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一种辣椒疫霉效应蛋白及其编码基因和应用

2021-02-02 05:48:00

一种辣椒疫霉效应蛋白及其编码基因和应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种辣椒疫霉效应蛋白及其编码基因和应用。

　　背景技术

　　辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是引起辣椒疫病的主要病原菌，我国引起辣椒疫病的病原菌属于藻物界(Chromista)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、霜霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)(付丽等，2012)。

　　辣椒疫病是侵染辣椒的主要病害之一,也称为黑痉病，是辣椒生产种植过程中的主要病害(张政兵等，2006；朱宗源等，1995)。辣椒疫病在全世界各地都有分布传播，其发生流行和侵染不受地理环境的制约，拉丁美洲、欧洲、亚洲等各大洲均有该病发生的相关报道(彭相儒等，1991)。美国、阿根廷、意大利、日本、韩国、俄罗斯、保加利亚、印度等十多个国家辣椒疫病发生普遍且给经济带来严重损失(魏玲玲等，1999)。我国从20世纪60年代初俞大绂在江苏省发现辣椒疫病以来，至今已在辽宁、上海、吉林、山东、新疆、湖南、湖北、内蒙古、甘肃、黑龙江、陕西、贵州、云南、广州等省(市)均报道过辣椒疫病的发生，且病害有逐年加重的趋势(GauLin et al.，2002)。辣椒疫病是一种毁灭性、创伤性的土传病害，在辣椒的整个生长发育期均可发病。辣椒疫霉病原菌可严重危害辣椒的根、茎、叶、花和果实，以茎节部和枝杈部发病较重，发病严重时至发病部位以上全部坏死折断(张政兵，2006)。辣椒疫病除可侵染辣椒外，还可危害西瓜、番茄、茄子、黄瓜等多种茄科及葫芦科等蔬菜作物。

　　在植物与病原菌长期的相互竞争中，植物已经进化出了能够识别效应物的抗性(R)蛋白，以抵御病原菌的侵染。植物的抗病过程是多种多样的(Hiller et al.，2004)。抗病性往往与植物对由无毒病原体产生的信号分子，即激发子的感知相关。这两种类型的抗性被用于培育马铃薯抗晚疫病种族特异性或垂直抗性水平或田间抗性水平的研究。垂直抗性基于基因与基因相互作用，其中病原体无毒基因的相互作用直接或间接识别植物的主要抗性基因(R基因)。过敏反应(HR)开启，感染的细胞与相邻细胞一起经历程序性细胞死亡。这可以防止生物病原体的进一步生长。水平或田间抗性称为第二类抗性而且是多基因型的。

　　细胞质中的效应物是组成两个主要功能结构域的模块化蛋白质，其由N端区域，有一段高度保守的序列基序(信号肽)和RxLR-dEER基序(精氨酸，任何氨基酸，亮氨酸，精氨酸)能够帮助分泌和转移到植物细胞内。另一个是携带RxLR结构域转运效应因子的C端结构域。RxLR区域在分泌和靶向中起作用，并且C-末端结构域携带效应因子活性并在植物细胞内部起作用。致病疫霉分泌的RxLR效应物Avr3a能够抑制宿主细胞的过敏性细胞死亡。因此分泌效应蛋白的主要功能是抑制介导植物防御反应的细胞信号转导途径(Win et al.,2007；Bhattacharjee et al.,2006；Nunes et al.,2007)。

　　RxLR区域在分泌和靶向中起作用并且C端区域携带效应活性并在植物细胞内进行操作。CRN是具有由C-末端区域编码的效应物活性的模块化蛋白质。

　　RxLR效应因子具有模块化结构，包含信号肽，其后是相对保守的RxLR或RxLR变体(RxLR变体，例如KxLR或RxLK)基序，其在功能上分泌至宿主细胞中，而其余C-末端结构域携带效应子活性。另外，将近一半的RxLR效应子含有一个或多个由相邻的W，Y和L基序组成的重复模块。特别是大多数RxLR蛋白有广泛的序列分歧，并且与其他已知蛋白缺乏相似性(Guo etal.,2009)。内在无序的蛋白质区域是在生理条件下缺乏稳定的二级或三级结构的柔性片段。蛋白质内柔性片段的存在在自然界中是常见的，并且与原核蛋白质组相比，真核蛋白质组显示具有更高程度的无序蛋白质出现。无序蛋白质具有它们各自的生物学功能，其通常与信号转导，识别和转录调节有关(卢光莹等，1994)。目前为止，已经解析了几类RxLR效应子的晶体结构，包括来自H.arabidopsidis的ATR1和ATR13，来自辣椒疫霉，致病疫霉PexRD2和大豆疫霉Avh5的Avr3a4和Avr3a11等。但是现有的技术中针对辣椒疫霉中的效应蛋白的研究并不完善，其致病机理和对细胞死亡机制的影响并不明确。

　　发明内容

　　本发明针对现有技术的不足提供一种辣椒疫霉效应蛋白RxLR98344及其编码基因和应用。

　　本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为A1)或A2)，其中：

　　A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

　　A2)氨基酸序列是序列表1中第22-185位的蛋白质。

　　其中，所述蛋白质的来源为辣椒疫霉。

　　本发明还提供了与上述任一所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

　　B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

　　B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

　　B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

　　B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

　　B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

　　B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

　　B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

　　进一步，B1)所述核酸分子为核苷酸为如下B11)或B12)，其中：

　　B11)序列表中序列2的核苷酸组成的cDNA分子或DNA分子；

　　B12)序列表中序列2中第64-555位的核苷酸组成的cDNA分子或DNA分子.

　　本发明还提供一种抑制bax引起的植物细胞死亡的方法，在目标植物中表达如所述的蛋白质。

　　进一步，所述方法中，在目标植物中表达如所述的蛋白质的方法为向目标植物中导入编码所述蛋白质的核酸分子。

　　进一步，在目标植物中表达如所述的蛋白质的方法为向目标植物转染含有编码所述蛋白质的核酸分子的重组菌。

　　所述的蛋白质、所述的生物材料或所述的方法在抑制bax引起的植物细胞死亡、制备抑制bax引起的植物细胞死亡产品、培育抗bax引起的植物细胞死亡的植物或者植物育种中的应用也应在本发明的保护范围内。

　　进一步，所述目标植物或者植物为单子叶植物或双子叶植物。

　　进一步，所述目标植物或者植物为本氏烟或者辣椒。

　　本发明的辣椒疫霉效应蛋白RxLR98344不能引起本氏烟叶片的细胞死亡，但能够抑制Bax引起的细胞程序行死亡。

　　附图说明

　　图1 RxLR98344基因PCR扩增图；

　　图2菌落PCR鉴定重组质粒的PCR扩增图。

　　图3 RxLR98344基因在本氏烟上的致病性功能分析验证图；

　　图4先后表达RxLR98344效应因子和Bax基因的本氏烟叶片照片。

　　具体实施方式

　　以下结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明，需要注意的是，以下内容仅用于解释本发明而非限定本发明。

　　实验材料列表

　　1.菌种和质粒

　　辣椒疫霉致病菌株SD33(辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)RxLR效应分子筛选及RxLR23的功能研究”文献中公开过，可以从山东农业大学植物保护学院蔬菜病虫害生物学省重点试验室获得)；Bax农杆菌菌株(在“辣椒疫霉6个RxLR和大豆疫霉1个CRN效应子的功能分析”文献中公开过，公众可以从南京农业大学窦道龙教授实验室获得)。Escherichiacoli DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、Rosetta(DE3)、农杆菌GV3101感受态及pEASY-T3clone Vector购自TransGen Biotech corporation公司(购自北京市海淀区永泰庄北路1号中关村东升国际科学园4号楼)；表达载体pET28a(购自北京索莱宝科技有限公司)，pBIN-GFP2载体(在“A Virulence Essential CRN Effector of Phytophthora capsiciSuppresses Host Defense and Induces Cell Death in Plant Nucleus”文献中公开过，公众可以从窦道龙教授实验室获得)，公众可以从窦道龙教授实验室获得)。

　　2.供试植物

　　本研究所使用的本氏烟种子(辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)RxLR效应分子筛选及RxLR23的功能研究”文献中公开过，公众可以从山东农业大学植物保护学院蔬菜病虫害生物学省重点试验室获得)。本氏烟适宜在恒温温室，温度22℃，16h光照，8h黑暗的条件下生长。

　　实施例1、辣椒疫霉效应蛋白RxLR98344的获得。

　　1、RxLR98344基因的获得

　　RxLR98344基因的克隆，以实验室保存的辣椒疫霉菌株SD33的cDNA为模板，用含有酶切位点保护碱基的引物RxLR98344-F和RxLR98344-R(引物序列如表1所示)扩增RxLR98344基因去信号肽部分的编码区序列(即序列2的第64-第555位)。PCR产物经10％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1中的1-3表示RxLR98344基因的编码基因，如图所示在500bp与750bp之间靠近500bp的地方有一条较亮的特异条带，与目的基因去信号肽部分的成熟蛋白的编码区域大小一致。

　　将PCR产物进行切胶并用试剂盒回收后，用NdeI和NotI双酶切并连接到酶切好的原核表达载体pET-28a上得到重组质粒pET28a-98344。将重组质粒pET28a-98344转入DH5α，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。电泳结果如图2所示，图2中1-8均为含重组质粒pET28a-98344的菌落的PCR电泳结果。如图所示在500bp与750bp之间靠近500bp的地方有一条较亮的特异条带，与目的基因去信号肽部分的成熟蛋白的编码区域大小一致。

　　进一步，将有条带的菌液送公司测序，测序结果表明，RxLR98344基因序列全长558bp其核苷酸序列如序列2所示，编码185个氨基酸其氨基酸序列如序列1所示。该蛋白预测21.0KDa，等电点PI约为10.02。蛋白质序列不含有半胱氨酸，说明该蛋白折叠结构较保守。经软件分析预测该蛋白N端21个氨基酸处有信号肽，即所述序列1中的第1-21位氨基酸为信号肽，第22-185位氨基酸为成熟蛋白，无跨膜区，说明既是外泌蛋白但不是膜蛋白，比较有利于蛋白纯化和结构解析。

　　表1引物

　　2、pEASY-T3重组载体构建

　　将步骤1中的PCR产物与pEASY-T3载体混合后接种至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养12-16小时后，得到pEASY-T3-RxLR98344重组载体。

　　3、pBIN-GFP2重组质粒的构建

　　以pEASY-T3-RxLR98344的DNA为模板，分别以RxLR98344-F-SmaI、RxLR98344-R-BamHI(序列如表2所示)为引物克隆RxLR98344基因，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，酶切后连接pBIN-GFP2载体，得到重组质粒pBIN-GFP2-RxLR98344。转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态，经菌落PCR及跑胶验证后送公司测序。测序结果表明重组质粒pBIN-GFP2-RxLR98344是将pBIN-GFP2的识别位点Kpn I和识别位点XbaI间的片段替换为RxLR98344成熟基因(编码序列表中序列1中的第22至185位氨基酸组成的成熟蛋白)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组质粒。

　　表2引物

　　农杆菌介导的辣椒疫霉RxLR98344瞬时表达

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR98344导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR98344。

　　实施例2RxLR98344基因的致病性分析

　　利用农杆菌-RxLR98344注射本氏烟，以空载(pBIN-GFP2)作为阴性对照，以INF1作为阳性对照，接种7d后，对接种叶片进行照相记录，并脱色处理，使症状更明显。结果如图3所示，图3是RxLR98344基因在本氏烟上的致病性功能分析图，图3中，1表示接种空载(pBIN-GFP2)的区域；2表示接种RxLR98344基因的区域；3.Buffer；4.接种INF1的区域。由图3可以看出，农杆菌-RxLR98344接种叶片后没有叶片没有坏死反应，从接种开始到7d后，整个过程中本氏烟叶片都没有任何明显的变化。白色的叶片代表的是酒精脱色的结果。

　　实施例3.RxLR98344基因抑制细胞死亡的分析

　　以空载GFP和缓冲液(Buffer)作对照，在本氏烟上瞬时表达RxLR98344基因:将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLR98344接种至本氏烟叶片上，瞬时表达小时后，相同的位置接种坏死基因Bax，对RxLR98344的抑制功能进行验证，接种7天后将合格的本氏烟叶片进行拍照记录，并用台盼蓝染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色处理，结果如图4所示。图4中，1表示接种pBIN-GFP2和Bax的区域，2表示接种RxLR98344和Bax的区域，3表示接种Buffer和Bax的区域。从图2中可以看出，先接种RxLR98344，24h后接种能够引起细胞死亡的基因Bax，RxLR98344可以有效的抑制Bax所引起的细胞程序性死亡。

　　在本发明中，利用含有pBIN-GFP2植物表达载体的农杆菌，在本氏烟叶片上有选择的瞬时表达辣椒疫霉RxLR98344以及能诱发植物细胞死亡的基因Bax。以验证辣椒疫霉RxLR98344对抑制植物细胞坏死的作用。pBIN-GFP2植物表达载体可以在本氏烟叶片上实现RxLR98344与其他基因的共表达。将转入重组质粒的农杆菌GV3101接种本氏烟叶片，在24h后在同一接种位置再接种分别含有INF1、Bax、CRN4的农杆菌，接种7d后照相。结果如图2所示。从图2中可以看出，先接种RxLR98344，24h后接种能够引起细胞死亡的基因Bax，发现本发明的辣椒疫霉效应蛋白RxLR98344可以抑制Bax所引起的细胞程序性死亡。

　　序列表

　　<110>山东农业大学

　　<120>一种辣椒疫霉效应蛋白及其编码基因和应用

　　<160>2

　　<170>SIPOSequenceListing 1.0

　　<210>1

　　<211>185

　　<212>PRT

　　<213>Phytophthora capsici

　　<400>1

　　Met Pro Val Lys Arg Gly Leu Arg Ala Asn Glu Glu Arg Ala Phe Gly

　　1 5 1015