商品化人IgM抗体(sigma-aldrich公司)免疫5周龄雌性Balb/c小鼠(100μg/只)，首次免疫时100μg抗原与等体积的福氏完全佐剂混合腹腔注射；第3周后用等量抗原与福氏不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。
2、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，把5.0×107骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。
把等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，尽可能去除上清液。在1.5分钟内加入1.5ml的50％的PEG，边加边摇匀；然后在8.5分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。
把经PEG融合的细胞1000rpm离心5分钟，除去上清液，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养4天，每孔补加100μl选择培养基。
3、杂交瘤细胞的筛选和克隆
融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有人IgM的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育1.0小时，洗5次。稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠1:4000，每孔加50μl，室温孵育0.5小时；洗涤5次。每孔加入100μl HRP底物(H2O2+TMB)，室温孵育10分钟，每孔加入50μl 0.5M H2SO4，测A450nm值。
收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次亚克隆培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。一共获得抗人IgG单克隆抗体7株，分别命名为0035、0036、0037、0038、0039、0040、0041。
4、单克隆抗体的制备
大量培养杂交瘤细胞，分别注射BALB/c小鼠腹腔，2周后收集小鼠腹水，用ProteinG亲和层析柱纯化，透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存备用。
5、小鼠抗人IgM单克隆抗体的鉴定
5.1免疫转印
人IgM抗体蛋白经过变性、还原处理后，行SDS-PAGE，转NC膜，分别用上述的7株单抗与之杂交，检测结合情况。
5.2抗人IgM单克隆抗体作为捕获抗体的可行性(MAC-ELISA)
抗人IgM(重链特异性)单克隆抗体共四株，分别为0035、0036、0038、0041。分别把这四株单抗蛋白包被酶标板(COSTAR)，200ng/孔。以测试感染新布尼亚病毒(SFTSV)人急性期血清中特异性IgM抗体为例：把新布尼亚病毒感染的人急性期血清(3份)、正常人血清(1份)各10μl，分别与90μl 5％牛奶(5g脱脂奶粉溶于100ml的PBS中)混合后，分别加入包被有0035、0036、0038、0041单抗的酶标板中，置于37℃中孵育30分钟。洗涤5次后，加入新布尼亚病毒重组NP抗原-HRP 100μl(1:2000)，置于37C中孵育30分钟。洗涤5次后，加入底物100μl/孔，置于室温作用5分钟后，加入终止液50μl/孔，读值450nm。
5.3单克隆抗体0038重、轻链同种型的鉴定
使用Southern biotech公司SBA Clonotyping system-HRP产品，根据厂家提供的操作说明书进行。
5.4单克隆抗体0038重轻链可变区核酸序列的测定
取对数生长期的0038杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。表1和表2分别为扩增重轻链可变区基因的引物。
表1扩增杂交瘤重链可变区基因引物
注：a.MHV表示小鼠重链可变区域基因的先导序列杂交引物
b.MHCG表示与小鼠γ恒定区基因杂交的引物
表2扩增杂交瘤轻链可变区基因引物
注：a.MKV是小鼠κ链可变区域基因的先导序列杂交引物
b.MKC表示与小鼠κ恒定区基因杂交的引物
6、结果
免疫转印结果显示(图1)，4株与人IgM重链结合(0035、0036、0038、0041)，有3株与人IgM轻链结合(0037、0039、0040)。
抗人IgM单克隆抗体作为捕获抗体检测SFTSV人急性期血清中IgM具有较好的效果，其中0038号单克隆抗体较其它单克隆抗体更适合作为MAC-ELISA体系中的捕获抗体。
表3单克隆抗体作为捕获抗体检测SFTSV人急性期血清中IgM
单克隆抗体0070重、轻链同种型的鉴定结果显示，0070单克隆抗体重轻链同种型分别为γ1和κ。
测序结果显示，只有引物MHV7(26-mer)/MHCG1(21-mer)组合(SEQ ID NO.7/SEQID NO.13)能够扩增出0038号单克隆抗体的重链可变区，只有引物MKV5(30-mer)/MKC(20-mer)组合(SEQ ID NO.18/SEQ ID NO.25)能够扩增出0038号单克隆抗体的轻链可变区。单克隆抗体的氨基酸序如表4所示。
表4单克隆抗体的序列
实施例2单克隆抗体的应用
一、人感染尼亚病毒(SFTSV)IgM抗体检测
1、10μl新布尼亚病毒感染者急性期血清(共20份)与90μl样品稀释液混合后，加入酶标板中(包被有0038单抗蛋白，200ng/孔)，同时设阳性和阴性对照，将酶标板用封板膜封闭，置37℃孵箱中孵育30分钟。
2、取出酶标板置于洗板机上用洗液洗涤5次后，甩干孔内残留液或倒扣酶标反应板在吸水纸上拍去孔内残留液。
3、于各孔中加入新布尼亚病毒重组NP抗原-HRP100μl/孔，置37℃孵箱中孵育30分钟。
4、重复步骤2。
5、将显色液A、B液按1:1混合后取混合显色液每孔加100μl，轻拍酶标反应板，混匀后置室温5分钟。
6、于各孔中加入终止液50μl/孔，轻拍混匀。
7、将酶标板置于酶标仪450nm波长下，测定各孔光吸收OD值。
8、临界值(Cutoff)计算：Cutoff﹦0.748×阴性对照复孔OD平均值+0.146，结果判断：待检标本OD值＞Cutoff为阳性，待检标本OD值＜Cutoff为阴性。
9、结果
结果如表5所示，Cutoff﹦0.22，表明在此检测体系下，20份阳性血清均显示IgM阳性。
表5 SFTSV急性期病人IgM抗体检测结果
二、人感染恙虫病立克次氏体(Rickettsia tsutsugamushi)IgM抗体检测
1、10μl恙虫病感染者急性期血清(共25份)与90μl样品稀释液混合后，加入酶标板中(包被有0038单抗蛋白，200ng/孔)，同时设阳性和阴性对照，将酶标板用封板膜封闭，置37℃孵箱中孵育30分钟。
2、取出酶标板置于洗板机上用洗液洗涤5次后，甩干孔内残留液或倒扣酶标反应板在吸水纸上拍去孔内残留液。
3、于各孔中加入恙虫病立克次氏体56KDa-HRP 100μl/孔(1:2000)，置37℃孵箱中孵育30分钟。
4、重复方法2。
5、将显色液A、B液按1:1混合后取混合显色液每孔加100μl，轻拍酶标反应板，混匀后置室温5分钟。
6、于各孔中加入终止液50μl/孔，轻拍混匀。
7、将酶标板置于酶标仪450nm波长下，测定各孔光吸收OD值。
8、临界值(Cutoff)计算：Cutoff﹦0.748×阴性对照复孔OD平均值+0.146，结果判断：待检标本OD值＞Cutoff为阳性，待检标本OD值＜Cutoff为阴性。
9、结果
结果如表6所示，Cutoff﹦0.208，表明在此检测体系下，25份阳性血清均显示IgM阳性。
表6恙虫病急性期病人IgM抗体检测结果
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>南京妙迪生物科技有限公司
<120>一种抗IgM单克隆抗体
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atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 30
<210>17
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>17
atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 33
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>18
atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 30
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>19
atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg27
<210>20
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>20
atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 31
<210>21
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>21
atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g 31
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>22
atggtrtccw casctcagtt ccttg25
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>23
atgtatatat gtttgttgtc tatttct27
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>24
atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>25
actggatggt gggaagatgg20
<210>26
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>26
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>27
ggctacacat tcagtagtta ctgg 24
<210>28
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>28
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser
1 5
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>29
attttacctg gaagtggtag tagt 24
<210>30
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>30
Ala Arg Leu Glu Gly Arg Gly Phe Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210>31
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>31
gcaagattgg aaggccgggg tttttattat gttatggact ac 42
<210>32
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr
2025
<210>33
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>33
caggttcagc tgcagcagtc tggagcagag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata60
tcctgcaagg ctact 75
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>34
Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 1015
Glu
<210>35
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>35
atagagtggg taaagcagag gcctggacat ggccttgagt ggattggaga g 51
<210>36
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>36
Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr
1 5 1015
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
202530
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210>37
<211>114
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>37
aactacaatg agaggttcaa gggcagggcc acattcactg cagatacatc ctccaacaca60
gcctacatgc aactcagtag tctgacatct gaggactctg ccgtctatta ctgt 114
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>38
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>39
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>39
tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tca 33
<210>40
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
202530
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
505560
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65707580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Leu Glu Gly Arg Gly Phe Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>41
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>41
caggttcagc tgcagcagtc tggagcagag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agttactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tagtaactac 180
aatgagaggt tcaagggcag ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gtagtctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagattggaa 300
ggccggggtt tttattatgt tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>42
Ser Ser Val Arg Tyr
1 5
<210>43
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>43
tcaagtgtac gttac 15
<210>44
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>44
Ser Thr Ser
1
<210>45
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>45
agcacatcc 9
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>46
Gln Gln Arg Ser Ser Ser Pro Pro Thr
1 5
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>47
cagcaaagga gtagttcccc acccacg27
<210>48
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>48
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 1015
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
2025
<210>49
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>49
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcgt ctccagggga gaaggtcacc60
ataacctgca gtgccagt78
<210>50
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>50
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 1015
Tyr
<210>51
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>51
atgcactggt tccagcagaa gccaggcact tctcccaaac tctggattta t 51
<210>52
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>52
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 1015
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
202530
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210>53
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>53
aacctggctt ctggagtccc tggtcgcttc agtggcagtg gatctgggac ctcttactct60
ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgc108
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>54
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210>55
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>55
ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 30
<210>56
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>56
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 1015
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met
202530
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
354045
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
505560
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65707580
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Ser Pro Pro Thr
859095
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210>57
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>57
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcgt ctccagggga gaaggtcacc60
ataacctgca gtgccagttc aagtgtacgt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120
acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctggtcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttccc cacccacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
