一种群体感应信号分子降解基因aidf及其编码的降解酶AidF和应用
技术领域
本发明属于酶基因工程技术领域。更具体地，涉及一种群体感应信号分子降解基因aidf及其编码的降解酶AidF和应用。
背景技术
由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovora，Pcc)引发的细菌性软腐病已经成为世界性病害，在多国均有发生并且导致相关作物的减产，引起重大经济损失。Pcc侵染寄主植物主要是通过合成和分泌胞外酶(果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶)，这些酶能够降解寄主植物的细胞壁，破坏它们的组织结构，从而Pcc可以获得水分和营养成分以支持自身生长和繁殖，侵染成功后，寄主植物出现软腐病相关症状。目前，对于由Pcc引起的软腐病，在实际生产上，主要采取的防治措施是使用化学农药(包含农用抗生素)。但是，化学农药的大量使用引发了严重的环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列安全问题;此外，农药和抗生素的不恰当使用会导致致病菌产生耐药性，甚至出现多重耐药性。因此，找到一种新的绿色、有效的病害预防策略是刻不容缓的。
随着群体感应(Quorum sensing，QS)现象的发现，关于微生物群体水平行为的研究开始进行。经过数年探究，大量研究证明，QS系统广泛存在于自然界的多种动物和微生物中。在微生物中，QS参与调控多种生物学功能，如：群体移动性、共生现象、抗生素合成、胞外酶的分泌、孢子形成及基因交换等。在QS中，微生物可以产生并分泌一种或多种化学物质，这种化学物质在环境中的浓度随着微生物群体密度的增大而增加，当其浓度达到一定阈值后，微生物的某些基因开始表达，这些化学物质被称为群体感应信号分子或自诱导剂。
Pcc具有QS系统，调控着这些胞外水解酶合成。Pcc自身可以合成并分泌群体感应信号分子N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone(OHHL，3OC6-HSL)，它是革兰氏阴性细菌信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-Acyl homoserine lactones，AHLs)的其中一种。3OC6-HSL作为Pcc的群体感应信号分子，其密度与胞外酶的合成和分泌密切相关。
群体淬灭(Quorum quenching，QQ)是基于QS的病害防治策略，即通过淬灭(淬灭菌或淬灭酶)致病菌的信号分子以达到控制信号分子的浓度，使其低于阈值，此时病原菌致病基因的表达不能被激活，致病性降低。这种策略在应用时，不会直接杀死致病菌，给予致病菌选择压力，所以，不会使致病菌产生抗药性。近年来，通过QQ的方式来减弱病原菌致病性的方式已经引起国际学术界的广泛关注，这种生物技术成为了防治植物病害的新热点。
目前，已从自然界中分离出大量的群体感应淬灭菌(如CN201810843540.4、CN201910837948.5)，但由于微生物之间的相互作用十分复杂，若直接应用群体感应淬灭菌去防治病害，则出现的不可控因素太多，需要很多实验和调查来确保某种淬灭菌的安全应用。此外，利用生物技术构建的基因工程淬灭菌也具有QQ活性，但由于其没有在自然界进行过进化和适应过程，所以使用起来效果并不理想(Liu P F et al.AhlX,an N-acylhomoserine lactonase with unique properties[J].Marine Drugs,2019)。因此，挖掘具有群体淬灭活性的淬灭酶是目前研究的努力方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术存在的缺陷和不足，提供一种群体感应信号分子降解基因aidf及其编码的降解酶AidF和应用
本发明的目的是提供一种群体感应信号分子降解基因aidf。
本发明另一目的是提供所述降解基因aidf编码的降解酶AidF。
本发明又一目的是提供一种重组质粒。
本发明又一目的是提供一种重组微生物。
本发明再一目的是提供所述降解基因aidf、所述降解酶AidF、所述重组质粒或所述重组微生物在淬灭群体感应信号分子中的应用，或在制备淬灭群体感应信号分子的产品中的应用;以及在防治依赖群体感应信号分子介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)D-2中克隆得到了一种群体感应信号分子降解基因aidf，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，序列长度为816bp，G+C含量为62%。
本发明还提供了所述降解基因aidf编码的降解酶AidF，所述降解酶AidF的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，其由271个氨基酸(aa)组成，预测分子量为29.3kDa，等电点为4.95。
本发明还提供了一种重组质粒，包含所述降解基因aidf或其片段，或能够表达出所述的降解酶AidF。
优选地，所述重组质粒为pET28b-aidF。
本发明还提供了一种重组微生物，能够表达所述降解基因aidf或其片段，或能够表达出所述的降解酶AidF。
优选地，所述重组微生物为E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF。
本发明研究发现，构建得到的重组微生物E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF具有淬灭AHLs的活性，即降解基因aidf编码的降解酶AidF能够淬灭AHLs;且降解酶AidF对Pcc Z3-3引起的萝卜软腐病具有显著的生物防治效果。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
所述降解基因aidf、所述降解酶AidF、所述重组质粒或所述重组微生物在淬灭群体感应信号分子中的应用。
所述降解基因aidf、所述降解酶AidF、所述重组质粒或所述重组微生物在制备淬灭群体感应信号分子的产品中的应用。
所述降解基因aidf、所述降解酶AidF、所述重组质粒或所述重组微生物在防治依赖群体感应信号分子介导致病的植物病害中的应用。
所述降解基因aidf、所述降解酶AidF、所述重组质粒或所述重组微生物在制备依赖群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂中的应用。
优选地，所述群体感应信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯。
更优选地，所述N-酰基高丝氨酸内酯为OHHL或3OC6-HSL。
优选地，所述依赖群体感应信号分子介导致病的植物病害为软腐病，如萝卜软腐病。
优选地，所述依赖群体感应信号分子致病的致病菌为果胶杆菌(Pectobacteriumsp.)。
更优选地，所述果胶杆菌(Pectobacterium sp.)为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora,Pcc)Z3-3。
本发明具有以下有益效果：
本发明从中间苍白杆菌D-2中克隆得到了一种群体感应信号分子降解基因aidf，该降解基因aidf编码的降解酶AidF能够淬灭群体感应信号分子，且对果胶杆菌引起的软腐病具有显著的生物防治效果，并进一步构建得到了具有群体感应信号分子淬灭活性的重组质粒和重组微生物;因此，该降解基因aidf、降解酶AidF、重组质粒和重组微生物在淬灭群体感应信号分子、制备淬灭群体感应信号分子的产品，以及在防治依赖群体感应信号分子介导致病的植物病害、制备依赖群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂中有很好的应用潜力。
另外，本发明体现了群体感应信号分子的降解酶AidF具有作为植物病害控制靶点的潜力，能够为群体感应信号分子降解提供有效的生物技术手段，对基于降解群体感应信号分子的植物病害的防控具有重要意义。
附图说明
图1是降解酶AidF的表达及纯化结果图;其中，M:Marker;1、2泳道：E.coli BL21(DE3)pET-28b加IPTG诱导;3、4泳道：E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF不加IPTG诱导;5、6泳道：E.coli BL21(DE3)/pET-28b-aidF加IPTG诱导。
图2是降解酶AidF淬灭活性的测定结果图;其中，A：3OC6-HSL;B：E.coli BL21(DE3)pET28b粗酶液+3OC6-HSL(+IPTG);C：E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF粗酶液+3OC6-HSL(-IPTG);D：E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF粗酶液+3OC6-HSL(+IPTG)。
图3是降解酶AidF对萝卜软腐病的生防效果测定结果图;其中，A：PBS;B：Pcc Z3-3+PBS;C：Pcc Z3-3+E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液;D：Pcc Z3-3+纯化后的降解酶AidF。
图4是四个实验组中白萝卜的腐烂面积百分比柱状图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1降解酶AidF的表达及纯化
1、实验方法
本实施例从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)D-2(已在申请号为CN201810843540.4的发明专利中公开保藏)中克隆得到了一种群体感应信号分子(AHLs)降解基因aidf，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，序列长度为816bp，G+C含量为62%。
该降解基因aidf能够编码降解酶AidF，其由271个氨基酸(aa)组成，预测分子量为29.3kDa，等电点为4.95。该降解酶AidF表达及纯化的方法，具体包括以下步骤：
(1)根据降解基因aidf的核苷酸序列(SEQ ID No：1)设计序列如表1所示的引物aidF-F/R，利用该引物，以中间苍白杆菌D-2的DNA为模板进行PCR扩增，得到降解基因aidf的DNA片段，并亚克隆到表达载体pET28b上，构建得到重组质粒pET28b-aidF;然后将该重组质粒pET28b-aidF转入Escherichia coli BL21(DE3)中，获得重组微生物E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF。
表1引物aidF-F/R的序列
注：下划线标记的分别为引物aidF-F、引物aidF-R的BamH I(GGATCC)和Xho I(CTCGAG)酶切位点。
(2)将E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF的单菌落接种至5mL的LB培养基中(Kan 50μg/mL)，在30℃，200rpm的条件下，进行过夜培养，得到种子液。将种子液按1：100的比例转接至含600mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.6。往三角瓶中加入IPTG使其终浓度为0.8mM，之后在18℃，150rpm，诱导表达12h，获得发酵液。在4℃条件下对发酵液进行高速离心(10000rpm，10min)，弃掉上清。每100mg湿菌加入1mL结合缓冲液Buffer A(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 7.4)重悬菌体。冰浴条件下进行超声破碎，破碎总时间10min(工作5s，间隔3s)，共破碎2次。将细胞破碎液于1000rpm，4℃离心20min，将上清与沉淀分开，将上清转移至50mL离心管，然后用0.22μM微孔过滤器过滤，收集上清，即粗酶液，用于亲和纯化。同时设置E.coli BL21(DE3)pET28b加IPTG诱导、E.coliBL21(DE3)/pET28b-aidF不加IPTG诱导的对照。利用蛋白纯化仪进行降解酶AidF的纯化，通过SDS-PAGE分析降解酶AidF的大小及纯度。
2、实验结果
降解酶AidF的表达及纯化结果如图1所示，可以看出，5和6泳道成功表达得到了降解酶AidF，说明本发明利用E.coli BL21(DE3)/pET-28b-aidF加IPTG诱导能够成功制备得到降解酶AidF。
实施例2降解酶AidF淬灭活性的测定
1、实验方法
为了验证降解酶AidF是否具有AHLs(3OC6-HSL)淬灭活性，本实施例利用报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CF11进行了验证实验，具体包括以下步骤：
设置4个实验组：(1)实验组A：(仅含3OC6-HSL);(2)实验组B：E.coli BL21(DE3)pET28b粗酶液+3OC6-HSL(+IPTG);(3)实验组C：E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF粗酶液+3OC6-HSL(-IPTG);(4)实验组D：E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF粗酶液+3OC6-HSL(+IPTG)。
反应体系为：10μL粗酶液+189.9μL PBS+0.1μL 3OC6-HSL母液。在28℃静置反应30min后，取5μL反应混合物点样至1cm宽的MM琼脂条顶端，然后在下方点一排可以检测AHLs的报告菌株根癌农杆菌CF11，其中，MM琼脂条的pH值为6.5，琼脂条中含有40μg/mL的X-gal。将MM琼脂条放置在28℃培养箱，避光培养24h后，观察各实验组琼脂条上是否含有变为蓝色的单菌落(单菌落变蓝，说明相应样品中含有3OC6-HSL，变蓝的单菌落越多，则说明样品中3OC6-HSL的浓度越高)。
2、实验结果
降解酶AidF淬灭活性的测定结果如图2所示，可以看出，实验组A和实验组B的琼脂条上有部分菌落变为蓝色，实验组C和实验组D的琼脂条上没有菌落变为蓝色;说明实验组A和实验组B中均含有3OC6-HSL，且浓度相同，而实验组C和实验组D中不含有3OC6-HSL。
以上结果表明：E.coli BL21(DE3)pET28b不具有淬灭AHLs(3OC6-HSL)的活性，而E.coli BL21(DE3)/pET28b-aidF具有淬灭3OC6-HSL的活性，即降解基因aidf编码的降解酶AidF能够淬灭AHLs。
实施例3降解酶AidF对萝卜软腐病的生防效果测定
1、实验方法
本实施例以引起十字花科作物软腐病的病原菌-胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora,Pcc)Z3-3为例，研究降解酶AidF对依赖AHLs致病的致病菌的生防效果，具体包括以下步骤：
(1)将Pcc Z3-3单菌落接种至LB培养基中，30℃，200rpm培养8h后，离心获得菌体。用PBS缓冲液洗菌2次后，进行重悬，使重悬液中Pcc Z3-3的OD600=0.3。取50μLPcc Z3-3重悬液，均匀涂布于每片白萝卜(第一组实验组中的白萝卜片涂布50μL PBS)。
(2)取PBS缓冲液、E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液和纯化后的降解酶AidF各100μL，均匀涂布在厚度相同的白萝卜切片上(第一组实验组中的白萝卜片涂布100μL PBS)，晾干多余水分后，用保鲜膜密封后放置在30℃培养。每隔8h取出，并再次各自涂布100μL的取PBS缓冲液、E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液和纯化后的降解酶AidF(第一组实验组中的白萝卜片涂布100μL PBS)，晾干多于水分后放置在30℃培养。即分别设置PBS、Pcc Z3-3+PBS、Pcc Z3-3+E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液、Pcc Z3-3+纯化后的降解酶AidF，四个实验组。每隔8h进行实验结果的观察。
其中，E.coli BL21(DE3)pET-28b的粗酶液的获取方法参考E.coli BL21(DE3)pET-28b-aidF粗酶液的获取方法。
2、实验结果
降解酶AidF对萝卜软腐病的生防效果测定结果如图3所示，四个实验组中白萝卜的腐烂面积百分比柱状图如图4所示，可以看出，只涂布了PBS的白萝卜片没有出现腐烂，说明PBS不具有致病性;涂布了Pcc Z3-3和PBS，以及涂布了Pcc Z3-3和E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液的白萝卜，已经严重腐烂;而涂布了Pcc Z3-3和降解酶AidF的白萝卜只出现轻微腐烂。其中，四个实验组(PBS、Pcc Z3-3+PBS、Pcc Z3-3+E.coli BL21(DE3)pET-28b粗酶液、Pcc Z3-3+纯化后的降解酶AidF)中，白萝卜的腐烂面积百分比分别为0%，95.29%，95.00%，13.14%。
以上结果表明：未使用降解酶AidF的白萝卜约95.00%的组织腐烂，而使用了降解酶AidF的白萝卜只有13.14%的组织腐烂;即降解酶AidF对Pcc Z3-3引起的白萝卜软腐病具有显著的生物防治效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种群体感应信号分子降解基因aidf及其编码的降解酶AidF和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacgatca attatcgcga gcttgaaacc agccacggca gaattgccat tcgtgaaagc 60
gcgggcgagg ggatgccgct tctgatgatc cacggcaatt ccagcgcagg cgcaatcttc 120
gcgccccagc ttgaaggcga gattggccgg aactggcgga taatcgcgcc ggacctgccg 180
ggccatggcc ggtcgggcga tgcgctcgat ccggaccgca gctattccat ggagggctat 240
gccgacgcga tgacggaggt tctcgaaaaa ctcggcattt ccgaggcggt cgtctttggc 300
tggtcgctcg gcggccatat cggcatcgag atgatctcgc gctttcccgg catgcgcggc 360
ctgatgatta ccggcacgcc gcccgtggcg cgggaggaag tggggcaagg gttcaagagc 420
ggtcccgaca tggcgctggc ggggcaggaa gtcttttccg cccgcgatgt cgaatcctac 480
gcgcgcagca cctgcggcga accgttcgaa gaagggttgc tcgatattgt tgcccgcacg 540
gacggacgcg cgcggcgcat catgttcgag aagtttgcag ccgggaccgg cggaaaccag 600
cgcgatatcg ttgccgcggc gacgcttccc atagctgtgg tcaacggggg cgacgagcct 660
ttcgtcgaac tggatttcgt ctcgaaagtc cggttcggca atctgtggga aggcaaggcc 720
cacatcatcg acggggcagg gcatgccccc ttccgcgaga caccagccgt cttcgatgcg 780
tatcttgagc gcttcatgcg cgactgcacc gtttga 816
<210> 2
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Ile Asn Tyr Arg Glu Leu Glu Thr Ser His Gly Arg Ile Ala
1 5 1015
Ile Arg Glu Ser Ala Gly Glu Gly Met Pro Leu Leu Met Ile His Gly
202530
Asn Ser Ser Ala Gly Ala Ile Phe Ala Pro Gln Leu Glu Gly Glu Ile
354045
Gly Arg Asn Trp Arg Ile Ile Ala Pro Asp Leu Pro Gly His Gly Arg
505560
Ser Gly Asp Ala Leu Asp Pro Asp Arg Ser Tyr Ser Met Glu Gly Tyr
65707580
Ala Asp Ala Met Thr Glu Val Leu Glu Lys Leu Gly Ile Ser Glu Ala
859095
Val Val Phe Gly Trp Ser Leu Gly Gly His Ile Gly Ile Glu Met Ile
100 105 110
Ser Arg Phe Pro Gly Met Arg Gly Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Pro
115 120 125
Val Ala Arg Glu Glu Val Gly Gln Gly Phe Lys Ser Gly Pro Asp Met
130 135 140
Ala Leu Ala Gly Gln Glu Val Phe Ser Ala Arg Asp Val Glu Ser Tyr
145 150 155 160
Ala Arg Ser Thr Cys Gly Glu Pro Phe Glu Glu Gly Leu Leu Asp Ile
165 170 175
Val Ala Arg Thr Asp Gly Arg Ala Arg Arg Ile Met Phe Glu Lys Phe
180 185 190
Ala Ala Gly Thr Gly Gly Asn Gln Arg Asp Ile Val Ala Ala Ala Thr
195 200 205
Leu Pro Ile Ala Val Val Asn Gly Gly Asp Glu Pro Phe Val Glu Leu
210 215 220
Asp Phe Val Ser Lys Val Arg Phe Gly Asn Leu Trp Glu Gly Lys Ala
225 230 235 240
His Ile Ile Asp Gly Ala Gly His Ala Pro Phe Arg Glu Thr Pro Ala
245 250 255
Val Phe Asp Ala Tyr Leu Glu Arg Phe Met Arg Asp Cys Thr Val
260 265 270
