利用AtALA1基因提高植物对禾谷镰刀菌抗性的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及利用基因工程技术降低禾谷镰刀菌毒素的含量而提高植物对禾谷镰刀菌抗性的方法。
背景技术
水稻和玉米是世界三大粮食作物，是全世界食物及饲料的主要来源，其制品的安全性直接关系人类存亡。但这些禾谷类作物在其生长发育中常受到多种病原菌的浸染，不仅严重降低其产量与品质，经病原菌污染的籽粒常含有多种真菌毒素，严重危害人畜健康(Zhen,2010)。根据联合国粮农组织(FAO)估计，多达25％的世界粮食作物被真菌毒素污染，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON，也称为呕吐毒素)是最常见、最重要的镰孢菌毒素。DON最初由日本科学家Morooka和Yamamoto于1972年在感染赤霉病的大麦中分离得到(Morooka&Yamamoto,1972)。根据它能引发母猪拒食和呕吐的特征，将其定名为呕吐毒素(Vomitoxin,VT)，是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰孢(F.graminearum)和黄色镰孢(F.culmorum)产生，包括呕吐毒素(DON)以及其乙酰化形式：15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)和3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)。2018年BIOMIN公司对全球霉菌污染风险进行评估的结果显示，在送检样品中有73％检测出了DON，检出率居于所有毒素的首位。而我国的送检样品中玉米、面粉、小麦还是麸皮及米糠，DON的阳性率均超过了98％，在猪饲料和禽饲料中DON的阳性率高达97％。
DON不仅危害农作物，被DON污染的食品或饲料进入人体或动物体内，还严重危害人畜健康(De Walleet al.,2010；Audenaert et al.,2014；Vidalet al.,2016)。DON具有很强的细胞抑制作用，可以抑制人和动物的免疫系统，主要是抑制蛋白质、DNA和RNA的合成、抑制线粒体的功能、影响细胞分裂和细胞膜的功能(Goyarts et al.,2007；Seeling etal.,2006；Valenta et al.,2005)。DON对人类和动物均具有毒性，可损坏人和动物的免疫系统，造成头晕、呕吐、腹泻、恶心以及流产等症状(De Walle et al.,2010；Audenaert etal.,2013；Pestka et al.,2004)。DON极易被人体吸收，误食了被污染的食物后会造成站立不稳，反应迟钝，猪食用了DON污染的谷物会出现拒食、呕吐及采食量下降等症状，严重时会产生流产等病症(Ebarbet al.,2018；Sayyari et al.,2018)，因此降低植物中的DON具有重要意义。
目前关于降低植物中DON含量的报道较少，仅发现UDP-葡萄糖基转移酶可使DON转变为无毒的D3G，使转基因小麦和拟南芥表现出对DON的抗性，从而提高植物对DON耐受性(Pasquet et al.,2016；Schweigeret al.,2013；Gardiner et al.,2010；Mandalàet al.,2019)。更多的是将抗病相关途径中的调控基因进行作物转化，提高了对DON耐受性，表达TaABCC基因可提高小麦对禾谷镰刀菌的耐受性，还降低了DON在麦穗中的累积(Walter etal.,2015)；小麦中TaFROG有助于提高宿主对DON和禾谷镰刀菌的抗性(Alexandreet al.,2015)；Song等人在禾谷镰刀菌细胞壁蛋白中，发现抗体CWP2识别的抗原GLX定位于赤霉病菌细胞膜上且特异性结合CWP2，从而使植物抗病(Song et al.,2016)；表达TaCYP72A有助于提高宿主对DON的耐受性(Gunupuruet al.,2018)；表达TAD1提高了小麦对禾谷镰刀菌的抗性，暗示TAD1可能是是增加谷类作物对FHB抗性的候选基因(Sasakietet al.,2016)。以上方法基本都是提高植物防御功能，但不能降低DON在籽粒中的累积。
纵观以上方法，物理法和化学法作用效果弱且作用范围小，处理样品繁琐，且对环境危害较大。生物法大都是从毒素合成等方面出发来降低毒素的合成，并没有从根本上提高植株自身降解毒素的能力。随着植物基因工程技术的不断发展，以及对植物-病原物互作认识的不断深入，使得将外源抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效途径。实践证明，利用抗病品种是降低DON含量，提高对禾谷镰刀菌抗性的唯一经济有效的途径。
基于对病原菌致病机理的深入研究，以及病原菌分泌毒素的严重危害及在致病中的重要作用，利用外源抗病基因抑制病原菌对植物的侵染，提高植物对病原菌毒素的解毒功能，是提高植物抗病性的有效途径之一。但目前大数研究者主要利用前一种方法达到提高植物抗性的目的，尚未见成功利用外源基因的表达产物解毒病原菌产生的毒素来提高对病原菌抗性的报道。
本研究表明表达AtALA1缓解了DON对玉米根长的抑制作用，提高了对DON的耐受性，检测含量发现转基因玉米中DON累积量下降，相比野生型降低105ppb，表明表达AtALA1是一种降低籽粒中DON含量，提高抗禾谷镰刀菌的行之有效的策略，具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高植物对禾谷镰刀菌的抗性的方法；本发明的另一个目的是一种抗禾谷镰刀菌的转基因植物的制备方法；本发明也提供AtALA1基因在降低植物中禾谷镰刀菌毒素并提高植物对禾谷镰刀菌抗性中的用途。
AtALA1属于P4-ATPases家族成员，是包含10个跨膜域的膜蛋白，该蛋白家族在维持细胞膜磷脂不对称分布、起始囊泡形成及介导细胞内蛋白运输中发挥重要作用。AtALA1基因编码AtALA1蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。以模式植物拟南芥中的AtALA1基因为模型，并以具有相同解毒机制的P4-ATPase蛋白的禾谷类植物玉米验证，完成了本发明的研究。
根据本发明的一方面，一种提高植物对禾谷镰刀菌的抗性的方法，其中通过将AtALA1基因整合进入目标植物，并使得所述AtALA1基因在目标植物中表达而降低禾谷镰刀菌毒素含量，提高植物对禾谷镰刀菌的抗性，所述AtALA1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
本发明所述的方法，包括下述步骤：
1)构建含有来自AtALA1基因的重组植物表达载体；
2)将所述重组植物表达载体导入目标植物中，使得AtALA1基因在目标植物中组成型表达；和
3)获得具有对禾谷镰刀菌抗性的转基因植物。
在本发明所述方法中，优选的目标植物为拟南芥或禾谷类植物，例如玉米。
本发明所述的方法中，使用的重组植物表达载体的结构如图4A(拟南芥)或图4B(玉米)所示。
根据本发明的另一方面，一种抗禾谷镰刀菌的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：
i)获得AtALA1基因，并将其可操作地插入植物表达载体中，构建植物表达载体；
ii)用步骤i)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；
iii)用步骤ii)获得的转化体转化植物，获得转基因植物；
所述AtALA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
根据本发明的再一方面，提供AtALA1基因在降低植物中禾谷镰刀菌毒素并提高植物对禾谷镰刀菌抗性中的用途，其中通过将AtALA1基因整合进入目标植物，获得转基因植物，并使得所述AtALA1基因在植物体内表达，而降低植物中禾谷镰刀菌毒素的含量，并提高目标植物对禾谷镰刀菌的抗性，所述AtALA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.14
ATGGATCCCAGGAAATCAATTGATAAGCCGCCTCATCACGATCCAATTCTGGGTGTATCTTCAAGATGGAGCGTTTCTTCTAAAGACAACAAAGAAGTTACTTTCGGTGATTTGGGATCTAAGCGTATCCGTCATGGTTCAGCTGGAGCTGATTCTGAGATGCTAAGCATGTCTCAGAAAGAGATCAAAGACGAAGATGCTCGTTTGATTTATATTAACGATCCTGACAGAACTAACGAACGGTTTGAGTTCACTGGGAATTCTATCAAGACTGCTAAATACTCTGTCTTCACCTTCTTGCCTAGGAACTTGTTTGAACAGTTCCATAGAGTTGCTTACATTTACTTCCTTGTTATCGCTGTTCTCAATCAGCTTCCTCAGCTTGCAGTTTTTGGCAGAGGTGCATCCATCATGCCCCTTGCCTTTGTTCTCTTGGTCTCTGCTATCAAAGATGCTTACGAGGATTTCCGGAGACATAGGTCAGATAGAGTTGAGAACAATAGGTTGGCTTTAGTCTTTGAGGATCATCAGTTTCGAGAGAAGAAGTGGAAGCATATCCGGGTTGGGGAAGTCATTAAAGTCCAATCCAATCAGACTCTTCCCTGTGACATGGTGCTCTTGGCTACTAGTGATCCTACTGGGGTTGTCTACGTGCAGACGACTAATTTGGATGGTGAGTCGAATTTGAAGACCAGGTATGCCAAGCAGGAAACTCTTCTGAAAGCTGCTGATATGGAGTCGTTTAATGGATTTATCAAGTGTGAGAAACCTAACAGGAACATTTATGGGTTTCAAGCCAACATGGAGATTGATGGTAGAAGGCTCTCCCTTGGACCTTCTAATATTATTCTAAGAGGGTGTGAGCTTAAGAACACTGCTTGGGCTTTAGGGGTTGTTGTGTATGCTGGTGGTGAGACGAAAGCTATGCTCAACAACTCTGGAGCACCATCAAAGAGGAGTAGGCTAGAGACTCGAATGAATTTGGAGATCATTCTACTCTCTTTGTTTCTGATCGTCTTGTGTACAATCGCAGCCGCGACCGCTGCTGTGTGGTTGAGAACGCACAGGGATGACTTGGACACTATTCTCTTTTATAGAAGAAAGGACTACTCTGAGAGGCCAGGAGGGAAGAACTATAAATACTATGGTTGGGGGTGGGAGATATTCTTCACCTTCTTTATGGCAGTCATTGTGTACCAGATCATGATACCCATTTCTCTCTACATATCGATGGAGCTCGTCCGTATTGGTCAAGCATACTTCATGACCAATGATGATCAGATGTATGACGAGTCTTCAGATTCAAGTTTTCAATGCAGGGCTTTAAATATAAATGAAGATTTAGGGCAGATTAAGTATTTATTCTCTGATAAGACGGGTACACTCACGGACAACAAGATGGAGTTTCAATGTGCCTGCATCGAAGGCGTAGATTACTCTGACAGGGAACCTGCTGATAGCGAGCATCCTGGATACTCCATTGAAGTTGATGGAATTATTTTGAAGCCAAAGATGAGGGTGAGAGTTGATCCTGTGCTTCTTCAGTTAACGAAAACTGGCAAGGCAACAGAAGAAGCAAAACGTGCAAATGAGTTTTTCCTCTCACTGGCAGCTTGCAATACAATTGTGCCAATTGTTAGCAATACATCTGATCCCAATGTGAAACTGGTAGATTATCAAGGGGAGTCCCCTGATGAACAAGCATTGGTCTATGCAGCAGCTGCATATGGTTTCTTGCTCATAGAGAGAACCTCTGGTCATATAGTTATTAATGTGCGAGGAGAAACGCAAAGATTTAATGTTTTGGGATTGCATGAGTTCGATAGTGACCGAAAAAGAATGTCAGTGATACTGGGATGCCCCGACATGTCGGTGAAACTCTTTGTAAAAGGTGCAGACTCATCCATGTTTGGTGTCATGGATGAATCCTACGGTGGCGTCATACATGAGACCAAGATACAACTTCATGCTTACTCATCTGATGGTTTGAGAACACTTGTTGTTGGGATGAGAGAGCTGAACGATTCAGAGTTTGAGCAATGGCATTCTTCATTTGAGGCGGCAAGCACCGCCTTGATTGGTCGGGCTGGATTGCTAAGAAAAGTTGCTGGAAACATTGAGACTAACCTTAGGATAGTAGGAGCCACCGCAATTGAAGACAAATTGCAGCGTGGTGTCCCTGAAGCAATAGAATCTTTGAGGATTGCAGGGATAAAAGTCTGGGTCTTGACTGGTGACAAGCAAGAAACTGCCATATCCATTGGCTTCTCATCGAGGCTTCTGACAAGAAACATGAGGCAAATTGTAATAAATAGCAACTCGTTGGATTCATGTCGGAGGAGCTTAGAAGAAGCAAATGCCAGTATTGCAAGTAATGACGAAAGTGATAATGTGGCCTTGATTATTGACGGTACCAGCCTCATATATGTACTCGACAATGATCTTGAAGATGTGCTGTTCCAGGTGGCATGTAAGTGCTCTGCGATACTCTGCTGCCGGGTTGCTCCTTTCCAGAAAGCTGGAATCGTTGCACTTGTAAAGAACCGGACTTCTGACATGACTCTTGCCATTGGTGATGGTGCCAATGATGTCTCCATGATTCAAATGGCTGATGTTGGGGTAGGGATAAGCGGACAAGAAGGTCGCCAAGCTGTGATGGCATCTGATTTCGCAATGGGACAGTTCAGATTTTTAGTTCCGTTATTGCTCGTCCATGGACACTGGAATTACCAAAGGATGGGTTACATGATACTATATAATTTCTATAGAAATGCAGTTTTTGTTCTAATTTTATTTTGGTACGTTTTGTTTACTTGCTACACCTTGACAACTGCCATCACAGAATGGAGCAGTGTTTTGTACTCAGTCATATACACAGCAATCCCTACAATAATTATCGGTATTCTTGACAAAGACCTTGGAAGGCAGACTCTTCTTGATCATCCTCAGCTCTACGGTGTTGGCCAGAGGGCAGAGGGATATTCCACTACGCTCTTCTGGTATACAATGATTGACACAATCTGGCAAAGTGCAGCCATCTTCTTCATTCCTATGTTTGCTTATTGGGGCAGTACAATTGACACGTCGAGCCTAGGAGACCTATGGACGATAGCTGCAGTTGTGGTGGTTAATCTTCACTTGGCCATGGATGTGATCAGATGGAACTGGATCACACACGCCGCCATATGGGGATCCATTGTTGCAGCTTGTATATGTGTCATTGTGATTGATGTTATACCCACACTCCCTGGTTACTGGGCAATTTTCCAAGTGGGCAAGACATGGATGTTCTGGTTCTGCTTGCTAGCAATAGTTGTGACATCATTGCTTCCTAGATTCGCCATCAAGTTTCTAGTGGAGTATTACAGACCTTCCGATGTTCGGATAGCTAGGGAGGCTGAAAAGCTTGGAACTTTCAGAGAATCCCAACCCGTGGGAGTTGAAATGAACCTGATTCAGGATCCTCCACGGAGATGA
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的方法包括如下的步骤：
1)获得拟南芥AtALA1基因：引入SmaI和SalI酶切位点设计引物，然后以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物即为添加酶切位点的AtALA1基因序列；
2)构建组成型表达AtALA1基因的植物表达载体：将扩增获得的AtALA1基因序列分别插入双子叶植物表达载体pLGN-35S-Nos与单子叶植物表达载体pCambia2300-Ubi1-Nos，构建两个新的植物表达载体，分别命名为pLGN-35S-AtALA1-Nos与pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos；
3)植物的遗传转化：利用农杆菌浸花法与基因枪转化法，将上述步骤2)获得的pLGN-35S-AtALA1-Nos与pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体整合入植物基因组，实现AtALA1基因在转基因植物内的组成型表达，降低DON含量而提高转基因植物对禾谷镰刀菌的抗性；
4)低DON含量抗禾谷镰刀菌的AtALA1转基因植株的获得：将上述步骤3)获得的转基因植物进一步进行繁殖、分子鉴定和抗病性鉴定，获得低DON含量抗禾谷镰刀菌的AtALA1转基因植株。
进一步，组成型表达的pLGN-35S-AtALA1-Nos植物表达载体构建的步骤包括：获得拟南芥AtALA1的cDNA后，设计上游引物：5’-TCCCCCGGGATGGATCCCAGGAAATCAATTG(SmaI)-3’，下游引物5’-ACGCGTCGACTCATCTCCGTGGAGGATCCTGA(SalI)-3’进行PCR扩增，扩增产物和pLGN-35S-Nos载体分别进行SmaI和SalI双酶切，分别回收酶切后的大片段，再利用连接酶将回收片段进行连接，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-AtALA1-Nos，以实现AtALA1基因在转基因植物内的组成型表达。组成型表达的pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体构建的步骤包括：pCambia2300-GUS载体经Sal I/Kpn I酶切，与单子叶植物组成型启动子Ubi1融合AtALA1(Ubi1-AtALA1)的片段经同源重组获得重组质粒。
不限制任何机理，本发明所提供的降低DON含量而提高植物对禾谷镰刀菌抗性的方法，是将来自植物的AtALA1基因转入目标植物中，实现该基因在转基因植株中的组成型表达，利用P4类ATP酶转运降解DON等禾谷镰刀菌毒素，提高转基因植物对禾谷镰刀菌毒素的解毒能力，进而提高转基因植物对禾谷镰刀菌的抗性。
本发明根据AtALA1突变体对呕吐毒素(DON)敏感且丧失将其转运至液泡的特性，结合禾谷镰刀菌致病机理的特性，创造性地提出利用AtALA1基因在转基因植物中组成型表达，降低转基因植物中的DON含量，提高其对DON的解毒能力，进而提高转基因植物对禾谷镰刀菌抗性的策略。
本发明主要是利用转基因产物对禾谷镰刀菌毒素的转运降解机制，降低转基因植物中毒素含量，提高其对禾谷镰刀菌的抗病性，更进一步的以相同的方式利用转基因产物提高植物对其他真菌毒素的解毒能力也是本发明的保护范围。同时本发明中涉及的植物表达载体，转基因植株等也在本发明的保护范围内。
本发明获得的AtALA1转基因拟南芥，T3代纯合转基因株系OE-25经50μg/mL DON处理17d，DON含量为5.49ng/g，较野生型(WT)对照降低3.42ng/g。用DON(5μg/mL)与FM4-64(8μM)处理10h，超表达株系OE-25与OE-15中5-FAM-DON均进入FM4-64标记的液泡，荧光强度分别为6.56、6.52，分别比WT升高3.53、3.49。结果表明超量AtALA1促进了DON向液泡的转运与降解，提高了对其耐受性。利用本发明获得的转基因玉米T2代植株，用30μM DON处理玉米籽粒(胚根0.2cm)2d，洗去DON继续培养3d，13-3与15-2转化子胚根长度分别达到1.7cm、1.4cm，分别比WT提高1.4、1.1cm。DON含量检测结果显示，13-3与15-2转化子分别比WT降低56％、52％。此外，接种禾谷镰刀菌7d，13-3与15-2转化子病斑面积分别为6mm2、11mm2，分别比WT减少60％、27％；孢子数分别为1.3×105个/mL、2.4×105个/mL，分别比WT减少87％、76％，表明表达AtALA1提高了玉米对禾谷镰刀菌的抗性。研究结果表明，利用本发明方法获得的转基因拟南芥和玉米可以显著降低DON含量，提高对禾谷镰刀菌的抗性。说明，本发明提供的降低植物中DON含量，提高植物对禾谷镰刀菌抗性的方法效果显著。该方法不仅适用于拟南芥和玉米，所有能受禾谷镰刀菌侵染的植物均可利用该方法降低其DON含量，提高对禾谷镰刀菌的抗性。
本发明提供的方法主要是利用植物对病原菌毒素的转运降解机制，降低病原菌毒素含量达到解毒的目的，进而提高植物的抗性，因而不具有病原菌小种抗性的特点。因此，该方法不存在小种专一性抗性的限制，可广泛应用于提高不同病原菌生理小种的抗性。
附图说明
图1为拟南芥ala1-12突变体的获得
A为ala1-12突变体的突变位点，该突变位点在AtALA1外显子区域(图中三角形位置)；exon为外显子，intron为内含子；LP，RP，LBb1.3：鉴定纯合突变体用引物；B为PCR鉴定ala1纯合突变体，a：LP+RP扩增产物，约1100bp；b：LBb1.3+RP扩增产物，约700bp；DNA分子量标准为Marker 2000；4与12：获得的纯合突变体；Col-0：野生型拟南芥；C为实时荧光定量PCR检测野生型(Col-0)与突变体中AtALA1表达量。
图2为对DON敏感的拟南芥突变体筛选
A为野生型(Wild Type：Col-0)与不同拟南芥突变体对100μg/mL DON的敏感性检测结果；ala1,ala10,ala6,ala3及ala7：拟南芥不同P4-ATPases突变体；B为DON处理下，统计拟南芥白化叶片所占比率。
图3为不同拟南芥P4-ATPases突变体对DON的转运情况
野生型(Wild Type：Col-0)；ala1,ala10,ala6,ala3及ala7：拟南芥不同P4-ATPases突变体；FM4-64：一种膜染料，用以染色细胞膜与液泡膜；5-FAM：用荧光集团5-FAM(5-羧基荧光素)标记DON，在488nm激发光下发出绿色荧光。
图4为植物表达载体结构图；
A：pLGN-35S-AtALA1-Nos植物表达载体图，该载体中包含一个2×35S启动的GUS::NPTⅡ融合基因的表达框，一个35S启动的AtALA1基因的表达框；
B:pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体图，该载体中包含一个2×35S启动的NPTⅡ基因的表达框，一个单子叶组成型表达Ubi1启动的AtALA1基因的表达框。
图5为pLGN-35S-AtALA1-Nos载体质粒酶切验证结果
M：DNA分子量标准Marker15；ALA1：pLGN-35S-AtALA1-Nos载体质粒经酶切后的获得的ALA1目标片段。
图6为ala1中互补AtALA1拟南芥对DON的耐受性
Col-0：野生型拟南芥；ala1：AtALA1纯合突变体；ala1/ALA1：ala1中互补AtALA1拟南芥；50μg/mL DON处理7d后拍照，Bar＝1cm。
图7为转基因拟南芥中AtALA1基因的表达水平
Col-0：野生型拟南芥；4、7、9、10、11、13、15、24、25、27、28和29：AtALA1转基因拟南芥独立的转化子。
图8为ala1与超量AtALA1拟南芥对DON的耐受性检测A,B：DON(50μg/mL)处理5d的结果，Bar＝5mm；C：DON(50μg/mL)处理14d的结果,Bar＝1cm；ala1-12：拟南芥AtALA1纯合突变体；OE 15-4，OE 25-1：超量AtALA1拟南芥表达量高的T3代纯合植株。
图9为野生型、突变体ala1及超表达AtALA1拟南芥中DON含量检测结果
DON(50μg/mL)处理以下拟南芥幼苗7d，ELISA检测DON含量；WT：野生型拟南芥；ala1：AtALA1拟南芥纯合突变体；11,15,4及24为超量AtALA1拟南芥不同转化子。
图10为pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体构建流程图
pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体图，该载体中包含一个2×35S启动的NPTⅡ基因的表达框，一个单子叶组成型表达Ubi1启动的AtALA1基因的表达框。
图11为pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos载体酶切电泳图
M：DNA分子量标准DM3100；Ubi1-AtALA1：pCambia2300-Ubi1-AtALA1-Nos载体质粒经SalI/KpnI双酶切后的获得的目标片段。
图12为Ubi::AtALA1转基因玉米的PCR鉴定
M：DNA marker 2000；1：以野生型玉米DNA为模板，为阴性对照；2：以构建成功的Ubi::AtALA1质粒为模板，为阳性对照；3-18：以不同转基因玉米DNA为模板的扩增结果。
图13为Ubi::AtALA1转基因玉米各转化子中AtALA1的表达量
表达量分析的内参基因为EF1a，数据为3次重复的平均值；2～N-1：Ubi::AtALA1转基因玉米不同转化子。
图14为DON处理下AtALA1转基因玉米的表型
A为DON处理下玉米籽粒表型；B DON处理下，玉米根长统计结果；C玉米籽粒中DON含量；DON处理浓度为50μM；WT：野生型玉米籽粒；Null：转基因株系中分离的非转基因植株对照；13-3,15-2:表达AtALA1表达量高的玉米籽粒；标尺＝1cm。
图15为AtALA1转基因玉米对T-2毒素的耐受性结果
A为T-2毒素(30μM)对玉米根长的影响；B为T-2毒素下玉米根长统计结果；WT：野生型玉米籽粒；13-3：13-3号T1代转基因玉米籽粒；15-2：15-2号T1代转基因玉米籽粒；标尺＝0.5cm。
图16为AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌的耐受性分析
A：接种禾谷镰刀菌的表型；B：病斑面积统计；C：孢子数量统计；WT:野生型玉米籽粒；13-3：13-3号T1代转基因玉米籽粒；15-2：15-2号T1代转基因玉米籽粒；标尺＝0.5cm。
图17为AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌的抗性
A为浸泡法在玉米幼嫩籽粒接种禾谷镰刀菌；B为接种3d后的孢子数统计结果。WT：野生型玉米籽粒；13-3：13-3号T1代AtALA1转基因玉米籽粒；15-2：15-2号T1代AtALA1转基因玉米籽粒；标尺＝0.3cm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定。
本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。
1、发明技术核心策略的提出
1.1 AtALA1基因缺失拟南芥纯合突变体的获得
1.1.1拟南芥突变体获得与种植
拟南芥突变体购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCentre,ABRC)的T-DNA插入突变体，编号分别为：ala1(SALK_056947),ala3(SALK_082157),ala6(SALK_150173),ala7(SALK_125598),ala10(SALK_024877)。
拟南芥种子培养方法：将种子分装到1.5mL离心管中，用75％酒精0.1％吐温80反复振荡25min进行表面消毒，灭菌蒸馏水冲洗种子3-5次后，0.2％琼脂糖的无菌培养基重悬种子，用移液器将种子铺在在1/2MS固体培养基(2.2g/L MS盐，15g/L蔗糖，2g/L Gelrite，pH 6.0)。4℃冰箱中冷处理2d后按以下条件培养：
16h光照/8h黑暗，150μmolm-2S-1光照强度、70％相对湿度、温度为22℃。当幼苗生长10d后，移到土中(营养土与蛭石的比例大约为1:1)，用加入1.5L水和1L B5营养液培养植物。温室光照条件：16h光照/8h黑暗，温度为22℃。
1.1.2拟南芥纯合突变体获得
取拟南芥叶片约0.1g，利用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab产品,目录号：DN15)提取DNA，操作严格按照说明书进行。突变体筛选PCR引物根据Signal网站设计(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)。
PCR反应总体系为10μL：1μL模板、引物各0.5μL(20mmol·L-1)、5μL 2×Taq PCRMaster Mix、3μLddH2O。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；再于72℃延伸10min。
扩增引物为：
LP-ala1:5’-GCCATTGGTGATGGTAATGAC-3’(SEQ ID NO.1)
RP-ala1:5’-ACCAGAACATCCATGTCTTGC-3’(SEQ ID NO.2)
LBb1.3:5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’(SEQ ID NO.3)
1.1.3对DON敏感的拟南芥突变体的获得
在1/2MS固体培养基中种植野生型(Col-0)与纯合突变体拟南芥，待根长至2cm左右，转移至含75μg/mL DON的1/2MS固体培养基中，7d后观察、拍照并统计白化叶片所占比率，结果显示(图2)，ala1叶片白化更加严重，其白花叶片所占比率近90％，而其他突变体与野生型相比无显著差异。用5-FAM标记的DON与膜染料FM4-64同时处理野生型与突变体拟南芥，结果表明(图3)，处理20h后只有ala1的液泡中没有5-FAM标记的DON，表明AtALA1可能在提高拟南芥对DON的耐受中发挥重要作用。
1.2发明技术核心策略的提出
实施实例1.1.3的研究结果表明，AtALA1基因T-DNA突变体ala1对DON更敏感，且失去了转运DON进入液泡的功能。AtALA1属于P4-ATPases家族成员，是包含10个跨膜域的膜蛋白，该蛋白家族在维持细胞膜磷脂不对称分布、起始囊泡形成及介导细胞内囊泡运输中发挥重要作用。因此我们推测，DON可能通过AtALA1介导的囊泡运输，被转运至液泡存储或降解，从而在提高拟南芥对DON的耐受性中发挥重要作用。禾谷镰刀菌分泌很多种毒素，而很多毒素与DON结构类似，结合禾谷镰刀菌毒素对人畜的严重危害，本发明创造性地提出该发明的核心策略，“利用植物来源的P4-ATPases来降低禾谷镰刀菌毒素如DON等的含量，同时提高转基因植株对禾谷镰刀菌的抗性”。
2、AtALA1基因的获得
2.1拟南芥RNA的提取及cDNA的合成
取适量野生型拟南芥(Col-0)叶片，利用液氮研磨法，按Aidlab公司的EASYspinRNA快速提取试剂盒使用说明书提取拟南芥的总RNA，获得的RNA经1％琼脂糖电泳检测质量。再利用TaKaRA公司的PrimeSc-
2.2AtALA1基因的克隆
以实施实例2.1获得的拟南芥cDNA为模板，以AtALA1基因上游引物上游引物：5’-TCCCCCGGG ATGGATCCCAGGAAATCAATTG(SmaI)-3’(SEQ ID NO.4)，下游引物5’-ACGCGTCGACTCATCTCCGTGGAGGATCCTGA(SalI)-3’(SEQ ID NO.5)为引物，利用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶进行PCR扩增，回收扩增产物，获得带有SmaI/SalI酶切位点的AtALA1基因片段。
PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM上下游引物各2μL，模板(50μg/μL)4μL，KOD-Plus-Neo 1μL(1U/μL)，加水至50μL；
扩增程序为94℃2min；98℃10s，68℃4min，循环35次。
3、双子叶植物表达载体pLGN-35S-AtALA1-Nos的构建及农杆菌转化
3.1 pLGN-35S-Nos植物表达载体的获得
pLGN-35S-Nos为本实验室由pCambia2300改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域)替换成组成型启动子CaMV35S-P控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，并在这个表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。
3.2 pLGN-35S-AtALA1-Nos植物表达载体的构建
将上述实施实例2.2获得的片段与pLGN-35S-Nos实施实例3.1中的载体质粒，分别用SmaI/SalI进行双酶切并回收酶切片段，然后利用T4-DNA连接酶连接回收的AtALA1基因片段和pLGN-35S-Nos载体片段。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行酶切验证(如图5所示)，结果表明，已成功将AtALA1基因片段连接入pLGN-35S-Nos载体。测序结果与公布的AtALA1基因序列一致，具体序列见SEQ ID NO.14。测序正确的植物表达载体pLGN-35S-AtALA1-Nos单克隆于-80℃保存备用，载体具有图4所示的结构。
3.3植物表达载体pLGN-35S-AtALA1-Nos重组农杆菌的获得
利用电转化法，将步骤3.2获得的pLGN-35S-AtALA1-Nos植物表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，利用卡那霉素与利福平作为筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农杆菌质粒并用SmaI/SalI进行双酶切，经1％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得了3477bp的目的片段(酶切结果与图5酶切结果相同)，表明获得了含有pLGN-35S-AtALA1-Nos植物表达载体的重组农杆菌。
4、拟南芥的遗传转化
4.1植株种植
拟南芥种植于1/2MS培养基中，待其长出2片真叶时移至培养土中，在光照培养箱生长，培养条件为：温度22℃/20℃，16h光照/8h黑暗，70％相对湿度，光强150μmol/m2/s。待其长至初生花序约5～15cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，有益于次生花序的生长发育，便于渗透转化。渗透转化应在去除初生花序3～5d内完成，并且在渗透转化的前1d植物需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开。
侵染Col-0获得AtALA1转基因拟南芥；侵染ala1纯合突变体获得互补AtALA1拟南芥(ala1/AtALA1)。
4.2菌液的培养
取-80℃保存的含pLGN-35S-AtALA1-Nos载体的农杆菌菌株，在含有50mg/L Rif与50mg/L Km的YEB固体培养基(5g/L蔗糖，1g/L酵母提取物，10g/L胰化蛋白胨，0.5g/LMgSO4·7H2O，15g/L琼脂粉，pH 7.0)划线培养获得单菌落，挑取单菌落，接种入附加50mg/LKm和125mg/L Sm(硫酸链霉素)的YEB培养基中(5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0)，28℃、200rmp振荡培养过夜，至菌液OD600值达到0.8时，于转化前一天晚上，按1:100进行大量过夜培养(Rif：25mg/L；Kana：50mg/L)。待其由暗红色变为橘黄色时，加入乙酰丁香酮(50mg/L)，继续培养2h至OD600约2.0。室温5000r/min离心15min,弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于等体积的渗透培养基(蔗糖50g/L；MS盐2.37g/L；Silwet L-77 500μL/L)，使OD600在0.8左右，用于拟南芥侵染。
4.3浸花法转化拟南芥
用携带目的基因的农杆菌悬浮液侵染拟南芥的地上部分，侵染1min后用黑膜罩覆盖，暗培养12h左右，揭开黑膜并正常培养，侵染1周左右方可浇水，根据其生长情况可再侵染1-2次，继续培养至植物成熟，收获T0代种子用于筛选阳性转化子。
4.4转基因拟南芥的分子鉴定
4.4.1 AtALA1转基因拟南芥的GUS组织化学染色鉴定
参照Jefferson等(1987)的方法，用镊子取转基因植株幼嫩叶片于GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L K4Fe(CN)6，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na2EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0)中，37℃反应3h。染色后，75％乙醇脱色，每4h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。
4.4.2 AtALA1转基因拟南芥的PCR鉴定
所有再生的GUS组织化学染色呈阳性反应的转基因植株，取其幼苗叶片约0.1g，按照说明书的操作程序，利用Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，获得DNA后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后以提取的DNA为模板，扩增载体特异性片段，以检测再生植株是否整合了AtALA1基因。
PCR扩增引物为：
上游引物：5’-AACAGGCCGATAATGCGCTA-3’；(SEQ ID NO.6)
下游引物：5’-GTCTCGGGAAGTCCTTGCTT-3’(SEQ ID NO.7)。
25μL扩增体系包括：10×LAPCR Buffer，2.5μL；25mmol/L MgCL2，2.5μL；2.5mmol/L dNTP Mixture，2μL；模板DNA，1μL(约10ng)；5μmol/L上游引物，1μL；5μmol/L下游引物，1μL；LA Taq酶，0.2μL；ddH2O，14.8μL。
PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃，30s，57℃，30s，72℃，30s，扩增30个循环；72℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
5转基因植株中AtALA1的转录水平检测
5.1 RNA的提取及cDNA的合成
利用植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab产品)，提取植物RNA，所有操作严格按说明书进行，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用Prime
5.2 AtALA1基因转录水平检测
利用Real-time PCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，拟南芥以Atactin2基因为内标。
10μL反应体系包括：cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×iQ SYBR Green Supermix5μL，用无RNA酶的双蒸水补足10μL。
扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。
6、AtALA1转基因拟南芥的DON处理与含量检测
6.1 DON处理
种植野生型(Col-0)、纯合突变体ala1及互补AtALA1拟南芥(ala1/AtALA1)于1/2MS固体培养基，待根长至2cm左右，转移至含50μg/mL DON的1/2MS固体培养基中，7d后发现ala1叶片白化最严重，其子叶及部分真叶黄化萎蔫；野生型拟南芥部分子叶黄化萎蔫，而回复植株未观察到黄化的叶片(图6)，表明互补AtALA1回复了对DON的耐受性。
选择AtALA1转基因拟南芥中表达量高的转化子25与15，观察对DON的耐受性，发现50μg/mLDON处理5d时发现突变体ala1-12叶片失绿黄化甚至白化死亡，而超表达株系25与15大部分叶片仍为绿色叶片(图8A,B)；处理9d，突变体ala1-12叶片皱缩、失绿黄化，下部叶片白化死亡，而超表达株系25虽有少数黄化叶片，但大部分叶片仍为绿色且叶片舒展不皱缩，部分植株甚至抽薹开花(图8C)，表明超表达AtALA1提高了对DON的耐受性。
6.2 DON含量检测
6.2.1样品准备
将根长2cm左右的野生型(Col-0)，突变体ala1及AtALA1转基因拟南芥，转移至含100μg/mL DON的1/2MS固体培养基中处理7d，取样并立即用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱用于DON含量检测。
6.2.2 DON提取方法
严格按照ELISA试剂盒(北京华安麦科科技有限公司)中方法进行DON含量检测，具体方法如下：
(1)将所需试剂从冷藏环境中取出置于室温(20～25℃)平衡1h以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(2)取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃，切勿冷冻；
(3)洗涤工作液在使用前也需回温；
(4)请注意反应温度不宜过高，控制温度在20～25℃；
(5)编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；
(6)加标准品/样本：加标准品/样本50μL到对应的微孔中，加酶标物50μL/孔，再加入抗试剂50μL/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃环境中避光反应15min；
(7)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，在吸水纸上拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(8)显色：加入底物液100μL/孔，用盖板膜盖板后置25℃环境中避光反应5min；
(9)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。
6.2.3定量分析
(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％即
B—标准品或样本溶液的平均吸光度值；
B0—0(μg/kg)标准品的平均吸光度值。
(2)标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度(μg/kg)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呕吐毒素的实际量。
根据以上方法检测拟南芥不同植株中DON含量，发现DON在缺失突变体ala1中的含量高于对照；而超表达AtALA1植株中DON含量均低于对照(图9)，且在检测的超表达AtALA1植株中，表达量最高的15号植株其DON含量最低(图7,图9)，说明毒素含量的降低与该基因的表达水平正相关。
7、单子叶植物表达载体pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos的构建及农杆菌转化
7.1单子叶组成型启动子Ubi1与AtALA1基因融合片段的获得
分别用以下引物扩增Ubi1与AtALA1，并通过融合PCR获得Ubi1-AtALA1融合片段。
扩增Ubi1上游引物:5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCGCAGTGCAGCGTGACCCG-3’(SalI)(SEQ ID NO.8)
下游引物:5’-ATTGATTTCCTGGGATCCATAAGGCCTTTGCAGAAGTAACACCAA-3’(SEQ IDNO.9)
AtALA1上游引物:5’-TTGGTGTTACTTCTGCAAAGGCCTTATGGATCCCAGGAAATCAATTG-3’(StuI)(SEQ ID NO.10)
AtALA1下游引物:5’-TCGGGGAAATTCGAGCTCGGTACCTCATCTCCGTGGAGGATCCTG-3’(KpnI)(SEQ ID NO.11)
PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM上下游引物各2μL，模板(50μg/μL)4μL，KOD-Plus-Neo 1μL(1U/μL)，加水至50μL。扩增程序为94℃2min；98℃10s，68℃4min，循环40次。对扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收正确的片段用于融合PCR。
融合PCR扩增体系：Ubi1回收片段2μL，AtALA1回收片段2μL，10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，KOD-Plus-Neo 1μL(1U/μL)，加水至46μL，按以下程序扩增15次循环：94℃2min；98℃10s，68℃4min。在以上扩增体系中加入扩增Ubi1上游引物2μL，AtALA1下游引物2μL，按以下PCR扩增程序：94℃2min；98℃10s，68℃6min，循环30次。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收正确的Ubi1-AtALA1融合片段。
7.2 pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos单子叶植物表达载体的构建
pCambia2300-GUS为本实验室保存。其T-DNA区段(RB和LB之间区域)包含一个报告基因GUS和一个2×CaMV35S控制的NPTII标记基因。
将pCambia2300-GUS载体质粒经SalI/KpnI双酶切并回收大片段，与上述实施实例7.1获得的片段经同源重组的方法进行连接，通过热激转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行SalI/KpnI双酶切验证(如图11所示)，结果表明，已成功将Ubi1-AtALA1片段连接入pCambia2300-GUS载体。测序结果与公布的Ubi1及AtALA1序列一致，AtALA1具体序列见SEQID NO.14，Ubi1具体序列见SEQ ID NO.15。将测序正确的单子叶植物表达载体pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos单克隆于-80℃保存备用，载体具有图10所示的结构。
7.3单子叶植物表达载体pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos重组农杆菌的获得
利用电转化法，将步骤7.2获得的pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，利用卡那霉素与利福平作为筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农杆菌质粒并用SalI/KpnI双酶切验证，经1％的琼脂糖凝胶进行电泳，酶切结果与图11酶切结果相同，表明获得了含有pCambia-Ubi1-AtALA1-Nos植物表达载体的重组农杆菌。
8、玉米的遗传转化
8.1玉米转化用培养基
N6E(愈伤诱导培养基)：N6盐+N6有机+2，4-D(2mg/L)+蔗糖30g/L+100mg/L肌醇+脯氨酸2.76g/L+水解酪蛋白100mg/L+Gelrite 2.5g/L，pH 5.8，高温高压灭菌后加入AgNO31ml/L(母液25mM)。
N6OSM(渗透培养基)：N6盐+N6有机+2，4-D(2mg/L)+蔗糖30g/L+脯氨酸0.69g/L+水解酪蛋白100mg/L+山梨醇36.4g/L+甘露醇36.4g/L+Gelrite 2.5g/L，pH 5.8，高温高压灭菌后加入AgNO3 1ml/L(母液25mM)。
N6S(筛选培养基)：N6盐+N6有机+2,4-D(2mg/L)+100mg/L肌醇+蔗糖30g/L+Gelrite 2.5g/L，pH 5.8，高温高压灭菌后加入AgNO30.2 ml/L(母液25mM)以及筛选所需试剂。
25D1B(过渡培养基)：MS盐+MS有机+肌醇100mg/L+2,4-D(0.25mg/L)+蔗糖30g/L+Gelrite 2.5g/L，pH 5.8，高温高压灭菌后加筛选所需试剂。
Reg1(再生培养基1)：MS盐+MS有机+肌醇100mg/L+蔗糖60g/L+Gelrite3g/L，pH5.8，高温高压灭菌后加入筛选所需试剂。
Reg2(再生培养基2)：MS盐+MS有机+肌醇100mg/L+蔗糖30g/L+Gelrite3g/L，pH5.8，高温高压灭菌后加入筛选所需试剂。
8.2玉米转化材料的灭菌以及幼胚的获得
玉米栽种至试验地，选择授粉后7-10d的玉米幼胚进行愈伤诱导，但是自然条件下玉米在抽穗后1-4d都可以自动授粉，很难准确计算玉米授粉具体时间，因此在玉米抽穗当天光照较好时段进行人工授粉，从人工授粉开始计算授粉的天数，授粉后7-15d的玉米幼胚都能够诱导出需要的愈伤，但天数越久的玉米种子灭菌越不彻底。
玉米幼胚的分离步骤：
(1)将整个玉米穗头部和尾部各2cm长的部分横向切除，只用玉米果穗中间部分的玉米籽粒剥取幼胚；
(2)果穗中间部分分成若干段，放入实验室组织培养常用的广口瓶中，加入75％酒精，灭菌2min后倒出酒精；
(3)用无菌水清洗果穗段至少两次；
(4)加入0.1％升汞溶液灭菌6-8min，然后用水洗至少六次；
(5)用镊子和解剖刀将完整玉米粒剥离到灭菌好的培养皿中，用镊子夹住玉米粒胚乳丰富的尾部，然后用小刀轻轻从玉米头部挑出玉米幼胚，并将其放入N6E培养基中28℃暗培养3d。
注意事项：N6E培养基诱导的健康愈伤一般呈浅黄色块状硬性颗粒，颗粒一般簇拥成块状，少有散成单独颗粒生长；在25D1B培养基中生长时，将愈伤分成约3-5cm直径的小团，一个广口瓶中摆放5个左右的小团即可；同样，在Reg1培养基中生长时也采用此方法。
8.3基因枪转化用试剂配制
8.3.1金粉的制备
(1)称取60mg金粉(Bio-Rad M-10)，加入1.5mL EP管中；
(2)加入70％的乙醇(新鲜配制)；
(3)剧烈振荡(vortex)3-5min，静置15min；
(4)离心沉淀微粒(12000g,1min)，弃上清；
(5)加入1mL ddH2O，震荡涡旋1min，静置1min；
(6)离心沉淀微粒(12000g,1min)，弃上清；
(7)重复6-9步骤2次，共清洗3次；
(8)加入50％甘油1mL，充分涡旋震荡，50μL分装，-20℃保存备用。
8.3.2微粒与DNA的包裹
(1)涡旋已配好的金粉5min，使其尽量分散；
(2)取50μL分装金粉，剧烈震荡2min，按照顺序加入：
质粒DNA10μL；氯化钙(2.5M)35μL；亚精胺(0.1M)15μL；
(3)涡旋震荡2min，静置5min，1000rpm离心3-5s；
(4)吸取上清液，余留10μL，枪头吸打或涡旋混匀；
(5)取2μL混合均匀的样品于载体膜(macrocarrier)上，每个载体膜上点两滴(对照和待测样各一)，对准双枪的枪孔；
(6)终止屏(Stopping screen)到目标架(target shelf)的距离设置为6cm，破裂膜(rupture disk)到载体膜的距离为1cm，破裂膜的压力为650psi，真空度为28psi，其它均为默认设置；
(7)每轰击完一次，用70％的酒精将双枪枪头擦干净，自然风干；
8.4玉米幼胚愈伤的基因枪转化
(1)将要转化的玉米幼胚放入垫有滤纸的N6OSM培养基中，28℃暗培养4h后用于转化；
(2)转化时，将约10个左右的幼胚放在培养皿中间，愈伤起始萌发的部位朝上放置，距离载膜6cm；
(3)破裂膜的压力为650psi；
(4)基因枪使用方法严格按照参照基因枪使用说明(Bio-Rad He/1000 particledelivery system)；
(5)转化后的材料及时取出，在垫有滤纸的N6OSM培养基中28℃暗培养16-20h；
(6)最后将材料转入N6E培养基中暗培养。
注意事项：基因枪转化效率较高，但是污染比较严重，所以基因枪使用前内部灭菌一定要仔细；在转化时，在培养皿中央最好放置湿润滤纸，将材料放于其上，可以防止材料置放太久失水；在培养基上放置材料时一定注意将愈伤起始部位朝上摆放。
8.5玉米材料转化后的组织培养
(1)在N6E培养基中诱导培养10-14d的玉米幼胚已经有部分的愈伤长出，此时可以将材料移至N6S培养基中继续暗培养；
(2)在N6S培养基中暗培养的组织材料一般15-20d继代一次，约6至8周以后就长出具有筛选抗性的愈伤；
(3)如果产生的愈伤较少，在转入Reg1培养基以前，可以放入25D1B培养基暗培养3周左右，这样可以帮助产生比较多的健康愈伤用于植株再生培养；
(4)玉米在Reg1培养基暗培养2到3周，就可以发现有比较多的白色体胚长出；
(5)将白色体胚放入Reg2培养基中光培养3周左右，就可以得到再生幼苗。
8.6AtALA1转基因玉米的分子验证
8.6.1 PCR扩增验证
通过基因枪进行玉米遗传转化，获得T0代转基因玉米植株，共23株独立转化子。利用植物Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取AtALA1转基因玉米DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。以提取的玉米DNA为模板，以检测转基因玉米中是否整合了AtALA1基因。
PCR扩增引物为：
上游引物：5’-ATGGATCCCAGGAAATCAATTG-3’(SEQ ID NO.12)；
下游引物：5’-AGCCAACCTATTGTTCTCAACTCTA-3’(SEQ ID NO.13)。
10μL扩增体系包括：2×TaqMaster mix 5μL；模板DNA，1μL；5μmol/L上游引物0.5μL；5μmol/L下游引物0.5μL；ddH2O 3μL。
PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR结果显示阳性对照和选取的16个转化子均能扩增出目的条带(图12)，野生型不能扩增出目的条带，表明在玉米中成功表达了AtALA1基因。
8.6.2 AtALA1转基因玉米的转录水平检测
利用Real-time PCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，以玉米EF1a基因为内标。
10μL反应体系包括：cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，2×iQ SYBR Green Supermix5μL，用无RNA酶的双蒸水补足10μL。
扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。结果显示，AtALA1基因得到不同程度的表达，其中表达水平较高有4号和13-3号转化子(图13)。
9、AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌及其毒素的抗性
9.1 AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌毒素DON与T-2的抗性
9.1.1AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌毒素DON的抗性
选择萌发至0.2cm左右的AtALA1转基因和野生型玉米籽粒，用30μM DON处理2d，蒸馏水洗去DON后恢复正常培养，3d后发现转基因玉米仍能正常生长，出现较长的根与茎；而野生型及阴性对照中根的生长受到明显抑制，部分籽粒出现不同程度的腐烂现象(图14A)。根长统计结果显示(图14B)野生型玉米根长为0.3cm，与处理前相比没有明显的增长；13-3转化子与15-2转化子的根长都明显比野生型长，其中表达量较高的13-3长度达到1.7cm，比野生型长1.3cm；表达量次之的15-2号转化子根长达到1.4cm，比野生型长1cm，表明表达AtALA1缓解了DON对玉米根长的抑制作用。DON含量检测结果显示表达量较高的13-3号转化子中DON含量分别比野生型和对照组低105，110ppb；表达量次之的15-2号转化子DON含量分别比野生型和对照组低95，100ppb(图14C)，表明表达AtALA1降低了DON在玉米籽粒中的累积，提高了对其抗性。
9.1.2AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌T-2毒素的抗性
观察AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀菌的A类毒素T-2毒素是否也具有耐受性。同样用30μM T-2毒素处理萌发后的籽粒2d后恢复正常培养。结果发现(图15A)野生型籽粒的根长与处理前相比无明显变化，而表达量较高的13-3号转化子根长达到0.58cm，比野生型长了93％左右，表达量次之的15-2号转化子根长为0.6cm左右，比野生型和对照长100％(图15B)，表明表达AtALA1提高了玉米对T-2毒素对的抗性。
9.2 AtALA1转基因玉米对禾谷镰刀的抗性
选取授粉后18-20d的野生型及AtALA1转基因玉米籽粒，分别用注射法和浸泡法接种玉米籽粒进行抗病性分析。注射法接种禾谷镰刀菌7d，发现野生型玉米籽粒的接种部位明显变黑，布满大量白色菌丝，且病斑较大；而13-3与15-2转基因籽粒接种部位的禾谷镰刀菌菌丝量较野生型明显较少(图16)，统计病斑面积(图16B)，结果显示野生型籽粒接种后发病面积为15mm2，13-3号转化子病斑面积为6mm2，比野生型减少了60％；15-2号转化子病斑面积为11mm2，比野生型减少了27％；统计籽粒上的孢子数量(图16C)，结果显示野生型籽粒上的孢子数量为1.0×106个/mL，13-3号转化子为1.3×105个/mL，比野生型减少了87％；15-2号转化子为2.4×105个/mL，比野生型减少76％。上述结果表明表达AtALA1提高了玉米对禾谷镰刀菌的抗性。
用浸泡法接种禾谷镰刀菌于幼嫩的玉米籽粒，发现13-3与15-2转基因玉米籽粒的黄色表皮大部分可见，仅有少量白色菌丝，而野生型玉米籽粒表面布满白色菌丝，几乎看不到玉米的黄色表皮(图17A)；孢子数统计结果显示(图17B)，13-3和15-2号转化子孢子数为1×105个/mL，显著低于野生型(1.5×106个/mL)，表明表达AtALA1抑制了禾谷镰刀菌对玉米的侵染能力。
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