一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用
技术领域
本发明属于植物抗逆性技术领域，具体涉及一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用。
背景技术
环境胁迫(Environmental stress)是指环境中作物受到各种不利影响因素的总称，如碱、盐渍、干旱、真菌等。其中，碱胁迫是对作物最具威胁性的逆境之一，它的特点是持续时间长、影响范围广等。据联合国教科文组织(UNESCO)和粮农组织(FAO)不完全统计，全世界盐碱面积为9.54亿公顷[2]。中国盐碱地面广量大，东北地区是苏打盐碱地最大的集中分布之一，面积高达765万公顷。其中，吉林省西部12个市县盐碱土面积为160多万公顷。植物作为固生生物，为了降低碱胁迫对其自身的危害，在长期进化过程中形成了一套完整的抵抗碱胁迫的机制。当遭受碱胁迫时，会启动相应的调控机制来适应这种不利的环境。植物的基因工程在近30多年的发展时间里显示出巨大的潜力，克隆耐碱胁迫相关基因和利用基因工程开展耐碱分子育种正呈现广阔的前景。
植物对碱胁迫的响应是多层次的、复杂的。目前植物响应碱胁迫的研究主要集中在模式植物拟南芥，发现了碱胁迫应答过程中将H+外排降低根际pH的关键功能蛋白AHA2和调控元件。水稻作为重要的粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口，水稻的生产对全球粮食安全具有重要的意义。种植水稻是高效利用盐碱地的有效途径之一，要使这一措施取得预期成效，需要在大力改土消除盐碱理化障碍的基础上，尽可能的挖掘水稻自身的耐盐碱潜力。而水稻中的耐碱胁迫基因研究进展缓慢，耐碱胁迫基因工程相对薄弱。分离水稻耐碱胁迫相关基因，用于水稻基因工程进行辅助育种和耐碱胁迫改良对有效控制碱胁迫对水稻的危害、提高水稻产量和改良水稻品质具有极其重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的耐碱胁迫的蛋白，即水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用。
本发明提供了一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明提供了一种水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了一种植物表达载体，含有所述的水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3。
优选的，所述植物表达载体以pCsV1300为基础载体，所述基因OsAHA3插入所述基础载体的为XbaI和BamHI的多克隆位点处。
本发明提供了一种用于扩增所述水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了所述OsAHA3、所述质膜H+-ATPase蛋白、所述植物表达载体或所述引物对在植物耐碱胁迫方面的应用。
本发明提供了所述OsAHA3、所述质膜H+-ATPase蛋白、所述植物表达载体或所述引物对在耐碱胁迫的转基因植物中的应用。
优选的，所述植物包括农作物、蔬菜和果树。
优选的，所述耐碱胁迫时，环境中碱溶液的pH值为8～12。
本发明提供了一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。本发明利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增基因OsAHA3的cDNA全长序列，将扩增产物与载体连接，得到植物表达载体，经农杆菌介导构建水稻遗传转化体系，对OsAHA3经过表达产生大量质膜H+-ATPase蛋白，经耐碱性测试，结果表明：与野生型Kitaake相比，OsAHA3过表达植株对碱胁迫的耐受性增强，OsAHA3过表达植株OsAHA3OX-1、OsAHA3OX-2和OsAHA3OX-3的存活率显著高于野生型Kitaake的存活率。
本发明提供了一种植物表达载体，含有所述的水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3。将所述植物表达载体经农杆菌介导构建水稻遗传转化体系，所述转化体系不仅具有较高的耐碱性，而且对转基因水稻中OsAHA3表达水平进行RT-qPCR检测，结果显示：与野生型相比，3个独立的OsAHA3过表达植株(OsAHA3OX-1、OsAHA3OX-2和OsAHA3OX-3)中OsAHA3的表达水平增加20倍以上。说明本发明提供的植物表达载体能够将OsAHA3过表达载体成功转化水稻。
附图说明
图1为遗传转化载体pCsV1300的结构示意图；
图2为转基因水稻植株与野生型Kitaake中水稻耐碱胁迫相关基因OsAHA3表达量检测结果示意图；
图3为转基因水稻植株与野生型Kitaake碱胁迫处理后的表型示意图；
图4为转基因水稻植株与野生型Kitaake碱胁迫处理后的存活率统计示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种由所述基因OsAHA3序列编码的质膜H+-ATPase蛋白，由956个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MAEKEGNLDAVLKEAVDLENIPLEEVFENLRCSREGLTTQQAQQRLEIFGPNKLEEKEESKFLKFLGFMWNPLSWVMEAAAIMAIALANGGGKPPDWQDFVGIITLLVINSTISFIEENNAGNAAAALMARLAPKAKVLRDGRWTEEEAAILVPGDIVSIKLGDIIPADARLLEGDPLKIDQSALTGESLPVTKGPGDGVYSGSTVKQGEIEAIVIATGVHTFFGKAAHLVDSTNQVGHFQKVLTAIGNFCICSIAVGMFVEIIVMYPIQHRAYRPGIDNLLVLLIGGIPIAMPTVLSVTMAIGSHRLSQQGAITKRMTAIEEMAGMDVLCSDKTGTLTLNKLTVDKNLIDVFERGITQDQVILMAARASRTENQDAIDTAIVGMLADPKEARAGIQEVHFLPFNPTDKRTALTYIDGDGKMYRVSKGAPEQILHLAHNKPEIERRVHAVIDKFAERGLRSLAVAYQEVPEGTKESPGGPWHFVGLMPLFDPPRHDSAETIRRALNLGVNVKMITGDQLAIGKETGRRLGMGTNMYPSSALLGQNKDESIAALPVDDLIEKADGFAGVFPEHKYEIVKRLQARKHICGMTGDGVNDAPALKKADIGIAVADATDAARSASDIVLTEPGLSVIISAVLTSRAIFQRMKNYTIYAVSITIRIVLGFMLLALIWKFDFPPFMVLIIAILNDGTIMTISKDRVKPSPLPDSWKLAEIFTTGVVLGGYLAMMTVIFFWAAYKTDFFPRIFHVESLEKTAQDDFQKLASAVYLQVSTISQALIFVTRSRSWSFVERPGFLLVFAFLVAQLIATLIAVYADWAFTSIKGIGWGWAGIVWLYNLIFYFPLDIIKFLIRYALSGKAWDLVIEQRIAFTRKKDFGKEERELKWAHAQRTLHGLQPPDAKMFSEKAGYNELNQMAEEAKRRAEIARLRELHTLKGHVESVVKLKGLDIETIQQSYTV)。
本发明提供了一种水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3，全长为3856bp，包括2871bp的开放阅读框(ORF)，240bp的5’UTR和745bp的3’UTR，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(atggctgagaaggagggcaacctcgacgccgtcctcaaggaggccgtcgacttggagaatattcccctcgaggaagtgtttgagaacctgagatgcagccgcgagggtctcacaactcagcaggcgcagcagcgcctcgaaatctttggccccaacaagcttgaggagaaggaggagagcaagttcctcaagtttttggggttcatgtggaatccactctcatgggtcatggaagctgcagctatcatggccattgcgctggcgaatggaggggggaagccaccggattggcaggactttgttggtatcataactcttcttgttatcaactcgacaatcagtttcattgaggaaaacaatgctggcaatgctgctgctgcactcatggcccgtcttgcaccaaaggccaaggtgcttcgtgatggccgatggactgaggaagaggcggccatccttgtaccaggggatatcgtaagtattaaacttggagacattatacctgcagatgcgcgtctccttgagggagatcctttgaagatcgatcagtctgccctgactggagaatcattgcctgtcaccaaaggtcctggtgatggtgtctattctggttcgactgtcaagcaaggtgagatcgaagccatagtgattgctactggtgttcacactttcttcggaaaagcagcacaccttgttgactcaactaaccaagttggtcatttccagaaggtcctgacggctattgggaatttctgcatttgctcaattgctgtgggaatgtttgttgagatcattgtaatgtaccctatccagcacagggcataccgccccgggattgacaacctccttgtccttctcattggaggcattcccatagccatgccaacagtcttatctgtgactatggcaattgggtcacaccgcttgtctcaacagggagcgatcacaaagagaatgactgcaattgaggagatggcgggcatggatgttctttgcagtgataaaactggaactttgaccttgaataagctcaccgtggacaagaacctcattgatgtctttgaaagaggaatcactcaggaccaagtgattctcatggctgctagagcatcacgaacagaaaaccaggatgctattgatactgcaatagttgggatgctagctgatccaaaagaggcccgtgctggtattcaagaagttcatttcctgccattcaatcctactgacaaaagaacagcattgacatacattgatggtgatggcaaaatgtatcgtgttagtaagggtgcacctgagcagattctccaccttgctcataacaaaccggagatagagcggagggtccatgctgtgattgacaaatttgcagaacgtggacttagatcgcttgctgtagcataccaggaagtaccagaggggacgaaagaaagccctggtggcccatggcattttgttggtctcatgccactttttgatcctccaaggcacgacagtgctgaaacaattcggcgggcacttaatcttggtgtcaatgtcaagatgatcacaggtgatcagctggcaattggaaaagaaacagggcgtcgcctgggaatgggtacaaacatgtacccttcatccgctttgctgggacagaacaaggatgagtccattgccgctttaccagttgatgatctcattgagaaagctgatggctttgctggtgtattcccagagcacaagtatgagattgtgaaacgtctgcaagcaagaaagcacatatgtggaatgactggtgatggtgtcaatgatgctccagccctaaagaaagctgacattggtattgctgttgctgatgcaactgatgcagccaggagtgcttcagatattgtgctcacagaacctggtcttagtgtgatcatcagtgctgtgcttacaagtcgtgcaattttccagcgtatgaagaactacactatctatgctgtctcaatcaccattcgtatagtgcttggatttatgctacttgcgctcatctggaaattcgatttccccccttttatggtcctaatcatagcaattctaaatgatggtaccatcatgactatatcaaaggatcgggtaaaaccatctccactacctgacagctggaagctggctgagatttttacaactggagttgtcctcggtggatacttggcaatgatgacagtaatcttcttctgggctgcatataagacagactttttcccgagaatatttcatgttgaaagccttgagaagacagctcaagatgatttccaaaaacttgcctctgctgtttacctccaagttagcaccatcagccaagctctcatctttgtcacaaggtcccgcagctggtcatttgttgagcgccctggatttctgctggtctttgctttcttggttgcacagctgattgctacactgattgctgtgtatgctgactgggcgttcacctcaatcaaaggcattgggtggggttgggctggtattgtgtggctctacaatctaatcttctacttcccactcgacattatcaagttcctcatcagatatgctttgagtgggaaagcatgggatcttgtcattgagcaaaggatcgctttcacaaggaagaaggactttggtaaggaggagagggagctcaagtgggcacatgctcagaggaccctccatggactgcagccgcctgatgccaagatgttctcggagaaggctggctacaatgagctcaatcagatggctgaagaggcgaagaggagggcggagattgccaggcttagggagctccatacgctcaaggggcatgtagaatcggttgtgaagctcaaaggcctcgacattgagaccatccagcagtcttacaccgtgtga)。
本发明提供了一种植物表达载体，含有所述的水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3。所述植物表达载体优选以pCsV1300为基础载体，所述基因OsAHA3插入所述基础载体的为XbaI和BamHI的多克隆位点处。
在本发明中，所述植物表达载体的制备方法优选包括以下步骤：根据水稻耐碱胁迫基因OsAHA3的CDS序列及双元表达载体pCsV1300多克隆位点的相关信息，设计引物加入相应的酶切位点以扩增OsAHA3基因；将经测序验证的、准确的水稻耐碱胁迫基因OsAHA3使用限制性内切酶XbaI和BamHI进行酶切，回收包含OsAHA3完整阅读框的DNA片段，将双元载体pCsV1300也用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切，将线性化的载体进行纯化回收，将回收的DNA片段连接到遗传转化载体pCsV1300的限制性内切酶酶切位点。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切验证。
本发明提供了一种用于扩增所述水稻耐碱胁迫相关的基因OsAHA3的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了所述OsAHA3、所述质膜H+-ATPase蛋白、所述植物表达载体或所述引物对在植物耐碱胁迫方面的应用。本发明实施例中，将水稻耐碱胁迫基因OsAHA3的核苷酸序列构建得到植物表达载体并转化水稻，通过含有Na2CO3的水稻营养液进行碱胁迫处理后观察转基因水稻的表型和存活率等，结果表明编码质膜H+-ATPase的基因OsAHA3可提高水稻对碱胁迫的忍耐性。
本发明提供了所述OsAHA3、所述质膜H+-ATPase蛋白、所述植物表达载体或所述引物对在耐碱胁迫的转基因植物中的应用。本发明所述应用对任何种类植物均适用，所述植物优选包括农作物、蔬菜和果树。为了举例说明，所述OsAHA3的耐碱性的生物学功能，在本发明实施例中，以水稻作为植物代表说明OsAHA3在植物中过表达及耐碱特性，但这不能理解为对本发明保护的技术方案的限制。
在本发明中，所述耐碱胁迫时，环境中碱溶液的pH值优选为8～12，更优选为10.5～11。在本发明中，耐碱胁迫的转基因植物的构建方法，优选采用所述引物对扩增得到所述OsAHA3，将所述OsAHA3、或所述植物表达载体导入植物愈伤组织细胞中，过表达所述质膜H+-ATPase蛋白，经过分化和生根获得转基因阳性植株。经潮霉素筛选及分子鉴定，获得纯合的T2代水稻转基因植株。对获得的纯合转基因水稻植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐碱胁迫的能力显著高于野生型Kitaake。
下面结合实施例对本发明提供的一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
水稻耐碱胁迫基因OsAHA3的克隆
1.RNA的提取
利用TRIzol reagent(Invitrogen,USA)提取水稻叶片的总RNA。
(1)取生长至三叶一心期的水稻Kitaake叶片，放入装有2粒钢珠的2ml管中，置于液氮中。
(2)使用组织破碎仪进行磨样，磨样所需适配器需放入液氮中提前进行预冷，将装有样品的管子装入适配器中，上机，频率为1400rpm，磨样时间一般为90s，将样品磨至粉末。
(3)向样品管中加入1ml TRIzol reagent提取液，使用涡旋仪将样品和提取液迅速混匀。
(4)将裂解液放置15～25℃条件下10min，以保证样品被充分裂解，同时用磁铁将磁珠吸出。
(5)移至台式高速离心机，12,000g 4℃离心10min。
(6)吸取上清液至新的1.5ml管中，每个样品中加入0.2ml的氯仿。盖紧盖子，使用涡旋仪充分震荡每个样品30s，15～25℃静置2～15min。
(7)在2～8℃条件下，12,000g离心15min。
(8)离心后会产生3个分层，将最上层无色液体转移到新的离心管中。
(9)每个样品中加入500ml的异丙醇，上下颠倒，充分混匀。在15～25℃放置5～10min，使RNA充分沉淀。
(10)在2～8℃条件下，12,000g离心10min，去除上清。
(11)加入1ml用DEPC水配制的75％乙醇水溶液，上下颠倒充分漂洗RNA沉淀，去除上清。
(12)在2～8℃条件下，7500g离心5min，去除上清。
(13)在2～8℃条件下，7500g离心短暂离心，用移液枪将多余的乙醇吸走，在空气中干燥5～10min(不能太干，否则不易溶解)。
(14)加入30μl DEPC处理水，将RNA充分溶解，
(15)用NanoDrop2000测定各样品浓度，A260/A280值在2.0～2.2为合格。取2μl RNA进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。样品保存于-80℃超低温冰箱，待用。
2.cDNA的合成
取2μg RNA进行反转录，使用TransScript One-Step gDNA Removal andcDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒(TransGen Biotech,China)，将RNA反转录为cDNA。
cDNA合成反应体系如下：
将上述液体轻轻混匀，简单离心。反应条件为42℃30min，85℃5s终止反应，用NanoDrop2000测定cDNA浓度。
3.OsAHA3基因cDNA全长的获得
设计扩增全长ORF的一对特异性引物(OsAHA3-F/OsAHA3-R)，为了方便下一步载体的构建，在引物5’端添加限制性内切酶酶切位点，得到用于下一步PCR扩增获得水稻耐碱胁迫基因OsAHA3所用的一对引物(OsAHA3-XbaI-F/OsAHA3-BamHI-R)。以反转录的cDNA为模板，成功获得预期大小的cDNA全长。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸3min，32个循环；72℃后延伸10min。
OsAHA3-XbaI-F：5’-gctctagaatggctgagaaggagggca-3’(SEQ ID No.3)
OsAHA3-BamHI-R：5’-cgggatcctcacacggtgtaagactgctgg-3’(SEQ ID No.4)。
(引物中下划线处为酶切位点以及保护碱基)
反应结束后，进行电泳，产物回收，将回收的片段连入载体pMD18-T，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，获得有完整阅读框、无错配、无移码的cDNA全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例2
水稻耐碱胁迫基因OsAHA3超量表达载体的构建
(1)用XbaI和BamHI双酶切双元载体pCsV1300，跑胶回收大片段(载体)。
(2)用XbaI和BamHI双酶切实施例1中得到的包含有水稻耐碱胁迫基因OsAHA3的T载体，消化后跑胶回收包含有水稻耐碱胁迫基因OsAHA3的DNA片段(基因)。
(3)把回收的载体与基因进行常规连接。
(4)将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单克隆进行PCR检测。
(5)对于检测为阳性的单克隆过夜培养，提取质粒进行酶切验证，将验证结果与预期片段一致的质粒用于后续实验。
实施例3
农杆菌介导的水稻遗传转化体系与鉴定
(1)选取成熟饱满的水稻品种Kitaake种子，去壳；75％酒精消毒1～2min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15％的升汞(含有0.1％的吐温20)浸泡15～18min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基，32℃光照培养5～10d。
(2)将实施例2得到的含有水稻耐碱胁迫基因OsAHA3表达载体转化到农杆菌中。在侵染的前2d，取农杆菌在含50mg/l卡那抗生素的LB培养基上划线，置于28℃培养。
(3)侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基中，28℃，180rpm震荡培养3～3.5h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD600为0.1～0.2。将诱导5～10d愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5～10min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹干30min。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养基，先20℃暗培养过夜，然后转入25℃培养箱继续暗培养2d。
(4)共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器中。用灭菌蒸馏水反复清洗愈伤7～8次，其中前面3次可快速清洗，后面3～4次清洗时每次浸泡3～5min。最后用含有500mg/l羧苄青霉素(Carbenicillin，Cn)的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30min。倒掉羧苄青霉素溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹干1h。
(5)将经过清菌后的愈伤摆放到含有潮霉素的筛选培养基上32℃，光照培养14d。
(6)筛选14d后，将抗性愈伤转入分化培养基，28℃培养，光周期为14h光照/10h黑暗。
(7)待抗性愈伤在分化培养基上形成3～4cm高的再生苗时，将其转入生根培养基培养，至形成完整的转基因水稻植株。转基因水稻的自交后代，可以采用潮霉素对纯合转基因植株进行常规筛选。
实施例4
T2代纯合转基因水稻中OsAHA3表达水平检测
取生长至三叶一心期的野生型Kitaake和转基因水稻植株的叶片，提取RNA用于基因相对表达量的分析。利用Real-time PCR仪(ABI,USA)进行RT-qPCR。RNA提取与cDNA的合成同上。之后将cDNA稀释10倍，按照试剂盒THUNDERBIRD SYBR qPCRMixWithout Rox(TOYOBO,Japan)说明进行RT-qPCR。通过Primer Express 3.0设计RT-qPCR所用的引物，以OsACT1为内参基因，所用引物如下：
qRT-OsAHA3-F：5’-tgaaagccttgagaagacagc-3’(SEQ ID No.5)；
qRT-OsAHA3-R：5’-aagaaagcaaagaccagcaga-3’(SEQ ID No.6)；
OsACT1-F：5’-ctcccccatgctatccttcg-3’(SEQ ID No.7)；
OsACT1-R：5’-tgaatgagtaaccacgctccg-3’(SEQ ID No.8)。
RT-qPCR的反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火1min，本步骤40个循环。根据公式2-△△Ct计算。其中△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，△△Ct＝(△Ct样本-△Ct对照)。Ct为荧光阈值。RT-qPCR的结果显示，与野生型相比，3个独立的OsAHA3过表达植株(OsAHA3OX-1、OsAHA3OX-2和OsAHA3OX-3)中OsAHA3的表达水平增加约20倍以上(见图2)。
实施例5
OsAHA3过表达植株的耐碱性测试
将生长至三叶一心期的野生型Kitaake和纯合的OsAHA3过表达转基因植株(OsAHA3OX-1、OsAHA3OX-2和OsAHA3OX-3)移至含有25mMNa2CO3的营养液中(pH＝10.95)，处理6d后观察表型及统计存活率。
结果表明，与野生型Kitaake相比，OsAHA3过表达植株对碱胁迫的耐受性增强，其存活率显著的高于野生型Kitaake(如图3～图4)。
由上述可知，本发明提供了在碱胁迫应答过程中扮演重要角色的质膜H+-ATPase蛋白及其编码序列。通过农杆菌介导的转化方法，将OsAHA3过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株。在碱胁迫下，OsAHA3过表达植株OsAHA3OX-1、OsAHA3OX-2和OsAHA3OX-3的存活率显著高于野生型Kitaake的存活率。上述结果说明水稻质膜H+-ATPase基因OsAHA3能够提高水稻对碱胁迫的忍耐性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 东北师范大学
<120> 一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 956
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Glu Lys Glu Gly Asn Leu Asp Ala Val Leu Lys Glu Ala Val
1 5 1015
Asp Leu Glu Asn Ile Pro Leu Glu Glu Val Phe Glu Asn Leu Arg Cys
202530
Ser Arg Glu Gly Leu Thr Thr Gln Gln Ala Gln Gln Arg Leu Glu Ile
354045
Phe Gly Pro Asn Lys Leu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Lys Phe Leu Lys
505560
Phe Leu Gly Phe Met Trp Asn Pro Leu Ser Trp Val Met Glu Ala Ala
65707580
Ala Ile Met Ala Ile Ala Leu Ala Asn Gly Gly Gly Lys Pro Pro Asp
859095
Trp Gln Asp Phe Val Gly Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Asn Ser Thr
100 105 110
Ile Ser Phe Ile Glu Glu Asn Asn Ala Gly Asn Ala Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Met Ala Arg Leu Ala Pro Lys Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Arg Trp
130 135 140
Thr Glu Glu Glu Ala Ala Ile Leu Val Pro Gly Asp Ile Val Ser Ile
145 150 155 160
Lys Leu Gly Asp Ile Ile Pro Ala Asp Ala Arg Leu Leu Glu Gly Asp
165 170 175
Pro Leu Lys Ile Asp Gln Ser Ala Leu Thr Gly Glu Ser Leu Pro Val
180 185 190
Thr Lys Gly Pro Gly Asp Gly Val Tyr Ser Gly Ser Thr Val Lys Gln
195 200 205
Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Ile Ala Thr Gly Val His Thr Phe Phe
210 215 220
Gly Lys Ala Ala His Leu Val Asp Ser Thr Asn Gln Val Gly His Phe
225 230 235 240
Gln Lys Val Leu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Cys Ile Cys Ser Ile Ala
245 250 255
Val Gly Met Phe Val Glu Ile Ile Val Met Tyr Pro Ile Gln His Arg
260 265 270
Ala Tyr Arg Pro Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Leu Leu Ile Gly Gly
275 280 285
Ile Pro Ile Ala Met Pro Thr Val Leu Ser Val Thr Met Ala Ile Gly
290 295 300
Ser His Arg Leu Ser Gln Gln Gly Ala Ile Thr Lys Arg Met Thr Ala
305 310 315 320
Ile Glu Glu Met Ala Gly Met Asp Val Leu Cys Ser Asp Lys Thr Gly
325 330 335
Thr Leu Thr Leu Asn Lys Leu Thr Val Asp Lys Asn Leu Ile Asp Val
340 345 350
Phe Glu Arg Gly Ile Thr Gln Asp Gln Val Ile Leu Met Ala Ala Arg
355 360 365
Ala Ser Arg Thr Glu Asn Gln Asp Ala Ile Asp Thr Ala Ile Val Gly
370 375 380
Met Leu Ala Asp Pro Lys Glu Ala Arg Ala Gly Ile Gln Glu Val His
385 390 395 400
Phe Leu Pro Phe Asn Pro Thr Asp Lys Arg Thr Ala Leu Thr Tyr Ile
405 410 415
Asp Gly Asp Gly Lys Met Tyr Arg Val Ser Lys Gly Ala Pro Glu Gln
420 425 430
Ile Leu His Leu Ala His Asn Lys Pro Glu Ile Glu Arg Arg Val His
435 440 445
Ala Val Ile Asp Lys Phe Ala Glu Arg Gly Leu Arg Ser Leu Ala Val
450 455 460
Ala Tyr Gln Glu Val Pro Glu Gly Thr Lys Glu Ser Pro Gly Gly Pro
465 470 475 480
Trp His Phe Val Gly Leu Met Pro Leu Phe Asp Pro Pro Arg His Asp
485 490 495
Ser Ala Glu Thr Ile Arg Arg Ala Leu Asn Leu Gly Val Asn Val Lys
500 505 510
Met Ile Thr Gly Asp Gln Leu Ala Ile Gly Lys Glu Thr Gly Arg Arg
515 520 525
Leu Gly Met Gly Thr Asn Met Tyr Pro Ser Ser Ala Leu Leu Gly Gln
530 535 540
Asn Lys Asp Glu Ser Ile Ala Ala Leu Pro Val Asp Asp Leu Ile Glu
545 550 555 560
Lys Ala Asp Gly Phe Ala Gly Val Phe Pro Glu His Lys Tyr Glu Ile
565 570 575
Val Lys Arg Leu Gln Ala Arg Lys His Ile Cys Gly Met Thr Gly Asp
580 585 590
Gly Val Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile Gly Ile Ala
595 600 605
Val Ala Asp Ala Thr Asp Ala Ala Arg Ser Ala Ser Asp Ile Val Leu
610 615 620
Thr Glu Pro Gly Leu Ser Val Ile Ile Ser Ala Val Leu Thr Ser Arg
625 630 635 640
Ala Ile Phe Gln Arg Met Lys Asn Tyr Thr Ile Tyr Ala Val Ser Ile
645 650 655
Thr Ile Arg Ile Val Leu Gly Phe Met Leu Leu Ala Leu Ile Trp Lys
660 665 670
Phe Asp Phe Pro Pro Phe Met Val Leu Ile Ile Ala Ile Leu Asn Asp
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Gly Thr Ile Met Thr Ile Ser Lys Asp Arg Val Lys Pro Ser Pro Leu
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Pro Asp Ser Trp Lys Leu Ala Glu Ile Phe Thr Thr Gly Val Val Leu
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Gly Gly Tyr Leu Ala Met Met Thr Val Ile Phe Phe Trp Ala Ala Tyr
725 730 735
Lys Thr Asp Phe Phe Pro Arg Ile Phe His Val Glu Ser Leu Glu Lys
740 745 750
Thr Ala Gln Asp Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ser Ala Val Tyr Leu Gln
755 760 765
Val Ser Thr Ile Ser Gln Ala Leu Ile Phe Val Thr Arg Ser Arg Ser
770 775 780
Trp Ser Phe Val Glu Arg Pro Gly Phe Leu Leu Val Phe Ala Phe Leu
785 790 795 800
Val Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Ile Ala Val Tyr Ala Asp Trp Ala
805 810 815
Phe Thr Ser Ile Lys Gly Ile Gly Trp Gly Trp Ala Gly Ile Val Trp
820 825 830
Leu Tyr Asn Leu Ile Phe Tyr Phe Pro Leu Asp Ile Ile Lys Phe Leu
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Ile Arg Tyr Ala Leu Ser Gly Lys Ala Trp Asp Leu Val Ile Glu Gln
850 855 860
Arg Ile Ala Phe Thr Arg Lys Lys Asp Phe Gly Lys Glu Glu Arg Glu
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Leu Lys Trp Ala His Ala Gln Arg Thr Leu His Gly Leu Gln Pro Pro
885 890 895
Asp Ala Lys Met Phe Ser Glu Lys Ala Gly Tyr Asn Glu Leu Asn Gln
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Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Glu Ile Ala Arg Leu Arg Glu
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Leu Asp Ile Glu Thr Ile Gln Gln Ser Tyr Thr Val
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aagttcctca agtttttggg gttcatgtgg aatccactct catgggtcat ggaagctgca 240
gctatcatgg ccattgcgct ggcgaatgga ggggggaagc caccggattg gcaggacttt 300
gttggtatca taactcttct tgttatcaac tcgacaatca gtttcattga ggaaaacaat 360
gctggcaatg ctgctgctgc actcatggcc cgtcttgcac caaaggccaa ggtgcttcgt 420
gatggccgat ggactgagga agaggcggcc atccttgtac caggggatat cgtaagtatt 480
aaacttggag acattatacc tgcagatgcg cgtctccttg agggagatcc tttgaagatc 540
gatcagtctg ccctgactgg agaatcattg cctgtcacca aaggtcctgg tgatggtgtc 600
tattctggtt cgactgtcaa gcaaggtgag atcgaagcca tagtgattgc tactggtgtt 660
cacactttct tcggaaaagc agcacacctt gttgactcaa ctaaccaagt tggtcatttc 720
cagaaggtcc tgacggctat tgggaatttc tgcatttgct caattgctgt gggaatgttt 780
gttgagatca ttgtaatgta ccctatccag cacagggcat accgccccgg gattgacaac 840
ctccttgtcc ttctcattgg aggcattccc atagccatgc caacagtctt atctgtgact 900
atggcaattg ggtcacaccg cttgtctcaa cagggagcga tcacaaagag aatgactgca 960
attgaggaga tggcgggcat ggatgttctt tgcagtgata aaactggaac tttgaccttg 1020
aataagctca ccgtggacaa gaacctcatt gatgtctttg aaagaggaat cactcaggac 1080
caagtgattc tcatggctgc tagagcatca cgaacagaaa accaggatgc tattgatact 1140
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ttcctgccat tcaatcctac tgacaaaaga acagcattga catacattga tggtgatggc 1260
aaaatgtatc gtgttagtaa gggtgcacct gagcagattc tccaccttgc tcataacaaa 1320
ccggagatag agcggagggt ccatgctgtg attgacaaat ttgcagaacg tggacttaga 1380
tcgcttgctg tagcatacca ggaagtacca gaggggacga aagaaagccc tggtggccca 1440
tggcattttg ttggtctcat gccacttttt gatcctccaa ggcacgacag tgctgaaaca 1500
attcggcggg cacttaatct tggtgtcaat gtcaagatga tcacaggtga tcagctggca 1560
attggaaaag aaacagggcg tcgcctggga atgggtacaa acatgtaccc ttcatccgct 1620
ttgctgggac agaacaagga tgagtccatt gccgctttac cagttgatga tctcattgag 1680
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caagcaagaa agcacatatg tggaatgact ggtgatggtg tcaatgatgc tccagcccta 1800
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gcaattttcc agcgtatgaa gaactacact atctatgctg tctcaatcac cattcgtata 1980
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