高效促生的甲基杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物学领域，特别是涉及一种高效促生的甲基杆菌菌株及其应用。
背景技术
植物在生长过程中与各种微生物之间发生着相互作用，主要包括植物根际微生物、叶际微生物以及植物内生菌。这些微生物可以通过固氮、解磷、分泌生长素、增加植物抗性等直接或间接的方式促进植物生长。在农业生产中，通过外源接种这类有益微生物不仅可以促进植物生长，增加作物产量，同时，其对环境友好性和作用效果的可持续性，在对生态环境越来越重视的当代农业中备受推崇。
甲基杆菌属(Methylobacterium)是一类兼性需氧型细菌，能够利用包括甲醇、甲胺等一碳类化合物作为碳源。甲基杆菌属细菌菌体因能够合成类胡萝卜素而呈粉红色，因此又将这一类细菌称为粉红色兼性甲基营养菌(pink-pigmented facultativemethylotrophics，PPFM)。Methylobacterium广泛存在于土壤、空气、水域等环境，以及植物的叶际和根际中，具有能够产生植物激素、拮抗植物病原微生物、缓解非生物逆境等功能，在农业生产中具有较大的开发利用价值。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种甲基杆菌YT2019B002，其可分泌植物生长素，可以有效促进植物种子萌发和植株生长。
具体技术方案如下：
一种甲基杆菌YT2019B002，所述甲基杆菌YT2019B002的保藏编号为GDMCC No:61052。
本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌YT2019B002在制备植物生长素中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌YT2019B002在制备植物生长调节制剂中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌YT2019B002在制备促进植物生长的肥料中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌YT2019B002在促进植物生长中的应用。
在其中一些实施例中，所述促进植物生长包括促进植物种子萌发。
在其中一些实施例中，所述促进植物生长包括促进植物植株生长。
本发明的另一目的是提供一种生物制剂，其活性成分包括上述的甲基杆菌YT2019B002。
本发明的另一目的是提供一种上述的甲基杆菌YT2019B002的培养方法，包括以下步骤：将甲基杆菌YT2019B002接种于培养基中，于20～30℃条件下进行培养;所述培养基为AMS培养基。
本发明的另一目的是提供一种甲基杆菌YT2019B002培养物，其由培养权利要求1所述的甲基杆菌YT2019B002制备得到。
本发明所述的甲基杆菌YT2019B002(Methylobacterium sp.)已于2020年6月9日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏日期：2020年6月9日，保藏编号：GDMCCNo:61052。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现了一种属于甲基杆菌属的新微生物甲基杆菌YT2019B002，其可以产生植物生长素，对于植物的种子萌发和植株生长均有很好的促进作用，在农业生产中具有广泛的开发利用价值。
附图说明
图1为菌株YT2019B002在培养基上的培养形状和革兰氏染色图(A：AMS培养基上培养形状;B：革兰氏染色);
图2为特异性引物(mxaF基因)PCR扩增结果凝胶电泳图，(M：DL2000 Marker;1,2：YT2019B002菌株;3,4：阴性对照);
图3为基于16S rRNA序列采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建的系统发育树;菌株Escherichia coli 562(J01859)为外群，T：模式菌株;
图4为YT2019B002对种子萌发的影响(A：CK处理3d;B、C：CK处理5d;D：YT2019B002处理3d;E、F：YT2019B002处理5d);
图5为移栽23d后不同处理对辣椒幼苗生长的影响(A：CK1;B：CK2;C：YT2019B002(G);D：YT2019B002(P));
图6菌株YT2019B002产IAA能力测定(a：IAA标准曲线;b：培养7d后发酵上清液显色反应，A：CK;B：YT2019B002)。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
材料与方法：
分离材料来源：分离材料果蔗苗(Saccharum officinarum‘Badila’)采自于广东省广州市南沙区东涌镇，采集后冰盒低温保藏带回实验室，置于-20℃低温保藏，用于功能微生物分离。
固体AMS培养基：根据Whittenbury et al.1970中甲基杆菌属细菌专性培养基ammonium mineral salt(AMS)培养基，主要成分包括K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.54g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCI2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 4mg，NH4Cl 0.5g，ZnSO4·7H2O 100.0mcg，MnCl2·4H2O 30.0mcg，H3BO3 300.0mcg，CoCl2·6H2O 200.0mcg，CuCl2·2H2O 10.0mcg，NiCl2·6H2O 20.0mcg，Na2MoO4·2H2O 60.0mcg，Agar 15.0g，蒸馏水1L，pH值6.8，121℃灭菌30min备用，灭菌后带培养基冷却至50-55℃，每100mL培养基加入1mL过滤灭菌的甲醇，混匀后倒平板备用。
AMS液体培养基：培养基中不加Agar，其他配方与固体AMS培养基相同。
分离方法：将甘蔗根际土通过梯度稀释法制备得到10-6-10-8g/mL的土壤悬液，将悬液均匀涂布于固体AMS培养基上，25℃恒温倒置培养，观察并分离纯化产生粉红色色素的菌株，命名为YT2019B002，将菌株接入营养肉汤液体培养基中，25℃160rpm摇培48h后，以1:1的体积比加入30%甘油水溶液(v/v)，于-80℃保存菌株，备用。
菌株YT2019B002的鉴定：
1.菌株YT2019B002的理化性质测定
将菌株YT2019B002在大豆酪蛋白琼脂培养基TSA(OXOID)固体培养基上25℃划线培养5天后，挑取单菌落进行革兰氏染色，利用2Systems革兰氏阴性菌鉴定卡(GN卡)进行碳源利用、酶类活性和耐药性检测。
2.菌株YT2019B002的分子生物学鉴定
用热裂解法提取YT2019B002单菌落DNA，利用特异性引物mxa f1003(5-GCGGCACCAACTGGGGCTGGT-3′，SEQ ID NO:2)和mxa r1561(5-GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-3′，SEQ ID NO:3)进行mxaF基因扩增，确认菌株属的种类。同时，利用27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO:4)和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQID NO:5)进行16S rRNA片段扩增，PCR产物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列通过与相近物种的序列构建系统发育树对YT2019B002准确种类进行鉴定。
3.促生长能力测定：
(1)种子萌发实验：选择菜心种子(四九菜心)作为实验材料，2%次氯酸钠溶液表面消毒15分钟，用无菌水将种子表面次氯酸钠溶液冲洗干净，将种子均匀地放在铺有灭菌纱布的培养皿中，每皿50颗种子并加入20mL 28℃摇培5d的AMS液体培养基培养的YT2019B002菌液，以同样体积的AMS液体培养基作为对照，25℃恒温黑暗培养5d观察并统计萌发率。
(2)促生盆栽试验：将进口丹麦托普泥炭土与蛭石按照5:1的比例(V/V)进行充分混合，121℃，20min高温灭菌3次备用。500ml的塑料花盆用2wt%的次氯酸钠溶液浸泡30-60min后，用无菌水充分冲洗掉残留的次氯酸钠溶液备用。将灭好菌的土分装如灭菌的花盆中，选择3-4周长势相同的辣椒幼苗移栽入花盆中，每盆两株，每处理4个重复，共4个处理，包括①YT2019B002(G)：苗移栽后1天以灌根的方式每盆接种菌液30ml;②YT2019B002(P)：在苗移栽后的第1、8、15天，以叶面喷施的方式每盆每次接种菌液10ml;③CK1：将处理①中的菌液以同样体积的AMS液体培养基代替进行灌根处理;④CK2：将处理②中的菌液以同样体积的AMS液体培养基代替进行叶面喷施处理。所有处理均放于28℃，16h/8h光周期的光照培养箱中进行培养，每两天浇一次水，移栽23天后对不同处理的辣椒苗进行株高、地上部/地下部鲜重/干重、叶片叶绿素含量、真叶数进行测量统计和单因素方差分析(Fisher’sLSD test)。
菌株YT2019B002酶活测定
葡聚糖酶活性测定：将菌株划线接种于KM培养基上，主要成分包括0.4%(NH4)2SO4，0.01%NaCI，0.01%MgSO4，0.01%CaCI2，0.05%酵母提取物，33mg Fe(III)-EDTA，0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，0.04%羧甲基纤维素钠(CMC)，Agar 15.0g，蒸馏水1L，121℃灭菌30min。30℃恒温倒置培养3天后，将平板中倒入0.1%刚果红溶液染色30min，1M NaCI溶液褪色10min，观察是否有透明圈产生。
嗜铁素活性测定：参照Shin et al.(2001)的方法。A：①60.5mg铬天青S溶于50ml去离子水;②10ml三价铁溶液(1mM FeCl3·6H2O,10mM盐酸为溶剂);③72.9mg CTAB溶于40ml去离子水。上述三个溶液混合定容至100ml，pH调至中性，121℃灭菌20min。B:30.24gPipes加入900ml水琼脂培养基，pH=6.8,121℃灭菌20min。A、B液混合倒平板,接菌30℃恒温倒置培养3d后观察、记录结果。
生长素IAA活性测定：采用Salkowski比色测定法，将菌株接入5mL加L-色氨酸(2mgL-1)的营养肉汤液体培养基中，26℃160rpm培养7天，将培养液6500rpm离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤得到无菌滤液，每毫升滤液加入1mL Salkowski显色液(2mL 0.5MFeCl3，49mL 35%[v/v]HClO4)，室温孵育30-60min，以不加菌的培养液为对照，利用分光光度计测定滤液在530nm波长的吸光值。
ACC活性测定：参照Penrose和Glick(2003)的方法，将菌株接入装有10mL AMS液体培养基的50mL三角瓶中，28℃120rpm摇培4-5天，3000g离心5min收集菌体，用过滤灭菌的0.1M Tris-HCI(pH 7.5)清洗菌体两次，然后重悬于1mL0.1M Tris-HCI(pH 7.5)中，取200μL涂布于以3mM ACC为唯一氮源的DF微量元素培养基中，以加入(NH4)2SO4(0.2%w/v)的DF培养基为阳性对照，涂布好的培养皿放置于28℃恒温倒置培养3d后观察菌株生长状况。
结果：
1.鉴定
菌株YT2019B002革兰氏染色呈红色(如图1)，为革兰式阴性菌。菌落形态：在AMS固体培养基上培养，菌落为不透明浅粉色，菌落直径1-3mm，向上突起，边缘整齐，干燥。
理化性质特征测定如表1，利用2System与2厌革兰氏阴性菌鉴定卡(GN)，通过对一共47种碳源利用、酶类活性和耐药性及一个阴性对照反应的测定，初步鉴定YT2019B002为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)细菌。
表1.菌株YT2019B002理化性质特征
注：+=95%至100%阳性;v=6%至94%阳性;-=0%至5%阳性。
以菌株YT2019B002的DNA为模板利用Methylobacterium属特异性引物进行扩增，获得片段大小为560bp的特异性条带(图2)，进一步确认YT2019B002为甲基杆菌属细菌。将菌株YT2019B002的16S rRNA序列(如SEQ ID NO：1所示)与NCBI数据库里的序列进行比对，其与M.populi模式菌株BJ001(Accession No.：AY251818)的相似度最高，达到99.49%。以NCBI中Methylobacterium属其他种的16S rRNA序列为参照，以Escherichia coli(Accession No.:J01859)为外群，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树，得到的最优树中菌株YT2019B002与M.populi(AY251818)以高支持率(96)形成了一个独立分支(如图3)。
本发明所述的甲基杆菌YT2019B002的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示：
SEQ ID NO:1：
CAGCTTACACATGCAGTCGAACGGGCTTCTTCGGAAGTCAGTGGCAGACGGGTGAGTAACACGTGGGAACGTGCCCTTCGGTTCGGAATAACTCAGGGAAACTTGAGCTAATACCGGATACGCCCTTATGGGGAAAGGTTTACTGCCGAAGGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGgCCtTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTCCGGGACGATAaTGACGGTACCGGAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGCCGATTAAGTCGGGGGTGAAAGCCTGTGGCTCAACCACAGAATTGCCTTCGATACTGGTTGGCTTGAGACCGGAAGAGGACAGCGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCCGGTTCTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTGGCCTGCTTGCAGGTCAGTGGCGCCGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCARAAaCCTWACCATcCCCTTGACATGGCaTGTTACCTCGAGAGATCGGGGATCCTCTTCGRAGGCGTGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGATGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGACGCGAAACCGCGAGGTTGAGCAAATCCCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGGGTGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCACGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTCTTACCCGACGGCGCTGCGCCAACCGCAAGGGGGCAGGCGACCACGGTAGTCGCAC。
2.种子萌发促生能力测定
为明确菌株YT2019B002是否具有促进种子萌发的能力，以YT2019B002发酵液为处理组(YT2019B002)，AMS培养基为对照组(CK)进行了种子萌发试验(图4)。试验结果表明，处理组种子在培养的第二天开始萌发，对照组萌发时间较处理组迟，第三天开始出现萌发，对照组第三天的萌发率为39.39%，处理组第三天的萌发率为59.04%。接种后第五天对不同处理所有重复的萌发率及萌发后苗长进行测量和统计发现，CK对照组的平均萌发率为47.74%，平均苗长为20.03±0.02mm，而YT2019B002处理组平均萌发率为70.16%，平均苗长为25.29±0.03mm，萌发率和平均苗长都显著高于对照组。说明菌株YT2019B002具有促进种子萌发和生长的功能。
3.盆栽促生试验
辣椒苗移栽23d后，各生长指标统计结果表明，以YT2019B002菌株发酵液进行灌根(YT2019B002(G))和喷施(YT2019B002(P))处理的辣椒苗，其地上/地下部鲜重/干重、株高、叶绿素含量和平均真叶数均显著高于AMS培养液处理的对照组;CK1对照组和CK2对照组两种不同处理方式的对照各生长指标间均无显著差异。处理组中，YT2019B002(G)组进行3次喷施处理的辣椒苗地下部干重和株高显著高于YT2019B002(P)组的一次性灌根处理，平均真叶数也较多，由此说明菌株YT2019B002的发酵液具有显著促进植物生长的能力，并且多次喷施效果优于一次性灌根处理(表2，图5)。
表2不同处理辣椒幼苗生长指标
a、b、c表示显著性差异
4.YT2019B002菌株促生机制
生长素IAA测定结果表明，以0、0.2、1.0、2.0、3.0、6.0、11.0、20.0、45.0μg/mL浓度的标准品及其在530nm出的吸光值绘制得到标准曲线y=44.716x+0.812(R2=0.9985)(图6a)，以不加菌的培养基为空白对照，培养7d后处理组在530nm波长的吸光值为0.126±0.009，表明菌株YT2019B002具有分泌生长素IAA的功能(图6b)，根据标曲得到IAA浓度为6.461±0.401μg/mL。
YT2019B002在以ACC为唯一氮源的DF培养基上不能生长，并且通过平板测定也没有葡聚糖酶和嗜铁素活性。
综上，菌株YT2019B002可通过产生IAA的方式促进植物生长。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)
<120> 高效促生的甲基杆菌菌株及其应用
<130> 2020-08-05
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cagcttacac atgcagtcga acgggcttct tcggaagtca gtggcagacg ggtgagtaac 60
acgtgggaac gtgcccttcg gttcggaata actcagggaa acttgagcta ataccggata 120
cgcccttatg gggaaaggtt tactgccgaa ggatcggccc gcgtctgatt agcttgttgg 180
tggggtaacg gcctaccaag gcgacgatca gtagctggtc tgagaggatg atcagccaca 240
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 300
gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gagtgatgaa ggccttaggg ttgtaaagct 360
cttttgtccg ggacgataat gacggtaccg gaagaataag ccccggctaa cttcgtgcca 420
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