一种利用与RNAi工程菌混配提高Bt杀虫活性的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种利用与RNAi工程菌混配提高Bt杀虫活性的方法。本发明选取表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的苏云金芽孢杆菌工程菌8010AKi和BMB171AKi，将工程菌分别与苏云金芽孢杆菌8010按比例10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和0:10混合，与饲料混合后喂饲小菜蛾。期望得到一种能够通过与RNAi工程菌混配提高苏云金芽孢杆菌8010杀虫活性的方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性芽孢杆菌，在芽孢形成的同时在菌体一端或两端产生具有杀虫活性的伴胞晶体，且伴胞晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有杀毒活性(Wight et al., 2002)，是目前应用最广泛，研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。虽然Bt杀虫剂具有对人畜安全无害、不污染环境，有一定的特异性和选择性的杀虫作用等优点，但也存在稳定性差、残效期短、杀虫谱窄等问题，严重影响了Bt的实际应用。为克服常规Bt制剂的不足，除不断筛选新杀虫活性的菌株和基因、诱变育种、改进发酵工艺和使用增效剂等方法外，利用基因工程和蛋白质工程对菌株进行改造，构建杂种基因或工程菌，也是重要的方向。这些方法或提高杀虫的效率、或扩大杀虫的范围、或延长有效的时期，亦或增强制剂的效能，为Bt实现更广泛更有效的应用提供了可能。
RNA干扰(RNAi)的概念是由Fire提出的，是指双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导同源mRNA沉默的现象(Fire et al., 1998)。RNAi技术作为一种基因调控的有效手段，目前已被广泛的应用于昆虫功能基因组学和害虫防治等的研究(胡少茹等,2019)。在早期的RNAi研究中，一般是通过注射、混合食料饲喂等方式实现基因沉默的效果，但是这些方式在田间害虫防治中的应用比较困难。随后就出现了利用植物、细菌等为载体，通过这些载体表达害虫重要基因的dsRNA，被害虫取食后导致害虫重要基因被抑制而死亡，从而达到防治害虫的目的(Mao et al., 2007; Tian et al., 2009)。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种利用与RNAi工程菌混配提高Bt杀虫活性的方法，从而提高Bt对小菜蛾的毒杀能力，为更好地应用RNAi技术防治害虫以及提高Bt对害虫的毒杀能力提供一种新的策略。
本发明的技术方案如下：
1)活化Bt 8010和Bt的RNAi工程菌，挑取单克隆，于LB液体培养基中过夜培养，稀释至1OD;
2)将步骤1)中得到的菌液，按照一定比例混合;
3)将小菜蛾人工饲料分别浸泡在步骤2)中混配后的菌液里2 h，取出自然晾干;
4)用步骤3)得到的饲料喂饲小菜蛾，观察并统计小菜蛾的死亡情况、蛹重，并利用RT-qPCR检测小菜蛾精氨酸激酶基因的表达量。
步骤1)中的Bt的RNAi工程菌为能够产生小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的苏云金芽孢杆菌工程菌8010AKi和BMB171Aki。Bt 8010AKi和BMB171AKi都含有人为导入的一个质粒pHT305AKR2，该质粒是在质粒pHT305a的BamHI和PstI酶切位点之间插入小菜蛾精氨酸激酶基因的部分DNA序列，并突变了pHT305a骨架上自带的SphI酶切位点得到的重组质粒，命名为质粒pHT305AKR2，质粒序列见SEQ ID NO.1。
步骤2)中的比例为Bt 8010和Bt的RNAi工程菌体积比10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和0:10。
步骤4)中的小菜蛾为中科院动物所赠送的饲料品系小菜蛾。
步骤4)中RT-qPCR检测使用的内参基因是小菜蛾RPL32基因，基因的相对表达水平的计算采用2-ΔΔCT方法。
本发明的积极效果如下：
本发明选取能够干扰小菜蛾精氨酸激酶基因的苏云金芽孢杆菌工程菌8010AKi和BMB171AKi，将工程菌分别与Bt 8010按比例10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和0:10混合，与饲料混合后喂饲小菜蛾。试验表明当Bt 8010与8010AKi以9:1的比例，与BMB171AKi以7:3的比例混合喂饲小菜蛾，均能显著提高Bt 8010对小菜蛾的致死效率，二者小菜蛾的死亡率分别达到了68.9%和73.1%，说明按一定比例的混配确实能提高Bt的杀虫活性，这为今后应用Bt生物农药制剂拓展了方向，同时也为应用RNAi工程菌提供了新思路。
附图说明
图1：工程菌中含有的pHT305AKR2质粒示意图。图中AKi为小菜蛾精氨酸激酶基因的部分DNA序列，是RNA干扰的靶标基因序列;pro3α(-)和pro3α(+)为启动子，PstI、SalI、SphI和BamHI分别是对应的酶切位点。
图2：小菜蛾取食Bt 8010和Bt的RNAi工程菌混配菌液后的死亡率。A为本发明具体实施例1中小菜蛾取食Bt 8010和8010AKi混配菌液后的死亡率。B为本发明具体实施例2中小菜蛾取食Bt 8010与BMB171AKi混配菌液后的死亡率。C为本发明具体实施例1和2中Bt8010分别与8010AKi和BMB171AKi按不同配比混合后，小菜蛾蛹的死亡数。D为本发明具体实施例1和2中Bt 8010分别与工程菌8010AKi和BMB171AKi按不同配比混合后，小菜蛾幼虫的死亡数。不同的小写字母分别表示8010:8010AKi和8010:BMB171AKi不同比率的混合物之间的显著差异。
图3：Bt 8010与Bt的RNAi工程菌混配对小菜蛾蛹重和PxAK表达量的影响。A为本发明具体实施例1中经8010:8010AKi不同配比处理的小菜蛾蛹重的变化。B为本发明具体实施例2中经8010:BMB171AKi不同配比处理的小菜蛾蛹重的变化。C为本发明具体实施例1中不同配比的8010:8010AKi处理的小菜蛾中PxAK的相对量表达。D为本发明具体实施例2中经8010:BMB171AKi不同比例处理的小菜蛾中PxAK的相对量表达。以PxRPL32为内参基因。不同字母表示不同比例混合物在同一时间内的显著差异(P < 0.05)。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。下述具体实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述具体实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1
1.挑取实验室保存的Bt 8010和已经构建好的8010AKi工程菌(即陈金芝硕士学位论文《苏云金芽孢杆菌介导的小菜蛾精氨酸激酶基因的RNA干扰》中的8010-AKi)，30℃ 200 rpm过夜培养后，用无菌水稀释至1 OD，然后按照体积比10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和0:10的比例混合 。
2.将小菜蛾的人工饲料切成约10 cm×10 cm×10 cm大小的方块，用混配后的菌液浸泡2 h，晾干。
3.取30头三龄小菜蛾饥饿处理4 h后，放于饲养盒中，放入晾干的饲料，每隔12 h记录统计小菜蛾的死亡个数，每隔24 h记录小菜蛾蛹的重量，人工饲料每隔24 h更换一次。每个处理3次生物学重复。
4.每隔24 h收集同样处理的小菜蛾，每次5头，3个生物学重复，-80℃保存，用于RT-qPCR检测。
5. 利用trans®公司的TRIzol® Up提取小菜蛾总RNA，再用该公司的反转录试剂盒将其反转录得到cDNA。根据小菜蛾核糖体蛋白L32(PxRPL32)基因序列(GenBank：NM_001309136)和小菜蛾精氨酸激酶基因序列(GenBank：HQ327310.1)，分别设计qPCR所需的引物对RF / RR和AKF / AKR。
RF：5’ - CAATCAGGCCAATTTACCGC - 3’
RR：5’ - CTGGGTTTACGCCAGTTACG - 3’
AKF：5’ - AGAACTGGGGTGATGTTGAGAC - 3’
AKR：5’ - CCTTCTCCTCCATCTCCTTGTA - 3’
用qPCR反应试剂盒检测各样品cDNA中精氨酸激酶基因和PxRPL32基因的表达情况，然后采用2-ΔΔCT方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。
6.小菜蛾死亡情况表明，132 h时七个处理组的小菜蛾死亡率存在显著差异(F =266.829, df1 = 8, df2 = 7, P = 0.000)，当Bt 8010与工程菌8010AKi以9:1的比例混合时小菜蛾的死亡率显著高于Bt 8010处理组和工程菌8010AKi处理组，达到了68.9%(图2A)，并且幼虫和蛹的死亡数均高于Bt 8010处理组(图2C & 2D)。
Bt 8010与工程菌8010AKi以9:1混合的处理组与Bt 8010处理组间的蛹重没有差异，但均显著低于8010AKi处理组和水处理组(F = 246.989, df1 = 8, df2 = 88, P =0.000，图3A)。RT-qPCR检测基因表达情况表明，在48 h时，Bt 8010与8010AKi以9:1混合的处理组表达量显著低于水对照组(图3C)。
综上所述，当Bt 8010与其工程菌8010AKi以9:1混合，可以提高Bt 8010对小菜蛾的毒杀作用。
实施例2
1.挑取实验室保存的Bt 8010和已经构建好的BMB171AKi工程菌(即陈金芝硕士学位论文《苏云金芽孢杆菌介导的小菜蛾精氨酸激酶基因的RNA干扰》中的BMB171-AKi)，30℃ 200rpm过夜培养后，用无菌水稀释至1 OD，然后按照体积比10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和0:10的比例混合 。
2.将小菜蛾的人工饲料切成约10 cm×10 cm×10 cm大小的方块，用混配后的菌液浸泡2 h，晾干。
3.取30头三龄小菜蛾饥饿处理4 h后，放于饲养盒中，放入晾干的饲料，每隔12 h记录统计小菜蛾的死亡个数，每隔24 h记录小菜蛾蛹的重量，人工饲料每隔24 h更换一次。每个处理3次生物学重复。
4.每隔24 h收集同样处理的小菜蛾，每次5头，3个生物学重复，-80℃保存，用于RT-qPCR检测。
5. 利用trans®公司的TRIzol® Up提取小菜蛾总RNA，再用该公司的反转录试剂盒将其反转录得到cDNA。根据小菜蛾核糖体蛋白L32(PxRPL32)基因序列(GenBank：NM_001309136)和小菜蛾精氨酸激酶基因序列(GenBank：HQ327310.1)，分别设计qPCR所需的引物对RF / RR和AKF / AKR。
RF：5’ - CAATCAGGCCAATTTACCGC - 3’
RR：5’ - CTGGGTTTACGCCAGTTACG - 3’
AKF：5’ - AGAACTGGGGTGATGTTGAGAC - 3’
AKR：5’ - CCTTCTCCTCCATCTCCTTGTA - 3’
用qPCR反应试剂盒检测各样品cDNA中精氨酸激酶基因和PxRPL32基因的表达情况，然后采用2-ΔΔCT方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。
6.小菜蛾死亡情况表明，132 h时七个处理组的小菜蛾死亡率存在显著差异(F =868.104, df1 = 8, df2 = 7, P = 0.000)，当Bt 8010与工程菌BMB171AKi以7:3、9:1和1:9的比例分别混合时小菜蛾的死亡率显著高于Bt 8010处理组和工程菌BMB171AKi 处理组，其中以7:3的死亡率最高，达到了73.1%(图2B)。虽然各个处理组间幼虫的死亡数均没有显著差异，但Bt 8010与工程菌BMB171AKi以7:3、9:1和5:5的比例混合的处理组的蛹死亡数均高于Bt 8010处理组(图2C & 2D)。
各个处理组间的蛹重虽都没有显著差异，但均显著低于水处理组(F = 334.441,df1 = 7, df2 = 88, P = 0.000，图3B)。RT-qPCR检测基因表达情况表明，Bt 8010工程菌BMB171AKi以1:9混合的处理组和BMB171AKi处理组精氨酸激酶基因的表达量虽未低于水对照组，但在24 h和72 h均低于Bt 8010处理组(图3D)。
综上所述，当Bt 8010与BMB171AKi以7:3混合，可以提高Bt 8010对小菜蛾的毒杀作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种利用与RNAi工程菌混配提高Bt杀虫活性的方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9013
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatcctcca aagttggaga gtgagtttta tgtcgcaaat attaatgttt ctggtgaacc 60
ttatcaaatt ttcgttgatt taatagaaac atagcggtaa aattagcagt aacttaatag 120
aacggaaatg aaaaaagcca ctctcatatg ctattggcta ccaaccttta gcgagaatga 180
cttaatcctg tacagccata caggacttcg acttataaga ggcgccaacc tcaaataagt 240
tatttgcctt gttttcgcga acaaggctta ttagatacac ctattgtacc gttactctac 300
gaatatttca actagtaatt actagcattg tcatatacat aataaaacgg atataaaagg 360
gcgttttcta tacctagaag tcttgtaaat gtacagggcg tttagatata gagaacgccc 420
tttttgtgtt ccgttccagt ggaagctacc actttaaaaa gatggtctag tgtagccaat 480
gcaggagagt acactcggat atcagttgtc gttgcattca actgtctgac gtaagcgagg 540
taaaggacac aagccttgca taaaacaagc ctacgggatg taaatcctaa taatgatgat 600
aaccaagacg ttagcggcaa aaagtgttgg gggttcaaaa taagacatga ttgtgcgact 660
ggagttaaac agttactcgt aagcggcgat catgacactg attcacggct attcttgtac 720
aagctttatt acaaggatat gcgggttata tagcgaatca cccgaaaggg aacggtgttg 780
ggcgtgagaa acgcaccgta cggcgcaata caatgccaat aagctatata cggacggtat 840
agtagttttg taagctataa ccgtttgtcg tcaatgcaac caatctcaat tcgagacctc 900
ggcatctaag ccagtacgaa tgagtgggcg ttttaacctc gtaaattttc aacaggggtt 960
actatgccca aaactacatt cagatttcct aacaaactcg ccagtatgaa aaccttaaga 1020
ccttaaagtc aagggatttg aaggatttta acctcgatta gcaaaaaatg tagagtactg 1080
aagcaactac cattaactaa gatagtgggg gattgaggaa gaatccagag ctgtttaaat 1140
caagtgaaag acaagatgaa attaaaagaa tagtgaaaga taggggagtg gttctctatg 1200
agaaaggaaa tggctagaga acaaaggcag cggtttattg atctattgtt agactttatg 1260
gtaaagaatc ctcatttatt tgttaatggt acagaggatg aaagtaataa tgttgttaca 1320
aaatgtaata gtgatattaa agaggttgcg gagtcatatt taactctttt atagtgagag 1380
ggttaaaact aattaatatg tattaaggcc caatgttgga attattgtat ttcactaggc 1440
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gtcaatataa aaagccatcc gtaaaaaacg gatggcttac cgtacatagg atcgttggta 1620
gggcggcgta tcctacatct ctggtaactt acctagccaa tcaaatgctt gagaacggcg 1680
gttagataag cgcgtgggga acctttccca cctcaaagat cctatatcat tattatgtta 1740
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gtctttgtaa gcaattaaac gtccactatt caatcgtctt tggattttcg caggaccgtt 1860
ttttagatcg aacatagttg ataagaacaa ataaccgctt gggtccaact ttatagcaat 1920
tagtatatgg tcatttaaaa tctttaccaa ttcaacgcta ttaggttctt taggattttg 1980
cccgacatag tcggggtgtt caacgatatc ttttatgtgc gatgaatatt tttcataaat 2040
accaggatgt tgtttcttta cgtgctttat aaatccggga aacattttta catcgttaga 2100
agtgcaagtc aagttatatg tatctataat gatttgtgga agttttgcca caacagttgg 2160
tttatttaca atcttttttt tattagccgt caaatttctc cctcatctcg tctctttata 2220
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ttaaaactga acattcgtgt cactttaatt caccaagata ttctacagtt tcaattccct 3240
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cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 4440
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ccatgattac gccaagcttg tatgcctgca ggaaattagt tatacaagca ttttgtaaga 5940
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