通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法和应用。
背景技术
骨骼肌是动物躯体重要组成部分，大约45％是骨骼肌。我国居民肉类消费中猪肉占60％以上，是人们主要的动物蛋白质来源。随着生活水平的提高，人们对肉品质有更高的要求。肉品质性状属于典型的多基因控制经济性状、其形成机制复杂，受品种、年龄、性别、营养、遗传等多个因素影响，同时肉质性状度量难度较大，需要屠宰测定且测定成本高，所以对肉品质性状的改良是目前动物科学工作者研究的难点和重点。骨骼肌发育是成肌细胞增殖分化形成肌纤维，以及肌肉蛋白质沉积的过程。脊椎动物的肌肉主要由肌纤维组成，占据了肌肉组织的75％～90％，肌纤维的形态特征决定了肌肉特性。大量研究表明肌纤维类型组成与肉质相关重要性状如肉色、嫩度(剪切力)、宰后24h pH值、滴水损失等密切相关(Morales et al.,2015；Wood et al.,1999；郭佳,2011)，故研究和改善肌纤维类型的组成，对于改良猪肉质性状具有直接的指导作用。
成年哺乳动物骨骼肌纤维中肌球蛋白重链(MyHC)亚型分为4种主要类型：I型(MyHC I)、IIA型(MyHC IIa)、IIx/d型(MyHC IIx/d)和IIB型(MyHC IIb)(Schiaffino etal.,1989)。MyHC I对应的是慢速氧化型肌纤维，MyHC IIa对应的是快速氧化型肌纤维，MyHC IIb对应的是快速酵解型肌纤维，MyHC IIx/d是介于MyHC IIa和MyHC IIb之间，属于中间型肌纤维(Ashmore et al.，1972)。肉的颜色是人们用来感官评价肉品质的重要指标之一(O'Sullivan et al.，2003)。I型和IIA型肌纤维主要存在于慢肌中(如比目鱼肌)，具有高度氧化性，富含肌红蛋白(Mb)和细胞色素(cytochromes)，肌肉色泽鲜红(Schiaffinoet al.,2011)。IIB型肌纤维主要存在于快肌中(如趾长伸肌和背最长肌)，肌红蛋白和细胞色素含量相对较低，肌肉色泽较暗(Tseng et al.,2010)。有研究表明同一猪种不同部位骨骼肌纤维类型存在差异，如猪背最长肌、股二头肌、半膜肌等IIB型肌纤维含量较高，而腰大肌则含有较高的IIA型肌纤维，含有较低的IIB型肌纤维(Chang et al.,2003)。猪腰大肌及半腱肌宰后24h的pH、肌内脂肪含量及肉色等与I型肌纤维比例呈正相关(Shen et al.,2015)。这些研究均表明猪背最长肌以IIB型肌纤维为主，而腰大肌以I型和IIA型肌纤维为主。有研究比较长白猪、杜洛克猪、巴克夏猪的腰大肌和背最长肌，均发现氧化型纤维较多的腰大肌的肉色评分高于酵解型肌纤维比例高的背最长肌(Chang et al.，2003)。在不同猪种中，不同类型MyHC表达量不同，比如出生日龄30天和60天巴马香猪背最长肌中MyHC I基因的表达都显著高于同日龄的长白猪；300天日龄巴马香猪背最长肌中MyHC I基因的表达显著高于180天日龄长白猪(敖秋桅，广西大学，2014硕士论文)。动物出生后，肌纤维数目已经确定，但肌纤维类型保持高度可塑性，受多基因控制。挖掘控制畜禽肉品质的功能基因或遗传标记，可用于畜禽肉品质的遗传改良。
Mdfi(MyoD family inhibitor)又称I-mf(Inhibitor of MyoD family)，最早是由Chen等(1996年)通过酵母双杂交试验，在小鼠胚胎cDNA文库发现的一个与MyoD蛋白家族互作新基因。随后研究者们发现Mdfi在小鼠胎盘发育(Kraut et al.,1998)、骨骼发育(Onget al.,2013)、疾病以及肿瘤发生过程中也发挥着重要作用(Lin et al.,2015；Ma etal.,2018；Wu et al.,2015)。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法，以解决动物肉品质改良的问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法，该方法包括过表达Mdfi基因。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
在某些实施方式中，该方法包括在动物肌肉中注射Mdfi。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
在某些实施方式中，该方法包括在动物肌肉中注射含Mdfi编码区的腺相关病毒。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
在某些实施方式中，该方法包括在动物肌肉中注射含Mdfi编码区的腺相关病毒，病毒滴度为1012vg/mL，每点注射10-15μL。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
在某些实施方式中，该方法包括在动物肌肉中注射含Mdfi编码区的表达质粒。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
在某些实施方式中，该方法包括获得过表达Mdfi基因的转基因动物。由此，获得的转基因动物肉质得到改善并且该性质是可遗传的。
在某些实施方式中，该方法包括通过向受精卵注射Mdfi基因，然后移植至代孕动物子宫获得过表达Mdfi基因的动物。由此，可以高效的改善动物肉质，并且该方法安全、可控、环保。
根据本发明的另一个方面，提供了一种编辑Mdfi基因在动物肉品质改良上应用。
在某些实施方式中，编辑Mdfi基因包括在动物中过表达Mdfi基因。
在某些实施方式中，过表达Mdfi基因包括在动物肌肉中注射含Mdfi编码区的表达质粒、在动物肌肉中注射含Mdfi编码区的腺相关病毒、过表达Mdfi基因的转基因动物、向受精卵注射Mdfi基因再移植至代孕动物子宫获得过表达Mdfi基因的动物中的至少一种。
本发明的有益效果：
1、从基因编辑角度改善动物肉质的方法，相较于饲养角度而言，其更可控，效果也十分显著。
2、从基因编辑角度改善动物肉质的方法，该方法获得的肉质形状是可遗传的。
3、从基因编辑角度改善动物肉质的方法，该方法是安全、可控、环保的。
附图说明
图1为莱芜猪和大白猪肌肉组织中Mdfi以及肌纤维类型MyHC标记蛋白的Westernblot检测结果：图A为莱芜猪和大白猪的腰大肌检测Mdfi、MyHC I、MyHC IIa和MyHC IIb的蛋白水平，图B为莱芜猪的背最长肌和腰大肌检测Mdfi、MyHC I、MyHC IIa和MyHC IIb的蛋白水平；
图2为Mdfi促进C2C12细胞成肌分化后肌纤维类型由酵解型转化为氧化型的结果：图A为C2C12过表达Mdfi分化7天时MyHC I免疫荧光结果，图B为C2C12过表达Mdfi分化7天时MyHC IIa免疫荧光结果，图C为C2C12过表达Mdfi分化7天时MyHC IIb免疫荧光结果，图D为C2C12过表达Mdfi分化7天时Tnni1、Tnni2、MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb、MyHC IIx/d和肌红蛋白(myoglobin,Mb)荧光定量结果：其中N＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，图片放大倍数为100倍，标尺为100μm；
图3为通过腺相关病毒包埋在8周龄C57BL/6J小鼠后腿肌肉中过表达Mdfi后，Western blot检测快慢肌纤维类型的MyHC蛋白表达结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：莱芜猪和大白猪肌肉组织中Mdfi以及肌纤维类型标记蛋白表达检测
1)实验材料
来自莱芜猪和大白猪的腰大肌、来自莱芜猪的背最长肌和腰大肌。
2)仪器设备
根据Western blot实验步骤，涉及的仪器设备如下：Centrifuge 5804R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；iMarkTM Microplate Reader酶标仪(美国BIO-RAD)；制冰机(日本Sanyo)；垂直转印槽(上海天能)；蛋白电泳仪(上海天能)；Color squid磁力搅拌器(德国IKA)；PowerPacTM Universal电泳仪电源(美国BIO-RAD)；VORTE×4cligital圆周振荡器(德国IKA)；易普易达超纯水系统(四川优普超纯科技公司)；HS-3垂直混合仪(宁波新芝生物科技)；D1008E掌上离心机(美国SCILOGEX)；转移脱色摇床TS-8(江苏海门其林贝尔)；Flour ChemM多色荧光和化学发光成像系统(美国Protein Simple)；移液器(美国GILSON)。
3)实验耗材
根据Western blot实验步骤，涉及的耗材如下：5×Loading Buffer(上海碧云天)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天)；PMSF(上海碧云天ST505)；RIPA裂解液(强)(上海碧云天)。
4)莱芜猪腰大肌肉组织总蛋白提取
用剪刀剪碎腰大肌肉组织，加入RIPA裂解液(强)，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF，用匀浆机捣碎肌肉组织，放置冰上裂解半小时，期间摇匀裂解液。最后在台式高速冷冻离心机12,000g离心15分钟，取上清，然后加入5×Loading Buffer，98℃水浴15分钟进行变性，最终获得总蛋白，用于后期Western blot实验。
5)Western blot详细步骤
a)样品准备：已变性的蛋白样品放在冰上解冻，每孔上样30μg蛋白；
b)12％分离胶配制：按照此配方进行配制：ddH2O 2mL；10％SDS 0.1mL；1.5mol/LTris(pH 8.8)3.8mL；TEMED 0.004mL；10％过硫酸铵0.1mL和30％丙烯酰胺混合液4mL，凝胶一定要混匀，缓慢加入凝胶板中，左右摆动，使胶左右水平，然后在一侧缓慢加入ddH2O进行封胶；
c)5％浓缩胶配制：按照此配方进行配制：ddH2O 6.8mL；10％SDS 0.1mL；1.5mol/LTris(pH 6.8)1.25mL；10％过硫酸铵0.1mL；30％丙烯酰胺混合液1.7mL和TEMED 0.01mL；在加入浓缩胶之间，用滤纸将胶板内的水吸干，然后缓慢加入浓缩胶，再插入已经清洗和干燥的梳子，轻轻往下压，然后在两侧进行补胶；
d)电泳：轻轻拔出梳子，然后放在电泳槽中，加入Western blot电泳液，然后缓慢加入蛋白质上样液；电泳程序为80V 40分钟；110V 1小时30分钟；
e)转膜：提前准备好转膜液，加入甲醇后，用封口膜封住，避免挥发，然后放在4℃冰箱进行预冷；将转膜夹黑色板面朝下，依次放入一张海绵垫、3张薄滤纸、凝胶、PVDF膜、3张薄滤纸、一张海绵垫，夹紧后放于电泳槽中，以168mA恒流转膜90分钟；
f)封闭：取PVDF出膜，在左上角做标记，区分出点样顺序和膜的正反面；根据蛋白marker进行切带，然后用5％脱脂奶粉摇床上室温封闭2小时；
g)孵育一抗：封闭后，用TBST洗涤一下条带，然后将条带卷至离心管中，膜的正面朝内，螺旋至管中，然后在4℃垂直混合仪上摇，孵育12～18小时；
h)孵育二抗：先用TBST洗涤条带3～5次，每次3～5分钟；然后根据一抗的属性，在玻璃皿中进行二抗孵育；
i)显色：用TBST洗涤条带3～5次，每次3～5分钟，然后用显影液孵育条带，最后在Flour ChemM多色荧光和化学发光成像系统中进行扫描检测。结果见图1A和图1B。图1结果表明不同猪种中，Mdfi表达量与慢肌纤维型MyHC I和MyHC IIa表达正相关；莱芜猪中，慢肌纤维较多的腰大肌中Mdfi和MyHC I和MyHC IIa表达正相关。
Western blot使用的一抗和二抗信息见下表1和表2：
实施例2：Mdfi促进C2C12细胞成肌分化后肌纤维类型由酵解型转化为氧化型的相关检测
1)实验材料
C2C12小鼠成肌细胞购买于ATCC官网，货号为CRL-1772。
2)仪器设备
根据免疫荧光和qPCR的实验步骤，涉及的仪器设备如下：CO2培养箱(美国Thermo)；超净工作台(苏州净安泰)；台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；Leicaconfocal laser scanning microscope SP8(德国Lceica)；CFX ConnectTM Real-TimeSystem荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD)；移液器(美国GILSON)；NanoDrop One超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo)。
3)试剂耗材
根据免疫荧光和qPCR的实验步骤，涉及的试剂耗材如下：DMEM/HIGH GLUCOSE(美国HyClone)；FBS(美国Gibco)；马血清(美国HyClone)；氨苄青霉素抗生素(上海碧云天)；5％BSA(武汉博士德)；Triton X-100(上海麦克林)；Trizol(南京诺维赞R401-01)；DEPC水(上海生工)；氯仿(上海碧云天)；异丙醇(上海碧云天)；无水乙醇(上海碧云天)；
4)过表达Mdfi单克隆C2C12细胞的筛选步骤
根据Genome-TALERTM&Genome-CRISPRTM试剂盒，首先构建Mdfi供体载体DONOR-Mdfi：根据引物Mdfi-F(5’-3’)：ATGTCCCAGGTGAGCGGT；Mdfi-R(5’-3’)：TCAGGAGGAGAAACAGAGTCC扩增Mdfi的CDS区(序列如SEQ ID NO:1所示)，然后克隆至Genome-TALERTM&Genome-CRISPRTM试剂盒中的DONOR载体(根据Genome-TALERTM&Genome-CRISPRTM试剂盒的操作说明进行操作)，成功构建DONOR-Mdfi供体载体。根据Invitrogen公司
a)使用2μg/mL嘌呤霉素进行药筛，药筛3天后，用胰酶消化细胞，然后稀释至1200cell/cm2的密度，将细胞接种于10cm皿中，使用生长型培养基进行培养；
b)在40倍显微镜下观察，当一个细胞进行增殖，形成的细胞团正好占据40倍的视野下；在荧光显微镜下观察细胞，定点做标记，标出发绿光，且由一个细胞增殖形成的单个细胞团；
c)在超净台中，用75％酒精浸泡克隆环5分钟，然后用PBS清洗3遍，最后浸泡在PBS中备用；
d)吸走培养基，然后用PBS洗2次，将克隆换套在所作标记细胞的地方，加入100μL0.25％的胰酶，室温消化2分钟，随后加入20μL的生长型完全培养基终止消化；
e)轻轻吹悬浮克隆环内的细胞，然后直接转移至48孔细胞培养板中；
f)接种12小时后细胞贴壁，更换新完全型培养基，在显微镜下进行观察，确定并标记发荧光且无不发光的单克隆细胞；
g)上一步筛选获得单克隆细胞，进行消化，消化后获得细胞悬浮液三分之一作为同源重组鉴定的样品，剩下的转移至24孔板中，此时做好标记；
h)当单克隆细胞在24孔板中长至80％时，根据上一步PCR验证的阳性单克隆细胞，进行消化传代，一传三至6孔板中；
i)待细胞长至80％时，一个孔的细胞用于细胞冻存，一个孔的细胞用于RNA抽提，一个孔的细胞用于蛋白提取；冻存细胞时，取一小部分，用作DNA抽提(细胞直接裂解，进行PCR鉴定)。最后通过qPCR、Western blot和同源重组PCR进行验证，确定候选过表达Mdfi的单克隆C2C12细胞系，用作后续试验。
5)MyHC I/IIa/IIb免疫荧光实验步骤
为检测Mdfi对C2C12分化时期肌纤维类型的影响，分别通过MyHC I/IIa/IIb免疫荧光分析肌纤维形成情况，针对48孔板的详细试验步骤如下：
a)将野生型C2C12细胞和稳定过表达Mdfi的C2C12细胞以相同的细胞密度接种至48孔板中，细胞贴壁后，进行诱导分化；
b)诱导分化7天后，去除培养基，用200μL PBS清洗两遍；
c)固定：每孔加入200μL 4％多聚甲醛，摇床上缓慢摇30分钟；
d)洗涤：吸走固定液，用200μL PBS清洗三遍，每次20秒；
e)透化：每孔中加入配好的1％Trition-100透化剂150μL，在摇床上透化30分钟；
f)封闭：去除透化剂，用PBS洗3次，然后加入200μL 5％BSA，在37℃静止封闭2小时；
g)孵育MyHC I抗体：按照说明书用5％BSA配置MyHC I抗体稀释液，每孔150μLMyHC I抗体稀释液，37℃孵育2小时；MyHC I抗体的稀释比例，见表1；
h)洗MyHC I抗体：回收MyHC I抗体，用200μL PBS清洗三遍，每次5分钟；注意回收的MyHC I抗体还可以使用两次免疫荧光试验；
i)孵育二抗Goat Anti-Mouse lgG/Cy3：用PBS配置抗体稀释液，每孔120μL二抗稀释液，避光室温孵育2小时；Goat Anti-Mouse lgG/Cy3的稀释比例见表2；
j)洗二抗：用200μL PBS清洗三遍，每次5分钟；
k)DAPI孵育：根据说明书配制DAPI稀释液，每孔加入100μL DAPI稀释液，室温孵育30分钟，然后进行拍照分析，每孔选择不同的三个视野。见结果图2A。
运用相同的方法检测Mdfi对MyHC IIa和MyHC IIb型肌纤维形成的影响，分别见图2B和图2C：结果表明过表达Mdfi增加了MyHC I和MyHC IIa肌管比例(图2A和图2B)，减少了MyHC IIb型肌管比例(图2C)。
6)荧光定量检测快慢肌纤维相关基因的mRNA水平
为明确Mdfi对快慢肌纤维相关基因的mRNA水平的影响，分别收集野生型C2C12细胞核和稳定过表达Mdfi的C2C12细胞系分化7天时的细胞，进行总RNA抽提，然后使用南京诺唯赞公司的
实施例3：通过腺相关病毒包埋方法在小鼠后腿肌肉中过表达Mdfi，分离腓肠肌，进行western blot检测快慢肌纤维的结果。
1)实验材料
C57BL/6J小鼠(购于广东省医学实验动物中心)；包装Mdfi编码区的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV；购自上海吉凯基因有限公司)，使用MHCK7启动子，使Mdfi富集在肌肉中表达。
2)试剂耗材
一次性注射器；磷酸盐缓冲液(PBS)。
3)C57BL/6J小鼠后腿肌肉中注射包装Mdfi编码区的腺相关病毒的实验步骤
①从广东省医学实验动物中心购买7周龄的普通无特定病原体(SpecificPathogen Free，SPF)级雄性C57BL/6J小鼠。小鼠料为普通SPF级，符合国家标准。动物饲养条件：1只/笼，单养；饲养温度与湿度：20-26℃，40-70％，采用12h:12h昼夜间断照明。饲养室条件始终保持稳定，自由进食饮水。
②饲养一周后，用无菌的注射器在C57BL/6J小鼠后腿肌肉中多点注射含Mdfi编码区(序列如SEQ ID NO:1所示)的腺相关病毒。病毒滴度为1012vg/mL，每点注射10-15μL，打3-5个点。正常小鼠(Wild Type,WT)注射等体积的PBS。小鼠腓肠肌为混合型肌肉，含有快肌纤维和慢肌纤维。为探究Mdfi对快慢肌纤维转化是否有影响。因此，注射一周后，分离小鼠的腓肠肌，Western blot检测快慢肌纤维类型相关MyHC的蛋白水平。结果如图3所示：表明注射组与WT型组相比，过表达Mdfi(AAV-Mdfi)降低了MyHC IIb蛋白水平，增加了MyHC I和MyHC IIa蛋白水平，表明促进了成年小鼠腓肠肌中快肌向慢肌转化，改善了小鼠的肌肉性状，由此推测过表达Mdfi可以改善猪或牛等动物的慢肌比例，进而改善肉质。
实施例4：向猪后腿肌肉注射含Mdfi编码区的腺相关病毒来改善猪的肉质的方法。
将遗传背景相同的断乳小猪分成两组，分别为实验组和对照组。将实验组小猪的后腿肌肉中注射含Mdfi编码区的腺相关病毒。病毒滴度为1012vg/mL，每点注射10-15μL，打5-8个点。对照组小猪注射等体积的PBS。将实验组和对照组猪进行标记后，在同等条件下饲养至100日龄，对猪的后腿肌肉进行检测，结果表明实验组猪MyHC IIb蛋白表达降低，MyHCI和MyHC IIa蛋白表达增加，肌肉由快肌向慢肌转化，改善了猪肉品质。
实施例5：向猪后腿肌肉注射含Mdfi编码区的表达质粒来改善猪的肉质的方法。
将遗传背景相同的断奶小猪分成两组，分别为实验组和对照组。将实验组小猪的后腿肌肉中注射含Mdfi编码区的表达质粒。质粒浓度为20μM，每点注射10-15μL，打5-8个点。对照组小猪注射等体积的PBS。将实验组和对照组猪进行标记后，在同等条件下饲养至100日龄，对猪的后腿肌肉进行检测，结果表明实验组猪MyHC IIb蛋白表达降低，MyHC I和MyHC IIa蛋白表达增加，肌肉由快肌向慢肌转化，改善了猪肉品质。
实施例6：通过构建过表达Mdfi转基因猪来提高猪肉品质。
如实施例2中方法构建的DONOR-Mdfi供体载体转染猪成纤维细胞，通过筛选后获得表达Mdfi基因的阳性细胞系，将该细胞系作为体细胞克隆的核供体细胞进行体细胞克隆，获得肌肉中特异性过表达Mdfi基因的转基因猪。将转基因猪与阴性对照组在同等饲养条件下养至100日龄后进行屠宰，检测转基因猪的肌肉类型，发现转基因猪中MyHC IIb蛋白水平显著降低，MyHC I和MyHC IIa蛋白水平显著增加，说明肌肉由快肌向慢肌转化，从而改善了猪肉品质。
实施例7：通过向受精卵注射Mdfi基因，然后移植至代孕动物子宫获得过表达Mdfi基因的猪来提高猪肉品质。
将猪的受精卵分为实验组和对照组。向实验组中注射含Mdfi编码区的表达质粒(如实施例2中方法构建的DONOR-Mdfi供体载体)，质粒浓度为20μM，注射体积为10pL。对照组注射同等体积的PBS溶液。将实验组和对照组猪进行标记后，在同等条件下饲养至100日龄，对猪的后腿肌肉进行检测，结果表明实验组猪MyHC IIb蛋白水平显著降低，MyHC I和MyHC IIa蛋白水平显著增加，表明肌肉由快肌向慢肌转化，进而改善了猪肉品质。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 通过Mdfi基因编辑来实现动物肉品质改良的方法和应用
<130> 2020.6.30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgtcccagg tgagcggtca gtgcccttct cgctgcgacg cgcctcatgg agtccccagc 60
gctgccctgg acccagccca gaccatgtcc ctcctccctg ggctggaggt agcaagatcc 120
actcaccctg tagaggcatc ttctgaagag ggcttcccgg aggaggcggc accctccatg 180
ccccatgaca gtggtctccg ggctcagcag gctctgaaca gcattgacct cgatgtcccc 240
acagaagctg tgacgtgcca gcctcaaggg aacccccaag gctgcacccc actactgcca 300
aatggctcca gccacgacca cctctcagaa ccgggcagtg cagggcatgc ggggaacggt 360
gctctgggcg ggtccaaggc ccaccggaag ttgcagacgc atccatctct gggcagccag 420
gctggaagga aaagcagagg cagcgcccgg tcagcctcac aggtccctct ccaggcacag 480
gaagattgct gcgtccactg catactgtcc tgtctattct gtgagttcct gacgctctgt 540
aacatcctcc tggactgcgc cacctgtggc tcctgcagct ctgaggactc ctgcctctgc 600
tgctgctgct gtgggtccgg cgagtgcgcg gactgtgacc tgccctgcga cctggactgc 660
ggcatcgtgg atgcctgctg cgagtccgca gactgcttgg agatatgcat ggagtgctgt 720
ggactctgtt tctcctcctg a 741
