一种噬菌体包衣保护剂、噬菌体包衣固体制剂及其应用
技术领域
本发明涉及噬菌体剂型技术领域，尤其涉及噬菌体包衣保护剂、噬菌体包衣固体制剂及其应用。
背景技术
噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，只能寄生生活，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体存在。
相较于抗生素，噬菌体具有使用安全、无副作用不容易诱发耐药性病原菌的诸多优点，在众多领域具有很好的应用前景；但由于其噬菌体的自身特性限制了其在各领域的应用，如：首先，固体噬菌体制剂的耐高温性能较差，因而在某些饲料加工等方面却不可避免的容易出现由于加工温度过高容易失活、难以发挥作用的问题。其次，固体噬菌体制剂不易保存，在室温下噬菌体效价下降快、易吸湿，这都严重影响噬菌体的广泛应用。
虽然目前已出现噬菌体保护剂，用于改善噬菌体的耐高温性能和储存稳定性，但是配方过于复杂，成本高，且改善程度不太理想。因此还需要进一步开发出更有效的新噬菌体保护剂。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种配方简单、性能优异的新型噬菌体包衣保护剂，以及采用该保护剂制备的噬菌体包衣固体制剂及其应用。
本发明的技术方案具体如下：
首先，本发明提供一种噬菌体包衣保护剂，其主要是由以下质量百分含量的各成分制备而成：10～15％的羟丙基甲基纤维素、5～10％的多元醇、4～8％的羧甲基淀粉钠，余量为改性淀粉。
上述包衣保护剂中，羟丙基甲基纤维素、多元醇、羧甲基淀粉钠和改性淀粉的相互配合作用原理为：多元醇溶于水，沸点较高常作为热稳定剂、增塑剂、表面活性剂等，能够较好地保护噬菌体喷干粉效价稳定性；羟丙基甲基纤维素对防吸湿有较好的效果，作为药片、药粒的成型粘合剂，粘合同时崩解性良好；羧甲基淀粉钠作为一种高效崩解剂在耐酸碱、耐温性等方面作用同样显著，适当比例的羧甲基淀粉钠的加入可以大大增加制粒在水溶液中的溶解性。通过上述多种成分制备的保护剂，不仅使噬菌体制粒既可以耐受饲料颗粒加工过程中的高温高压环境，又可以提高其在水中的溶解性，赋予噬菌体制粒以优异的综合应用性能。
所述的噬菌体包衣保护剂中，所述多元醇选自丙三醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇或乙二醇等多元醇中的一种。优选的，多元醇采用山梨醇。
优选地，所述噬菌体包衣保护剂由以下质量百分含量的各成分制备而成：羧丙基甲基纤维素12％、多元醇6％、羧甲基淀粉钠7％、改性淀粉75％组成。这种配方制成的噬菌体包衣保护剂的综合性能(如温度稳定性、长期存储稳定性)最佳。
其次，本申请还提供一种噬菌体包衣固体制剂，其包括噬菌体丸芯以及包裹在丸芯外层的包衣层，其中，噬菌体丸芯主要是由固态噬菌体粉和水溶性淀粉组成；所述包衣层采用上述噬菌体包衣保护剂制备而成。所述固态噬菌体粉可为喷干粉、冻干粉等噬菌体粉状制剂。
优选地，98％以上的上述固体制剂的粒径粒径均为30～90目。
所述噬菌体包衣固体制剂中，所述噬菌体制剂采用的噬菌体为大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体中的一种或可复配的多株不同噬菌体。
此外，本申请还提供上述噬菌体包衣固体制剂作为动物养殖领域的饲料添加剂、环境消毒剂以及兽药或其原料的应用。具体地，该噬菌体包衣固体制剂可直接作为动物养殖领域的饲料添加剂、环境消毒剂以及兽药进行使用，用于致病菌的抑菌应用；或者，可将上述噬菌体包衣固体制剂作为原料，用于进一步复配或剂型加工，制备进一步性能更优化的饲料添加剂、环境消毒剂以及兽药。
最后，本申请还提供一种上述噬菌体包衣固体制剂的制备方法，其包括以下步骤：
按照上述配方，将固态噬菌体粉与水溶性淀粉进行均质混合，混合5min 以上，混匀后加入质量百分含量为1～2％的纯净水混匀，混合8min以上；优选地，固态噬菌体粉中噬菌体的效价约为1010PFU/g；
将得到的混合物通过摇摆或挤压形成粒径约为30-90目的颗粒，进行间断性烘干，保持颗粒含水量在8％以下，再进行过筛，收集30-90目的颗粒，得到噬菌体丸芯；
将相应重量的改性淀粉、羟丙基甲基纤维素、多元醇和羧甲基淀粉钠按照配方比例进行混合溶解后得到包衣保护液；
利用所述包衣保护液对噬菌体丸芯进行流化包衣，使噬菌体丸芯增重 8～10％，完成包衣后，进行过筛，得到噬菌体包衣固体制剂。
优选地，所述流化包衣的条件为：进风温度控制在30～50℃，出风温度控制在25～30℃，蠕动泵的转速为110～130rpm/min；喷枪压力为0.3～0.4Mpa。
优选地，固态噬菌体粉与水溶性淀粉的质量比为10:1。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的噬菌体包衣保护剂的配方简单，原料容易收集，成本低廉，极大地降低了噬菌体包衣固体制剂的加工成本。制备的噬菌体包衣固体制剂的稳定性得到增强，其耐热，耐酸碱，吸水性等方面显著改善，且在储藏过程中的效价变化幅度小，保证了噬菌体制剂的有效活性，显著延长噬菌体制剂的使用寿命。
2、所述包衣保护剂大幅度地提高噬菌体的耐高温性能及水溶性能，如添加了5-10％包衣保护剂的噬菌体产品在90℃条件下的耐温效果显著高于不添加包衣保护剂的普通颗粒噬菌体产品，其中增重量在8-10％的制粒噬菌体收率可以高达70％；噬菌体包衣固体制剂的水溶解性能好，增重8-10％的固体制剂在水中的溶解时间在10分钟以内。
3、所述噬菌体包衣固体制剂的制备方法简单，周期短，可适用于自动化生产工艺；所述噬菌体包衣固体制剂的稳定性高，用途广，可直接作为动物养殖领域的饲料添加剂、环境消毒剂以及兽药或作为其原料进行广泛应用。
附图说明
图1为不同保护剂配方对沙门氏菌噬菌体耐温性的影响；注：不同字母表示差异显著(P≤0.05)
图2为不同保护剂配方对沙门氏菌噬菌体4℃储藏期间效价的影响；
图3为不同保护剂配方对沙门氏菌噬菌体37℃储藏期间效价的影响；
图4为包衣增重10％对不同种类噬菌体收率的影响；
图5为包衣保护剂对不同噬菌体制粒90℃处理10分钟收率的影响；注： **表示差异极显著(P≤0.01)；
图6为包衣保护剂对不同噬菌体制粒90℃处理60分钟收率的影响；注： **表示差异极显著(P≤0.01)；
图7为不同温度下长期保藏对大肠杆菌噬菌体包衣制粒效价的影响；
图8为不同温度下长期保藏对沙门氏菌噬菌体包衣制粒效价的影响；
图9为不同温度下长期保藏对金黄色葡萄球菌噬菌体包衣制粒效价的影响；
图10为不同温度下长期保藏对副溶血弧菌噬菌体包衣制粒效价的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体包衣固体制剂的制备
1、本实施例提供一种噬菌体包衣保护剂，其由以下质量百分含量的各成分制备而成：羟丙基甲基纤维素12％、多元醇6％、羧甲基淀粉钠7％、改性淀粉75％组成。
2、本实施例还提供利用上述保护剂制备的噬菌体包衣固体制剂，其制备方法为：
(1)将固态噬菌体粉与水溶性淀粉按照10:1的质量比进行混配，添加1％的纯净水进行混匀，混合时间为8min；
(2)将上述预混物质摇摆制粒后进行抛圆处理，制成大小约30-90目的制粒，机器运转过程中注意散热防止温度过高；
(3)将上述制粒进行间断性烘干，烘干过程中注意烘干温度控制在 30～40℃之间，使水分含量在8％以下，得到噬菌体丸芯；
(4)将改性淀粉、羟丙基甲基纤维素、多元醇和羧甲基淀粉钠按照本实施例的配方比例进行混合溶解，对上述产物进行流化包衣，使颗粒质量增重至原质量的10％；
(5)对包衣后的制粒进行过筛处理，粒径控制在30-90目之间，所得产品即为耐温水溶噬菌体包衣固体制剂。
其中，所述流化包衣的条件为：进风温度控制在40℃，出风温度控制在 25～30℃，蠕动泵的转速为120rpm/min；喷枪压力为0.35Mpa。
实施例2噬菌体包衣固体制剂的制备
1、本实施例提供一种噬菌体包衣保护剂，其由以下质量百分含量的各成分制备而成：羟丙基甲基纤维素10％、多元醇5％、羧甲基淀粉钠4％，余量为改性淀粉(81％)。
2、本实施例还提供利用上述保护剂制备的噬菌体包衣固体制剂，其制备方法为：
(1)将固态噬菌体粉与水溶性淀粉按照10:1的质量比进行混配，并添加2％的纯净水进行混匀，混合时间不低于8min；
(2)将上述预混物质摇摆制粒后进行抛圆处理，制成大小约30-90目的制粒，机器运转过程中注意散热防止温度过高；
(3)将上述制粒进行间断性烘干，烘干过程中注意烘干温度控制在 30～40℃之间，使水分含量在8％以下，得到噬菌体丸芯；
(4)将改性淀粉、羟丙基甲基纤维素、多元醇和羧甲基淀粉钠按照本实施例的配方比例进行混合溶解，对上述产物进行流化包衣，使颗粒质量增重至原质量的9％；
(5)对包衣后的制粒进行过筛处理，粒径控制在30-90目之间，所得产品即为耐温水溶噬菌体包衣固体制剂。
其中，所述流化包衣的条件为：进风温度控制在30℃，出风温度控制在 25℃，蠕动泵的转速为110rpm/min；喷枪压力为0.3Mpa。
实施例3噬菌体包衣固体制剂的制备
1、本实施例提供一种噬菌体包衣保护剂，其由以下质量百分含量的各成分制备而成：羧丙基甲基纤维素15％、多元醇10％、羧甲基淀粉钠8％，余量为改性淀粉(67％)。
(1)将固态噬菌体粉与水溶性淀粉按照10:1的质量比进行混配，并添加2％的纯净水进行混匀，混合时间不低于8min；
(2)将上述预混物质摇摆制粒后进行抛圆处理，制成大小约30-90目的制粒，机器运转过程中注意散热防止温度过高；
(3)将上述制粒进行间断性烘干，烘干过程中注意烘干温度控制在 40～50℃之间，使水分含量在8％以下，得到噬菌体丸芯；
(4)将改性淀粉、羟丙基甲基纤维素、多元醇和羧甲基淀粉钠按照本实施例的配方比例进行混合溶解，对上述产物进行流化包衣，使颗粒质量增重至原质量的8％；
(5)对包衣后的制粒进行过筛处理，粒径控制在30-90目之间，所得产品即为耐温水溶噬菌体包衣固体制剂。
其中，所述流化包衣的条件为：进风温度控制在50℃，出风温度控制在 30℃，蠕动泵的转速为130rpm/min；喷枪压力为0.4Mpa。
对比例1噬菌体包衣固体制剂的制备
1、本实施例提供一种噬菌体包衣保护剂，其由以下质量百分含量的各成分制备而成：12％聚乙二醇、多元醇6％、羧甲基淀粉钠7％、改性淀粉75％组成。
2、本实施例还提供利用上述保护剂制备的噬菌体包衣固体制剂，其制备方法具体参照实施例1。
对比例2噬菌体包衣固体制剂的制备
1、本实施例提供一种噬菌体包衣保护剂，其由以下质量百分含量的各成分制备而成：羟丙基甲基纤维素12％、多元醇6％、海藻酸钠7％、改性淀粉75％组成。
2、本实施例还提供利用上述保护剂制备的噬菌体包衣固体制剂，其制备方法具体参照实施例1。
实施例4(测试实施例)
1、实验方法：分别按照实施例1～3、对比例1～2的方法对沙门氏菌固态噬菌体粉(采用的是沙门氏菌噬菌体SPP11)进行保护处理，得到5组沙门氏菌噬菌体的固体制剂，并以未进行任何处理的固体噬菌体喷干粉作为对照组。对6 组噬菌体制剂同时进行耐温性实验、耐酸碱性实验以及长期保存实验。
(1)耐温性实验测试方法：将每组的噬菌体制剂分别置于90℃鼓风干燥箱中分别处理10分钟60分钟后，各取1g制粒充分溶解于9mLSM液中，比较不同包衣配方对噬菌体收率(％)的影响。其中，噬菌体收率计算中以未进行加热处理的包衣制粒效价作为原始效价。
(2)耐酸碱性实验测试方法：将每组的噬菌体制剂分别置于1mLSM缓冲液中，使其噬菌体效价均达到1×1010pfu/mL，调节pH值分别为2、4、6、8、 10，混匀，37℃作用2h，作用时间结束后取出，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价。
(3)长期保存实验测试方法：将每组的噬菌体制剂分别储存于4℃冰箱和37℃培养箱中，每30天取样一次进行检测计算噬菌体效价变化情况。
2、实验结果：
2.1耐温性实验测试结果分析
如图1所示，90℃条件下处理10分钟时，对照组噬菌体收率只有50％，而各对比例与实施例噬菌体收率均在70％以上，且实施例1收率最高可以达到92％，实施例1-3的噬菌体收率远高于对比例1-2；当处理时间为60分钟时，对照组的收率最低，其次是对比例1-2，而实施例1-3的噬菌体基本都在 80％以上，显著高于对比例1-2；其中，实施例1的噬菌体收率最高，可以达到85％，这说明实施例1制备的噬菌体包衣保护剂的耐温效果最好。
2.2耐酸碱性实验测试的结果及分析
表1不同保护剂配方对沙门氏菌噬菌体耐酸碱度的影响
注：数据表示为平均值+标准误，单位为log PFU/mL。
如表1所示，沙门氏菌噬菌体在pH为6的条件下最为稳定，随着pH的升高或降低，对照组的噬菌体呈现明显的降低趋势，尤其是当pH为2或10 时，对照组的噬菌体已完全失活；实施例1-3中的噬菌体的效价受PH的影响较小，当pH为2或4时，实施例1～3的噬菌体的效价依然保持较高，噬菌体保护剂大幅度地提高了噬菌体的PH稳定性，且对噬菌体的保护效果明显高于对比例1-2及对照组，其中，实施例1的保护效果最佳。
2.3长期保存实验测试结果分析
如图2和图3所示，4℃保藏条件下，各组中的噬菌体效价整体呈现下降的趋势，37℃条件下与4℃条件下的下降趋势基本一致，但总体下降幅度较4℃变化更大。通过对比可知：对照组下降得最快，在保存180天时，噬菌体效价下降2个log值。4℃条件下，实施例1的噬菌体效价下降幅度较小，实施例2与实施例3变化趋势基本一致，3个实施例的噬菌体效价的下降幅度都明显优于对照组，而对比例1对比例2较实施例1的下降幅度更大，显然对比例1-2的保护剂的长期保护效果不如实施例1-3。
实施例5不同包衣增重对制粒耐温性的影响实验 1、实验方法：
按照实施例1的配方及工艺条件制备几组各时间段增重量不同(即包衣厚度不同)的包衣制粒，实验设置具体见下表1。将每组的包衣制粒分别置于 90℃鼓风干燥箱中处理5分钟后，各取1g制粒充分溶解于9mLSM缓冲液中，比较不同包衣厚度对噬菌体收率(％)的影响。其中，噬菌体现存效价为不同包衣增重的噬菌体效价，噬菌体原始效价为经过制粒抛圆烘干等处理的噬菌体效价。试验结果如表1所示。
噬菌体收率的测定方法为：
表2不同制粒增重量对制粒收率的影响
2、实验结果及分析：
通过以上试验结果发现：与未经包衣处理的噬菌体制粒相比较，经过包衣处理后的噬菌体制粒的耐高温性能显著增强。当增重量达到8～12％，噬菌体收率较高，可以达到70％以上；但当增重量达到12％时，包衣时间已超过4 小时，包衣时间较长；当包衣厚度超过10％以后，随着包衣厚度的增加，噬菌体收率未见明显增加，因此，基于加工效率、成本和收率的综合考虑，制粒增重量10％是噬菌体包衣固体制剂的最佳厚度设置。
实施例6不同菌株包衣制粒实验
参照实施例1的方法，基于10％的包衣增重量对大肠杆菌噬菌体PD06(保藏编号为CGMCC NO.16390，2018年9月26日保存)、沙门氏菌噬菌体SPP11 (保藏编号为CGMCCNO.18868，2019年11月4日保存)、金黄色葡萄球菌噬菌体SA2(保藏编号为CGMCC NO.14331，2017年7月27日保存)、副溶血弧菌噬菌体PG07(保藏编号为CGMCC NO.16392，2018年9月26日保存)分别制备不同菌株的包衣制粒，并分别进行收率测定。其中，噬菌体收率计算中以固态噬菌体粉效价作为原始效价。上述噬菌体均被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址均为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述包衣制粒可应用于各种不同种类的噬菌体，本实施例中，仅以上述四株不同的噬菌体作为不同种噬菌体的代表进行举例说明。
图4结果表明：当噬菌体制剂包衣增重10％时，各噬菌体收率都可以达到 70％以上；其中，沙门氏菌噬菌体收率最高，达到90％。综合分析，选择10％的包衣增重量作为后续各噬菌体进行包衣的最适包衣厚度。
实施例7包衣制粒后噬菌体的耐酸碱度检测 1、实验方法：选取实施例6制备的四种噬菌体包衣固体制剂进行实验。操作方法为：将每组的噬菌体制剂分别置于1mL缓冲液中，使其噬菌体效价均达到1×1010pfu/mL，调节pH值分别为2、4、6、8、10，混匀，37℃作用2h，作用时间结束后取出，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价。
2、实验结果及分析：
表3保护剂对大肠杆菌噬菌体耐酸碱度的影响
注：数据表示为平均值+标准误，单位为log PFU/mL。
表4保护剂对沙门氏菌噬菌体耐酸碱度的影响
注：数据表示为平均值+标准误，单位为log PFU/mL。
表5保护剂对金黄色葡萄球菌噬菌体耐酸碱度的影响
注：数据表示为平均值+标准误，单位为log PFU/mL。
表6保护剂对金黄色葡萄球菌噬菌体耐酸碱度的影响
注：数据表示为平均值+标准误，单位为log PFU/mL。
如表3-6所示，从对照组的结果可知，酸碱度对未经任何处理的噬菌体效价影响较大，而当处于pH偏酸或偏碱的条件下时，噬菌体的活力很快丧失，无法检测。而进行包衣处理的实验组中的噬菌体在不同PH环境下仍保留活性，与对照组相比，包衣保护剂对噬菌体制剂的耐酸碱能力有较高的提升作用。此外，上述不同噬菌体的实验也说明上述保护剂对不同噬菌体均具有较好的保护作用。
实施例8包衣制粒后噬菌体耐温性检测
1、实验方法：
选取实施例6制备的四种噬菌体包衣固体制剂进行实验。取不同种类噬菌体制粒5克作分别作为实验组，以固体噬菌体喷干粉作为对照。90℃条件下分别处理10分钟、1小时。凉至室温后取1克溶解于9mLSM液，进行效价检测，同时检测未经高温处理的制剂制粒，计算高温处理后噬菌体制剂收率。其中，噬菌体收率以未进行加热处理的包衣制粒作为原始效价。
2、实验结果及分析
如图5和图6的实验结果证明，与未经包衣处理的制剂相比，添加包衣保护剂的制粒在耐温性方面得到显著提升。添加包衣保护剂的制粒，经90℃处理10分钟后，噬菌体收率由35％提升至80～90％。而经90℃处理60分钟后，添加包衣保护剂的制粒的收率由13％提升至70～80％。噬菌体包衣固体制剂的耐温性能得到大幅度地提升。包衣后的噬菌体制粒可以解决饲料生产企业在饲料加工生产过程中反馈的噬菌体制粒不耐高温的问题。
实施例9噬菌体包衣固体制剂后长期保存实验
1、实验方法：
选取实施例6制备的四种噬菌体包衣固体制剂进行实验。取各噬菌体包衣固体制剂分别储存于4℃冰箱和37℃培养箱中，每30天取样一次进行检测计算噬菌体效价变化情况。效价测定方法为：取1克噬菌体包衣固体制剂溶解于9mL稀释液，通过双层平板法检测噬菌体效价。其中，固体噬菌体喷干粉作为对照，进行对比实验。
2、实验结果：
由图7-10的结果可知，与未经包衣处理的制剂相比，经过包衣处理的各噬菌体制剂在储藏期间的效价变化幅度较小，耐储藏。包衣保护剂对储藏期间的噬菌体活性有较好的保护作用，明显延长噬菌体的保藏时间。两种温度条件相比，噬菌体包衣保护剂处理后的噬菌体在4℃储藏比37℃储藏更加稳定；而相较其它三种噬菌体，沙门氏菌噬菌体制剂的储藏稳定性较好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
