一种高频菜心离体组织培养方法
技术领域
本发明涉及细胞工程应用领域，具体涉及一种高频菜心离体组织培养方法。
背景技术
菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是华南地区栽培面积和产量最大的蔬菜。菜心以菜薹为主要食用器官，品质柔嫩，风味独特，营养丰富，受到广大消费者的喜爱;其适应性广，生长周期短，可供周年生产，在蔬菜供应中占有重要地位。
培育菜心抗病虫和具有其他优良性状的新品种迫切需要建立稳定高效的再生体系，以获得优良的种质资源。这就需要选择合适的外植体和适合外植体生长的培养基。此外，在培育过程中会受到自身及外界因素的影响：基因型不同的植物细胞其分化能力不一;相同基因型植物组织取材部位不一、苗龄不同，细胞分化能力也不相同;相同部位的植物组织细胞在不同配方的分化培养基中，分化能力不一。
携带AA基因型的白菜类作物属于芸薹属再生率比较低的品种，其不定芽再生困难，农杆菌不易感染且侵染后细胞不易分化，影响了基因工程在白菜品种改良上的应用。随着白菜全基因组测序计划的完成，白菜开始成为十字花科植物功能基因组研究的模式植物。关于芸薹属植物基因和功能的研究越来越多，因此急需一个稳定且高效的菜心离体组织培养方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种高频菜心离体组织培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高频菜心离体组织培养方法，包含如下步骤：
(1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养;
(2)选取步骤(1)培养苗龄为3～5d的无菌苗，在生长点上方平稳切下带柄子叶作为外植体，垂直插入分化培养基中进行分化培养，获得不定芽;
(3)将步骤(2)获得的不定芽转至生根培养基中进行生根培养，获得组培苗;
(4)将步骤(3)获得的组培苗开瓶炼苗，后续常规管理;
步骤(1)中所述的菜心的品种为“油绿501”、增城一号、60天甜菜心或碧清甜菜心;
步骤(1)中所述的表面消毒的具体操作优选为：
选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，依次用无菌水冲洗2遍、体积分数为75%的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍、质量分数为7.5%的NaClO(活性氯含量为4%)浸泡10min，最后用无菌水冲洗三次并吸干水分;
步骤(2)中所述的无菌苗的最佳苗龄为3d;
步骤(2)中所述的分化培养基包含如下按终浓度计的组分：
MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/L AgNO3，pH=5.8;
步骤(2)中所述的带柄子叶的子叶柄的长度优选为0.5cm;
步骤(2)中所述的分化培养的时间优选为40d;
步骤(3)中所述的不定芽的长度优选为1.0～2.0cm;
步骤(3)中所述的生根培养基包含如下按终浓度计的组分：
MS+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L AgNO3，pH=5.8;
步骤(3)中所述的生根培养优选培养至长出健壮的主根;
步骤(4)中所述的炼苗的方式为：选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培养基，转移至含有泥炭和蛭石的混合基质中，保鲜袋套袋5～10天，后续常规管理;
所述的泥炭和蛭石的质量比优选为1:1;
所述的保鲜袋优选具有若干孔洞，以利于植物呼吸;
步骤(1)、(2)(3)、(4)中组织培养的环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯;
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以菜心为材料，研究不同苗龄、外植体类型、6-BA与NAA配比、渗透压、琼脂浓度、AgNO3浓度对不定芽再生率的影响，建立菜心高频再生体系，为菜心遗传转化体系的建立奠定基础。
(2)本发明建立的菜心高频再生体系不定芽再生率高，愈伤组织容易形成，污染率低，操作简便，综合性能高，为菜心遗传转化体系的建立奠定基础。
附图说明
图1是菜心种子播种后获得菜心无菌幼苗的结果图;其中，A：播种;B：3d苗龄的菜心无菌幼苗。
图2是实施例2中不同外植体类型对不定芽分化的影响结果图;其中，A：带柄子叶，B：子叶，C：茎段，1：正面拍摄，2：底部拍摄。
图3是实施例4中分化、生根和炼苗结果图，其中，A：最佳分化培养基中长势良好的不定芽，该不定芽可用于下一步的生根培养，B：最佳生根培养基中不定根萌发情况，C：炼苗套袋情况。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1不同苗龄对不定芽分化的影响
1.材料
供试菜心品种为“油绿501”，由广州市农业科学研究院育成，本实验室多代自交留种。
2.试验方法
2.1无菌苗的获得
选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，依次用无菌水冲洗2遍、体积分数为75%的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍、质量分数为7.5%NaClO浸泡10min、最后用无菌水冲洗三次后置于滤纸上，吸干多余水分，将种子均匀的接种于播种培养基(1/2MS培养基+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH=5.9)上，每瓶50～80粒。环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯。
2.2不同苗龄对不定芽分化的影响
自播种开始计算，分别取3d、4d、5d苗龄的菜心无菌幼苗(图1)，在生长点上方切取带子叶柄子叶(简称带柄子叶，带柄子叶的子叶柄的长度为0.5cm)为外植体，接种于分化培养基(MS+0.3mg/L NAA+5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L AgNO3，pH=5.8)中，放在组培室中培养40d，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯，每10d记录一次生长情况。不定芽再生率按照下述公式计算：
不定芽再生率=(再生不定芽的外植体数/接种外植体数)×100%。
3.结果与分析
结果见表1，由表1可以看出苗龄是影响菜心再生频率的重要遗传因素。自播种开始计算苗龄，苗龄小于3d时子叶未展平，子叶柄较短，离生长点太近，不能用于试验;苗龄3d为最佳苗龄(图1)，此时再生频率最高，达到84.44%;随着苗龄增加，不定芽再生频率迅速下降，苗龄4d的再生率为20%、苗龄5d再生率仅为10%。因此，选择苗龄3d的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体效果最好。
表1不同苗龄对再生频率的影响
实施例2不同外植体类型对不定芽分化的影响
1.材料：同实施例1;
2.试验方法
2.1无菌苗的获得：同实施例1;
2.2不同外植体类型对不定芽分化的影响
选取苗龄3d的菜心无菌幼苗，分别取子叶、带柄子叶(带柄子叶的子叶柄的长度为0.5cm)、茎段(长度为1～1.5cm)为外植体，接种于分化培养基(MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L AgNO3，pH=5.8)中。其中子叶和带柄子叶垂直插入，茎段两端都要接触到培养基，放在组培室中培养40d，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯，每10d记录一次生长情况。不定芽再生率计算方法同实施例1。
3.结果与分析
将苗龄3d的菜心幼苗的不同外植体切下放入分化培养基中培养10d后，带柄子叶、子叶、茎段变大，带柄子叶与培养基接触部位长出绿色愈伤组织;培养20d后，子叶与培养基接触部位长出绿色愈伤组织，茎段与培养基接触部位长出白色愈伤组织，三种外植体开始生长毛状不定根;培养30d后，茎段愈伤组织膨大且变为绿色，三种外植体开始萌发不定芽。从表2可看出，带柄子叶的再生率最高，达到了84.44%，子叶次之，茎段作为外植体的分化频率最低，仅为14.44%。与带柄子叶相比，子叶和茎段的再生率太低。因此选择带柄子叶作为外植体最合适。
图2是不同外植体类型对不定芽分化的影响结果图，从图中可以看出，带柄子叶分化培养后，长势良好，已经能看出愈伤组织。
表2不同部位外植体对再生频率的影响
实施例3不同分化培养基配方对不定芽分化的影响
1.材料：同实施例1;
2.试验方法
2.1无菌苗的获得：同实施例1;
2.2不同分化培养基配方对不定芽分化的影响
不同培养基配方从不同6-BA/NAA比值、不同渗透压、不同琼脂浓度和不同AgNO3浓度四个方面进行处理。选取苗龄3d无菌幼苗的带柄子叶(带柄子叶的子叶柄的长度为0.5cm)为外植体，接种于(1)含有6-BA/NAA不同浓度配比(5:0.1、5:0.3、5:0.5、3:0.3、7:0.3)的分化培养基中，(2)添加20、30、40、50g/L蔗糖的分化培养基中，(3)添加0、1、2、4mg/LAgNO3的分化培养基中，(4)添加6、8、12、14g/L琼脂的分化培养基中。除可变因素外培养基中其余成分与实施例1保持一致，放在组培室中培养40d，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯，每10d记录一次生长情况。不定芽再生率计算方法同实施例1。
3.结果与分析
3.1不同6-BA/NAA配比对再生频率的影响
从表3的实验结果中发现，不同激素配比对不定芽再生频率有显著影响。6-BA浓度不变，再生频率随NAA浓度的增加先升高后降低，6-BA:NAA=5:0.3时分化率最高，为84.44%;NAA浓度不变，再生频率随6-BA浓度的增加先升高后降低，6-BA:NAA=5:0.3时分化率最高。综合所有因素，菜心最佳6-BA、NAA组合为5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA。
表3不同6-BA/NAA配比对再生频率的影响
3.2不同渗透压对再生频率的影响
再生频率随蔗糖浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，蔗糖浓度为30g/L时再生率达到最高，为84.44%(表4)。因此，一定浓度范围内，随着渗透压的增加分化率会得到一定程度的提升，但浓度过高会加速植物的新陈代谢，抑制不定芽的分化，降低分化率。分化培养基中加入30g/L的蔗糖可以得到最大再生率。
表4不同蔗糖浓度对再生频率的影响
3.3不同AgNO3浓度对再生频率的影响
在分化培养基中添加AgNO3可以提高菜心的再生频率，但不同浓度的AgNO3分化率差异显著。添加2mg/L的AgNO3分化率最高，不定芽的质量最好。一定浓度的AgNO3可以促进不定芽的萌发，显著提高再生频率;但浓度过高的AgNO3对不定芽的生长起到反作用，使再生频率降低(表5)。因此在分化培养基中加入2mg/L的AgNO3效果最好，分化率最高。
表5不同AgNO3浓度对再生频率的影响
3.4不同琼脂浓度对再生频率的影响
琼脂浓度影响菜心不定芽的再生。琼脂浓度太低，瓶内湿度过大;琼脂浓度太高，培养基太硬，难以吸收营养物质，均会降低不定芽的再生频率。随着琼脂浓度的增加，再生率先升高后降低，加入12g/L的蔗糖获得最大的再生率86.67%(表6)。因此1.2%浓度的琼脂最适宜诱导菜心不定芽分化。
表6不同琼脂浓度对再生频率的影响
实施例4不同配方对生根培养的影响
1.材料：同实施例1;
2.试验方法
2.1无菌苗的获得：同实施例1;
2.2分化
选取苗龄3d的菜心无菌幼苗，取带柄子叶(带柄子叶的子叶柄的长度为0.5cm)为外植体，接种于分化培养基(MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/LAgNO3，pH=5.8)中。其中，带柄子叶垂直插入，放在组培室中培养，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯;
2.3生根
不定芽长到1.5cm左右时，将不定芽转移至生根培养基。生根培养基在分化培养基的基础上进行微调，共四个处理，配方1：分化培养基;配方2：不加6-BA，其余不变;配方3：1/2MS，不加6-BA，其余不变;配方4：1/2NAA，不加6-BA，其余不变。放在组培室中培养，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯，统计发育不定根的数量。
2.4炼苗
选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培养基，转移至含有泥炭和蛭石(质量比1:1)塑料盆中，用保鲜袋(用镊子将保鲜袋扎若干孔洞，以利于植物呼吸)套袋一周，后续正常管理。
3.结果与分析
本实施例探讨了MS、NAA、6-BA浓度对不定芽生根的影响。从表7中可以发现，6-BA的加入会影响不定根的萌发;NAA浓度减半会影响不定芽的生根;MS较1/2MS更适合菜心外植体的生根培养。在基础培养基中加入MS、0.3mg/L NAA，不添加6-BA生根率最高，为73.33%。生根培养基最佳配方为：MS+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L AgNO3，pH=5.8。
表7不同配方对生根培养的影响
实施例5不同品种对不定芽分化的影响
1.材料
供试菜心品种为增城一号(晚熟)、60天甜菜心(中熟)和碧清甜菜心(早熟)，由广州市农业科学研究院育成，本实验室多代自交留种。
2.试验方法
2.1无菌苗的获得：同实施例1;
2.2分化
选取苗龄3d的菜心无菌幼苗，取子叶带柄子叶(带柄子叶的子叶柄的长度为0.5cm)为外植体，接种于分化培养基(MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/L AgNO3，pH=5.8)中。其中，带柄子叶垂直插入，放在组培室中培养，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯;
2.3生根
不定芽长到1.5cm左右时，将不定芽转移至生根培养基(MS+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/L AgNO3，pH=5.8)中。放在组培室中培养，环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用110μmol/m2s1的白色LED灯，每10d记录一次生长情况。
2.4炼苗
选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培养基，转移至含有泥炭和蛭石(质量比1:1)塑料盆中，用保鲜袋(用镊子将保鲜袋扎若干孔洞，以利于植物呼吸)套袋一周，后续正常管理。
3.结果与分析
随机选取的三个菜心品种不定芽再生率均超过80%(表8)，品种间差别不大，说明本体系适用于菜心其它品种。
表8不同品种不定芽分化的影响
本发明建立了菜心高频再生体系：菜心采用苗龄3d的带柄子叶为外植体，最佳分化培养基为：MS+0.3mg/L NAA+5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/L AgNO3，外植体再生率达86.67%;生根培养基最佳配方为：MS+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/LAgNO3，生根率为73.33%(图3)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
