一种用于识别磷脂酰胆碱链长异构体的质谱分析方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于识别磷脂酰胆碱链长异构体的质谱分析方法。
背景技术
磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)，由甘油、脂肪酸(二分子)、磷酸和胆碱失水缩合而成的脂(图1)，分子中的脂肪酸链有饱和与不饱和两种，是非极性的疏水尾；磷酸胆碱部分为偶极离子，是极性的亲水头，被誉为蛋白质、维生素之后的“第三营养素”。它是生命的物质基础，是细胞各种膜结构的基本原料，存在于每个细胞中。
磷脂酰胆碱是构成细胞膜的主要成分，能促进细胞吸收营养物质排除毒性废物。可辅助脂溶性维生素A、D、E和K的吸收并使这类维生素的利用率增加100％，补充足够的磷脂酰胆碱可增进细胞的活力，增强人体免疫力和抗病能力。磷脂酰胆碱是强有力的乳化剂，它能使血液中的胆固醇和中性脂肪分解成极小的微粒，以便于组织的吸收和代谢，从而预防了胆固醇在血管内的沉积，防止胆固醇沉积所造成的动脉硬化、高血压及心脏病。磷脂酰胆碱是较典型的兼容分子，参与各种脂蛋白的组成，是各种脂类依赖性酶起催化作用时不可缺少的物质。它与激素的作用机理有关，在神经兴奋的传递中具有重要作用。
富含磷脂酰胆碱的物质包括：蛋黄、牛奶、动物的脑、骨髓、心脏、肺脏、肝脏、肾脏以及大豆和酵母等。磷脂酰胆碱在体内多与蛋白质结合，以脂肪蛋白质(脂蛋白)的形态存在着。由于磷脂酰胆碱优良的生理功能，美国食品药品监督管理局(FDA)规定：在婴幼儿奶粉里，必须添加卵磷脂(磷脂酰胆碱)。
大量研究表明，结构中含有功能性脂肪酸的磷脂酰胆碱同分异构体分子具有更优良的性能，不仅同时具有磷脂和功能性脂肪酸的生理功能，而且结构更稳定、不易于发生氧化反应，更有利于人体的吸收与利用。功能性磷脂酰胆碱具有促进大脑神经系统发育、提高记忆力、降血脂、降低胆固醇、抗衰老、预防癌症等众多生理功能[1-2]。但是，这类功能性磷脂酰胆碱同分异构体分子，一直以来难以被识别。
高分辨质谱仪具有高分辨率、高灵敏度以及高质量精度的特点，可以在一次扫描中生成大量质谱信息，可以获得未知数的多级质谱碎片，在能够获得大量的脂质信息，从而实现复杂磷脂酰胆碱的检测和鉴定。特别是随着基于分离的“液相色谱-质谱方法”的发展，脂质的精确结构解析以及精确结构所引起的生物学作用逐渐成为研究的热点。尽管依赖串联质谱的磷脂酰胆碱的双键位置异构体能够被识别出来，但功能性磷脂酰胆碱同分异构体分子依然需要挖掘其质谱特征碎裂方式可有望被识别。
参考文献：[1]张芹，孙兆敏，徐杰，等.酶法合成富含二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸[J].中国食品学报，2016，16(3)：81－87.
[2]王湘，魏芳，董绪燕，等.酶法合成富含花生四烯酸结构磷脂[J].中国油料作物学报，2015，37(6)：889－896.
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于识别磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)链长异构体的质谱分析方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种用于识别磷脂酰胆碱链长异构体的质谱分析方法，其包括以下步骤：
构建磷脂酰胆碱链长异构体及特征离子高分辨质谱模拟数据库；
建立液相色谱-高分辨质谱联用仪磷脂酰胆碱识别方法，将待检测样品进行液相色谱-高分辨质谱联用检测，根据磷脂酰胆碱正离子和负离子三级碎片离子精确质量数质谱特征，和模拟数据库比对进行质谱分析，获得磷脂酰胆碱链长异构体的识别结果。
上述方案中，液相色谱-高分辨质谱联用检测中的质谱检测条件：二级碰撞能量CE为30～40eV，采集待检测样品在高分辨质谱中的多级质谱数据。
上述方案中，质谱检测中使用的二级、三级碎裂方式为HCD(High-energy C-trapDissociation)。
上述方案中，液相色谱-高分辨质谱联用检测中的液相色谱检测条件：流动相A为5/5～7/3，v/v的乙腈/水混合溶液，含0.05～0.15％甲酸，8～12mmol/L甲酸铵；流动相B为85/15～95/5，v/v的异丙醇/乙腈混合溶液，含0.05～0.15％甲酸，8～12mmol/L甲酸铵，洗脱梯度为:0min，10～20％B；4min，20～40％B；5min，45～50％B；22min，80～85％B；23-24min，98～99％B；24.2-30min，10～20％B。
上述方案中，分别在正离子模式和负离子模式两种扫描模式下采集质谱信息；结合在正离子模式下MS1的质谱碎片离子得到唯一的分子式，进一步结合MS2和MS3的碎片离子质谱图，识别磷脂酰胆碱区别于其他类型磷脂的特征，分析其是否为磷脂酰胆碱；然后结合在负离子模式下MS2的质谱碎片离子，识别磷脂酰胆碱链长异构体，对磷脂酰胆碱的磷酸头基上连接的脂肪酸进行识别。
上述方案中，液相色谱检测中使用的流动相中含有甲酸和甲酸铵，甲酸按体积百分比用量为0.05-0.15％，甲酸铵的用量为8-12mmol/L。
在正离子扫描模式下，磷脂酰胆碱类脂质在一级质谱中均产生母离子[M+H]+，其中磷脂酰胆碱，在二级质谱图中，产生胆碱头部基团的特征碎片[Head+OH+H]+(m/z184.0733)，在三级质谱图中产生特征碎片[Head+H+OH-N(CH3)3]+(m/z 124.9998)；在负离子模式下，具有胆碱头部基团的磷脂酰胆碱生成母离子为[M+HCOO]-，在二级质谱图中，产生[R1COO]-、[R2COO]-、[M-R1CO]-、[M-R2CO]-，以及与磷酸头部基团相关的结构碎片。由此通过“级级过滤”识别思路，据此进行磷脂酰胆碱的识别分析。
上述方案中，所述磷脂酰胆碱链长异构体及特征离子高分辨质谱模拟数据库特征为：根据已知的37种脂肪酸(表1)，若磷脂酰胆碱的两个脂肪酸酰基链不同时为AB型，若磷脂酰胆碱的两个脂肪酸酰基链不同时为AA型，当磷脂酰胆碱是AB型时，将磷脂酰胆碱的磷酸头基类型(图2)与任意2种脂肪酸连接到甘油骨架上，即可组合出全部的AB型磷脂酰胆碱(1332种)。当磷脂酰胆碱是AA型时，将磷脂酰胆碱的磷酸头基类型与任意1种脂肪酸连接到甘油骨架上，即可组合出全部的AA型磷脂酰胆碱种类37种，构建磷脂酰胆碱链长异构体化合物数据库：包括1369磷脂酰胆碱分子式、分子量、结构式，以及根据磷脂酰胆碱链长异构体在高分辨质谱中三级碎片离子质谱特征，构建磷脂酰胆碱链长异构体高分辨质谱数据库：包括一级、二级、三级特征质谱图、磷脂酰胆碱链长异构体正负离子三级特征碎片离子(共10952个)、及其精确质量数。
上述方案中，所述磷脂酰胆碱链长异构体及特征离子高分辨质谱模拟数据库特征为：按照磷脂酰胆碱质谱裂解规律(如图3)，对所构建的模拟库中每一个磷脂酰胆碱分子，都生成相应的二级质谱和三级质谱碎片的精确质量数，并计算理论分子量，由此构建包含脂质分子、分子式、分子量、二级和三级质谱碎片结构式和精确质量数的模拟数据库。
上述方案中，所述建立液相色谱-高分辨质谱联用仪磷脂酰胆碱识别方法为：通过MS1精确质量数，设定质量允差(mass tolerance)≤1ppm，识别唯一的元素组成。
本发明的优点：
本发明破解了磷脂酰胆碱正离子和负离子三级碎片离子精确质量数质谱特征；构建了磷脂酰胆碱链长异构体及特征离子高分辨质谱模拟数据库；建立了液相色谱-高分辨质谱联用仪磷脂酰胆碱识别方法。可以用于功能性磷脂酰胆碱识别，为开发新型功能性磷脂酰胆碱提供技术支撑。
附图说明
图1磷脂酰胆碱结构式
图2图1磷脂酰胆碱的磷酸头基类型
图3磷脂酰胆碱正负离子质谱裂解规律
图4在正离子模式下，PC(18:0/18:2)一级质谱图
图5在正离子模式下，PC(18:0/18:2)的离子m/z 786.6025的二级质谱图
图6在在正离子模式下，PC(18:0/18:2)的二级碎片离子m/z 184.0733的三级质谱图
图7在负离子模式下，PC(18:0/18:2)一级质谱图
图8在负离子模式下，PC(18:0/18:2)的离子m/z 830.5888的二级质谱图
图9在正离子模式下，PC(18:1/18:1)一级质谱图
图10在正离子模式下，PC(18:1/18:1)的离子m/z 786.6025的二级质谱图
图11在在正离子模式下，PC(18:1/18:1)的二级碎片离子m/z 184.0733的三级质谱图
图12在负离子模式下，PC(18:1/18:1)一级质谱图
图13在负离子模式下，PC(18:1/18:1)的离子m/z 830.5888的二级质谱图。
具体实施方式
实施例1
1.磷脂酰胆碱标准品的配制
磷脂酰胆碱PC(18:0/18:2)标准品用氯仿/甲醇混合溶液(2/1，v/v)溶解，配制成1000μg/mL的标准储备液，避光储存在-30℃冰箱中。使用前用甲醇稀释配制成1μg/mL的标准溶液，现用现配。
2.磷脂酰胆碱液相色谱-质谱采集数据
在Dionex高效液相色谱仪系统上选择ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm)，柱温设置为40℃，进样量为1μL。流动相A为乙腈/水(6/4，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)；流动相B为异丙醇/乙腈(9/1，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)。由于所使用的色谱柱粒径小，流速过快时柱压会过大，因此将流速设为0.2mL/min，设置洗脱梯度为:0min，15％B；4min，30％B；5min，48％B；22min，82％B；23-24min，99％B；24.2-30min，15％B。
使用的质谱仪为Thermo Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)质谱，分别在正负离子模式下采用Data Dependent MS3扫描模式进行数据采集，离子源选择电喷雾离子源(ESI)。离子源区参数设置如下：喷雾电压为3500v(+)/3000v(-)，毛细管温度320℃，蒸发温度320℃，辅气(N2)气体流量为5arb，鞘气(N2)气体流量为40arb，扫描范围为150-1200m/z，Obitrap分辨率为240000，自动增益控制(AGC)为1.0e6，最大注入时间为100ms。二级、三级碎裂方式为高能C-捕集解离(High-energy C-trapDissociation，HCD)，碰撞能为35±5eV，Obitrap分辨率为30000，最大注入时间为60ms。
3.数据分析
在正离子模式下，采集获得一级、二级、三级质谱图。将脂质识别的允差masstorlence设定为1ppm时，一级质谱图(图4)中，m/z 786.6025离子被归属为唯一分子式C44H84NO8P的[M+H]+离子。唯一分子式C44H84NO8P。与磷脂酰胆碱数据库比对，匹配得到11种可能的磷脂酰胆碱结构(见表2)，结果包含两种类型的磷脂，有6种磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)类和5种磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)类(见表2)。
在正离子模式下，采集获得m/z 786.6025的二级质谱图(图5)。在二级质谱中m/z184.0733被匹配为胆碱头基的特征碎片[Head+OH+H]+，进而通过m/z 184.0733的三级质谱图中m/z 124.9998离子被匹配为，[Head+OH+H]+(m/z 184.0733)丢失[N(CH3)3]+而在三级质谱产生的特征碎片[Head+H+OH-N(CH3)3]+(m/z 124.9998)。从而，通过“级级排除”的识别思路，排除该脂质非磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)，而是6种可能的PC同分异构体(见表2)。
表1 37种脂肪酸种类及名称
表2.PC(18:0/18:2)多级碎片离子及在数据库中对应的识别结果
在负离子模式下，将脂质识别的允差mass torlence设定为1ppm时，一级质谱图(图7)中，m/z 830.5888离子被归属为[M+HCOO]-离子唯一分子式，进一步证明了C44H84NO8P的唯一分子式。通过HCD二级碎裂，m/z 830.5888的二级质谱(图8)中，m/z279.2323和m/z 283.2635体现了PC酰基链的种类信息，m/z 279.2323和m/z 283.2635分别与数据库中[C17H31COO]-(C18:2酰基链)和[C17H35COO]-(C18:2酰基链)相匹配。因此，排除5种疑似结构：PC(14:0/22:2)、PC(14:1/22:1)、(16:0/20:2)、PC(16:1/20:1)、PC(18:1/18:1)，识别分子的唯一结构PC(18:0/18:2)。
实施例2识别唯一PC(18:1/18:1)的结构
1.磷脂酰胆碱标准品的配制
磷脂酰胆碱PC(18:1/18:1)标准品用氯仿/甲醇混合溶液(2/1，v/v)溶解，配制成1000μg/mL的标准储备液，避光储存在-30℃冰箱中。使用前用甲醇稀释配制成1μg/mL的标准溶液，现用现配。
2.磷脂酰胆碱液相色谱-质谱采集数据
在Dionex高效液相色谱仪系统上选择ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm)，柱温设置为40℃，进样量为1μL。流动相A为乙腈/水(6/4，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)；流动相B为异丙醇/乙腈(9/1，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)。由于所使用的的色谱柱粒径小，流速过快时柱压会过大，因此将流速设为0.2mL/min，设置洗脱梯度为:0min，15％B；4min，30％B；5min，48％B；22min，82％B；23-24min，99％B；24.2-30min，15％B。
使用的质谱仪为Thermo Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)质谱，分别在正负离子模式下采用Data Dependent MS3扫描模式进行数据采集，离子源选择电喷雾离子源(ESI)。离子源区参数设置如下：喷雾电压为3500v(+)/3000v(-)，毛细管温度320℃，蒸发温度320℃，辅气(N2)气体流量为5arb，鞘气(N2)气体流量为40arb，扫描范围为150-1200m/z，Obitrap分辨率为240000，自动增益控制(AGC)为1.0e6，最大注入时间为100ms。二级、三级碎裂方式为HCD，碰撞能为35±5eV，Obitrap分辨率为30000，自动增益控制(AGC)为5.0e4，最大注入时间为60ms。
3.数据分析
在正离子模式下，采集获得一级(图9)、二级(图10)、三级质谱图(图11)。将脂质识别的允差mass torlence设定为1ppm时，一级质谱图(图9)中，m/z 786.6025离子被归属为唯一分子式C44H84NO8P的[M+H]+离子。唯一分子式C44H84NO8P与磷脂酰胆碱数据库比对，匹配得到11种可能的磷脂酰胆碱结构(见表3)，结果包含两种类型的磷脂，有6种磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)类和5种磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)类(见表3)。
在正离子模式下，采集获得m/z 786.6025的二级质谱图(图10)。在二级质谱中m/z184.0733被匹配为胆碱头基的特征碎片[Head+OH+H]+，进而通过m/z 184.0733的三级质谱图中m/z 124.9998离子被匹配为，[Head+OH+H]+(m/z 184.0733)丢失[N(CH3)3]+而在三级质谱产生的特征碎片[Head+H+OH-N(CH3)3]+(m/z 124.9998)。从而，通过“级级排除”的识别思路，排除该脂质非PE，而是6种可能的PC同分异构体(见表3)。
在负离子模式下，将脂质识别的允差mass torlence设定为1ppm时，一级质谱图(图11)中，m/z 830.5888离子被归属为[M+HCOO]-离子唯一分子式，进一步证明了C44H84NO8P的唯一分子式。通过HCD二级碎裂，m/z 830.5888的二级质谱(图12)中，m/z 281.2480体现了PC酰基链的种类信息，m/z 281.2480与数据库中[C17H33COO]-(C18:1酰基链)相匹配。因此，排除5种疑似结构：PC(14:0/22:2)、PC(14:1/22:1)、(16:0/20:2)、PC(16:1/20:1)、PC(18:0/18:2)，识别分子的唯一结构PC(18:1/18:1)。
表3.PC(18:1/18:1)多级碎片离子及在数据库中对应的识别结果
实施例3
1.样品前处理
在处理前，收集脂肪细胞储存在-80℃。每毫克冷冻细胞样品(8μL/mg)中加入8μL冰镇甲醇。然后对样品进行涡旋处理(30s)；后每毫克冷冻细胞样品添加8μL冰镇氯仿，涡旋处理(30s)；再然后每毫克样品添加8μL超纯水，并使样品涡旋处理(30s)；整个操作在湿冰(0℃)上进行，然后在湿冰(0℃)上放置10分钟。然后将样品离心分层(8000r/min，4℃，10分钟)，将样品在室温下静置5分钟。将下层液体(100μL)转移并在氮气流下干燥，然后重新溶解到50μL甲醇/氯仿(2:1，v/v)溶液中，涡旋收集，待检测。
2.色谱分离条件
在Dionex高效液相色谱仪系统上选择ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm)，柱温设置为40℃，进样量为1μL。流动相A为乙腈/水(6/4，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)；流动相B为异丙醇/乙腈(9/1，v/v)混合溶液(含0.1％甲酸，10mmol/L甲酸铵)。流速设为0.2mL/min，设置洗脱梯度为:0min，15％B；4min，30％B；5min，48％B；22min，82％B；23-24min，99％B；24.2-30min，15％B。
3.质谱分析条件
4.使用的质谱仪为Thermo Orbitrap Fusion(Thermo Fisher
Scientific，Waltham，MA，USA)质谱，分别在正负离子模式下采用Data Dependent
MS3扫描模式进行数据采集，离子源选择电喷雾离子源(ESI)。离子源区参数设置如下：喷雾电压为3500v(+)/3000v(-)，毛细管温度320℃，蒸发温度320℃，辅气(N2)气体流量为5
arb，鞘气(N2)气体流量为40arb，扫描范围为150-1200
m/z，Obitrap分辨率为240000，自动增益控制(AGC)为1.0e6，最大注入时间为100
ms。二级、三级碎裂方式为HCD，碰撞能为35±5
eV，Obitrap分辨率为30000，自动增益控制(AGC)为5.0e4，最大注入时间为60ms。数据结果
从脂肪细胞中提取、分离采集磷脂酰胆碱后，使用正负离子同时扫描的方式识别磷脂酰胆碱链长异构体成功识别出94个磷脂酰胆碱(表4)。
表4.癌症细胞中磷脂酰胆碱测定结果
