一种基于量子点标记的检测试纸条及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，尤其是涉及一种基于量子点标记的沙门氏菌检测试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
食源性疾病已成为全球性的公共卫生问题，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病发病率最高，对人类健康造成了巨大威胁。根据《国家卫计委关于2015年全国食物中毒事件情况的通报》，微生物性食物中毒人数最多，占全年食物中毒总人数的53.7％。我国每年约有3亿人因沙门氏菌而患病，占病原菌食源性疾病总致病的70-80％。由食源性致病菌引起的食物中毒事件，无论是发达国家还是发展中国家，其报道均屡见不鲜。其中，沙门氏菌已经成为世界范围内引起人类感染、食品污染和细菌性食物中毒的重要食源性致病菌。然而，传统的食源性致病菌检测方法在检测时间、灵敏度和特异性上存在一定的缺陷，不能满足日益严格的检测需要。因此，发展更为快捷，方便、灵敏度高和特异性好的检测方法对保障食品安全具有重要意义。
核酸适配体(Aptamer)是从体外筛选得到的一类能与相应配体专一性紧密结合的单链寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列形成的高级结构能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比，适配体的靶分子范围广，体外筛选，易人工合成和修饰，分子较小，稳定性好，对温度不敏感，容易保存，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。
近年来，新型纳米材料在分析检测中的快速发展受到越来越多的科研工作者的青睐，并涌现出了很多具有优秀特性的纳米材料。磁性纳米材料依靠其优异的性能以及独特的结构，被广泛的应用于食品安全检测以及生物医学检测等领域。磁性纳米材料在食源性致病菌的分离富集中，也有广泛的应用。食品中污染的食源性致病菌，数量通常比较少，常规的分析方法通常无法进行快速，高效的检测。经过功能化和生物学修饰的磁性纳米材料，可以很好的识别通常难以检测出来的致病菌，并且可以在外加磁场的作用下，对食品中少量的食源性致病菌进行富集分离。量子点(quantum dots，QD)是由有限个数目的原子组成的一种三维团簇，其3个维度的尺寸均属于纳米级别。其尺寸一般在1～10nm之间，小粒径使得电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，在激发光的照射下发射出荧光，并且可以通过调控量子点的大小改变其光吸收和发射特性。宽波长激发窄波长发射、较高的荧光量子产率、良好的生物相容性使得量子点引起了生命科学领域研究者的广泛兴趣，使其在生物医学成像、药物筛选、光动力学疗法、生物传感器等众多领域应用广泛。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种基于量子点标记的沙门氏菌检测试纸条及其制备方法与应用。本发明方法操作简便，流程简单，可以用于口岸单位针对沙门氏菌检测的现场快速筛查。
本发明的技术方案如下：
一种基于量子点标记的试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜NC膜、吸水纸及背板，NC膜粘贴在背板上，样品垫与吸水纸分别粘贴于NC膜两端，并与NC膜边缘重合2-4mm，所述NC膜上有检测线T线及质控线C线，所述T线与C线间隔5mm，所述T线喷涂有链霉亲和素与生物素修饰适配体互补链的结合物，所述C线喷涂有链霉亲和素与生物素修饰Poly A的结合物。
所述的试纸条的制备方法，具体制备方法如下所示：
S1：首先将NC膜贴在背板上，然后分别将样品垫及吸水纸贴在NC膜上下两侧，覆盖住NC膜边缘约2-4mm；
S2：取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素SA溶液，加入生物素修饰适配体互补链得到结合物溶液1；取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素SA溶液，加入生物素修饰Poly A得到结合物溶液2，分别将溶液1和溶液2于摇床中37℃、180RPM孵育过夜，利用BioDot XYZ 3050三维喷点仪将孵育好的结合物溶液1和结合物溶液2分别以1.0μL/cm喷涂量喷涂在NC膜的T线和C线上，得到喷涂好的试纸；
S3：将步骤S2中喷涂好的试纸在37℃条件下烘2h，使T线及C线固定于NC膜上，最后利用切条机将试纸裁切为4mm宽的试纸条，并放置于4℃冰箱备用。
S2中溶液1的浓度为：0.15-0.3μM；溶液2的浓度为：0.15-0.3μM。
一种基于量子点标记的检测试纸条在检测沙门氏菌中的应用。
具体的应用方法如下：
步骤1：取30μL待测样品与50μL信号探针混合，并在37℃、180RPM振荡孵育2.5h后得到混合液，之后取30μL混合液滴加在样品垫上，15min后使用50μL重悬缓冲液进行冲洗，紫外灯箱下观察结果。
所述的信号探针通过以下方法制备得到：
取ZnS:Mn量子点溶液，加入4μL的100μM沙门氏菌氨基适配体溶液并混合得到混合液，并将混合液避光置于37℃摇床中，180RPM振荡孵育16h，待孵育完毕后，将其在4℃、8000r/min离心机中离心3min，去除未连接适配体，并将沉淀物重新分散于重悬缓冲液中，避光4℃保存备用，即得所述信号探针。
所述重悬缓冲液为PBS缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.4，其中组份包括0.5％PEG、0.25％吐温-20、5％蔗糖、0.02％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4。
所述ZnS:Mn量子点溶液的浓度为5-10mg/mL；所述ZnS:Mn量子点与沙门氏菌氨基适配体质量摩尔比1.25-2.5×107g/mol。
本发明通过将ZnS:Mn量子点与沙门氏菌适配体(适配体含有Poly T序列)偶联作为信号探针，信号探针与待测溶液孵育后滴加在样品垫上时，由于吸水纸造成的毛细管力作用，由样品垫流经NC膜向吸水纸迁移。当待测样品中不含沙门氏菌时，信号探针处于空载状态，流经NC膜时首先和T线的互补序列结合，余下信号探针与C线Poly A相结合。检测完成后用紫外灯箱观察，T线与C线均显示荧光。当样品中含有沙门氏菌时，信号探针首先与菌相结合，流经T线时不与互补链结合，流经C线时，仍与C线结合。紫外灯箱下观察，C线有荧光，T线根据样品中菌的浓度荧光消失或减弱
本发明有益的技术效果在于：
本发明利用ZnS:Mn量子点作为信号分子，连接沙门氏菌适配体后成为信号探针，将信号探针与沙门氏菌进行孵育，利用试纸条的侧向层析原理，实现对沙门氏菌的检测，并用于猪肉试剂样品检测。该方法最低可视检测限在1.86×103CFU/mL，对试纸条T线与C线相对荧光强度以及菌液的浓度的对数值进行标准曲线的绘制，得出试纸条在1.86×102CFU/mL至1.86×106CFU/mL范围内线性良好。
1，该方法操作简便，流程简单，可以用于口岸单位针对沙门氏菌检测的现场快速筛查。
2，利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确性。
3，利用适配体与抗体相比较，具有可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本低、批次间差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。
4，利用高荧光量子产率的量子点，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1：基于量子点标记的沙门氏菌检测试纸条原理图。
图2：实施例1中ZnS:Mn量子点的吸收光谱(a)；ZnS:Mn量子点的发射光谱(254nm激发)以及在紫外灯箱下的观察效果(内插图)(b)。
图3：实施例1中偶联前后上清液中适配体浓度(Apt 0：偶联前上清液；Apt1：偶联后上清液)(a)；信号探针探针通过nanodrop扫描的紫外光谱(QDs-Apt：量子点-适配体探针，QDs：ZnS:Mn量子点)(b)。
图4：测试例1中不同浓度鼠伤寒沙门氏菌菌液试纸条检测结果。
图5：测试例1中不同浓度鼠伤寒沙门氏菌试纸条检测结果荧光强度曲线(a)；T线与C线相对荧光强度与菌液浓度对数值的标准曲线(b)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：
试纸条的制备：
S1：首先将NC膜贴在背板上，然后分别将样品垫及吸水纸贴在NC膜上下两侧，覆盖住NC膜边缘约2mm；
S2：取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰适配体互补链得到溶液1；取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰Poly A得到溶液2，将溶液1和溶液2分别置于摇床中37℃、180RPM孵育过夜，利用BioDot XYZ 3050三维喷点仪将孵育好的结合物溶液1和结合物溶液2分别以1.0μL/cm喷涂量喷涂在NC膜的T线和C线上，得到喷涂好的试纸；
S3：将步骤S2中喷涂好的试纸在37℃条件下烘2h，使T线及C线固定于NC膜上，最后利用切条机将试纸裁切为4mm宽的试纸条，并放置于4℃冰箱备用。
信号探针的制备：
取ZnS:Mn量子点溶液，加入4μL的100μM沙门氏菌氨基适配体溶液并混合得到混合液，并将混合液避光置于37℃摇床中，180RPM振荡孵育16h，待孵育完毕后，将其在4℃、8000r/min离心机中离心3min，去除未连接适配体，并将沉淀物重新分散于重悬缓冲液中，避光4℃保存备用，即得所述信号探针。
实施例2
试纸条的制备：
S1：首先将NC膜贴在背板上，然后分别将样品垫及吸水纸贴在NC膜上下两侧，覆盖住NC膜边缘约3mm；
S2：取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰适配体互补链得到溶液1；取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰Poly A得到溶液2，将溶液1和溶液2分别置于摇床中37℃、180RPM孵育过夜，利用BioDot XYZ 3050三维喷点仪将孵育好的结合物溶液1和结合物溶液2分别以1.0μL/cm喷涂量喷涂在NC膜的T线和C线上，得到喷涂好的试纸；
S3：将步骤S2中喷涂好的试纸在37℃条件下烘2h，使T线及C线固定于NC膜上，最后利用切条机将试纸裁切为4mm宽的试纸条，并放置于4℃冰箱备用。
信号探针的制备：
取ZnS:Mn量子点溶液，加入4μL的100μM沙门氏菌氨基适配体溶液并混合得到混合液，并将混合液避光置于37℃摇床中，180RPM振荡孵育16h，待孵育完毕后，将其在4℃、8000r/min离心机中离心3min，去除未连接适配体，并将沉淀物重新分散于重悬缓冲液中，避光4℃保存备用，即得所述信号探针。
实施例3
试纸条的制备：
S1：首先将NC膜贴在背板上，然后分别将样品垫及吸水纸贴在NC膜上下两侧，覆盖住NC膜边缘约4mm；
S2：取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰适配体互补链得到溶液1；取50μL 0.125mg/mL链霉亲和素(SA)溶液，加入生物素修饰Poly A得到溶液2，将溶液1和溶液2分别置于摇床中37℃、180RPM孵育过夜，利用BioDot XYZ 3050三维喷点仪将孵育好的结合物溶液1和结合物溶液2分别以1.0μL/cm喷涂量喷涂在NC膜的T线和C线上，得到喷涂好的试纸；
S3：将步骤S2中喷涂好的试纸在37℃条件下烘2h，使T线及C线固定于NC膜上，最后利用切条机将试纸裁切为4mm宽的试纸条，并放置于4℃冰箱备用。
信号探针的制备：
取ZnS:Mn量子点溶液，加入4μL的100μM沙门氏菌氨基适配体溶液并混合得到混合液，并将混合液避光置于37℃摇床中，180RPM振荡孵育16h，待孵育完毕后，将其在4℃、8000r/min离心机中离心3min，去除未连接适配体，并将沉淀物重新分散于重悬缓冲液中，避光4℃保存备用，即得所述信号探针。
测试例1
市售猪肉样本空白样品加标回收实验：猪肉糜购自无锡欧尚超市雪浪店。称取25g猪肉糜，加入225mL PBS缓冲液捣碎，离心取上清液121℃灭菌20min，制成样品溶液。鼠伤寒沙门氏菌在LB液体培养基中培养至酶标仪测得OD 0.2，取1mL菌液，5000r/min离心5min，除去多余的培养基，用PBS缓冲液洗涤两次，取100μL菌液加入900μL灭菌样品溶液。用缓冲液对菌液进行10倍梯度稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL。
取实施例1中制备的50μL制备好的信号探针，分别加入30μL上述PBS缓冲液稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL浓度的样品溶液，放入37℃摇床180RPM孵育2.5h。取30μL探针与样品溶液混合液，分别滴加在实施例1制备得到的试纸条的样品垫上，15min后使用50μL重悬缓冲液进行冲洗，紫外灯箱下观察结果结果见图4，结果如下表1所述。结果表明与加入的菌液浓度对比，得到回收率在96％-121％之间，说明该方法具有良好的准确性。
表1市售猪肉加标回收结果
测试例2
市售猪肉样本空白样品加标回收实验：猪肉糜购自无锡欧尚超市雪浪店。称取25g猪肉糜，加入225mL PBS缓冲液捣碎，离心取上清液121℃灭菌20min，制成样品溶液。鼠伤寒沙门氏菌在LB液体培养基中培养至酶标仪测得OD 0.2，取1mL菌液，5000r/min离心5min，除去多余的培养基，用PBS缓冲液洗涤两次，取100μL菌液加入900μL灭菌样品溶液。用缓冲液对菌液进行10倍梯度稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL。
取实施例1中制备的50μL制备好的信号探针，分别加入30μL上述PBS缓冲液稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL浓度的样品溶液，放入37℃摇床180RPM孵育2.5h。取30μL探针与样品溶液混合液，分别滴加在实施例1制备得到的试纸条的样品垫上，15min后使用50μL重悬缓冲液进行冲洗，紫外灯箱下观察结果，结果如下表2所述。结果表明与加入的菌液浓度对比，得到回收率在91％-116％之间，说明该方法具有良好的准确性。
表2市售猪肉加标回收结果
测试例3
市售猪肉样本空白样品加标回收实验：猪肉糜购自无锡欧尚超市雪浪店。称取25g猪肉糜，加入225mL PBS缓冲液捣碎，离心取上清液121℃灭菌20min，制成样品溶液。鼠伤寒沙门氏菌在LB液体培养基中培养至酶标仪测得OD 0.2，取1mL菌液，5000r/min离心5min，除去多余的培养基，用PBS缓冲液洗涤两次，取100μL菌液加入900μL灭菌样品溶液。用缓冲液对菌液进行10倍梯度稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL。
取实施例1中制备的50μL制备好的信号探针，分别加入30μL上述PBS缓冲液稀释至1.86×105、1.86×104、1.86×103CFU/mL浓度的样品溶液，放入37℃摇床180RPM孵育2.5h。取30μL探针与样品溶液混合液，分别滴加在实施例1制备得到的试纸条的样品垫上，15min后使用50μL重悬缓冲液进行冲洗，紫外灯箱下观察，结果如下表3所述。结果表明与加入的菌液浓度对比，得到回收率在98％-106％之间，说明该方法具有良好的准确性。
表3市售猪肉加标回收结果
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
