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具有耐盐功能的基因及其应用

2021-03-30 08:04:40

具有耐盐功能的基因及其应用

　　技术领域

　　本发明属于生物技术领域，涉及具有耐盐功能的基因及其应用。

　　背景技术

　　能源问题是当今世界的主要问题，能源短缺日益严重，所以研究、开发和生产生物质可利用能源对于我国今后经济发展、科技创新发展和国家的稳定等具有重大意义。对于我国来说，盐碱地面积巨大，土壤含盐量高，但是往往缺水。因此，如何开发和利用大面积的盐渍化土地，提高作物产量是急需解决重要问题。在自然界中，植物的生长过程受许多非生物胁迫影响，其中盐胁迫是主要的非生物胁迫，也是造成作物减产的主要因素之一。

　　盐胁迫对植物个体形态的抑制主要体现在生长发育过程当中的组织和器官。当盐浓度达到一定程度时，高粱的生长发育受到明显的伤害，影响幼苗正常生长，表现为植株矮小，生物量减少，长势弱(石太渊，王颖，杨立国，等.高粱体细胞抗盐系的筛选[J].杂粮作物，2002,22(4):205-207.)。有研究表明，随着盐浓度的升高，番茄地上部分干鲜重显著降低，但根系的干鲜重变化并不明显；在50mM NaCl环境中，番茄主根长、侧根数、侧根长及根体积等生理指标受到的抑制明显高于对照组(姚静，施卫明.盐胁迫对番茄根形态和幼苗生长的影响[J].土壤，2008,40(2):279-282.)。许多研究发现用120mM和150NaCl浓度处理过的拟南芥，其长势呈下降趋势，拟南芥叶片颜色渐浅，叶面积变小，根的伸长受到抑制，叶片发黄甚至死亡(程欢.盐胁迫对拟南芥生长影响的生理生化及根的蛋白组学研究[D].湖北大学，2012.)。在盐胁迫条件下，植物的生长发育会受到影响，最初会造成叶面积扩展速度下降，随着盐浓度不断升高，叶面积停止增加，根茎叶干鲜重下降，最终导致植物死亡。

　　提高植物的耐盐性，使其在盐碱土上更好的生长有利于充分利用土地资源、改善环境以及促进农业的发展。因此，如何开发和利用大面积的盐渍化土地和植物的耐盐基因来提高作物产量是急需解决的重要问题。

　　发明内容

　　本发明的目的在于提供具有耐盐功能的基因及其在植物耐盐鉴定、育种以及改良中的应用。

　　为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

　　本发明提供了一种耐盐分子标志物，所述分子标志物为LOC8075699。

　　本发明提供了分子标志物LOC8075699在鉴定耐盐植物中的应用。

　　进一步，通过检测分子标志物LOC8075699的水平来鉴定耐盐植物。

　　进一步，LOC8075699在耐盐植物中表达下调。

　　本发明提供了一种鉴定具有耐盐性的植物的方法，以LOC8075699的水平为指标，通过检测LOC8075699的水平来鉴定植物的耐盐性。

　　进一步，使用核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术来检测LOC8075699的水平。

　　进一步，使用包含特异性扩增LOC8075699的引物、特异性识别LOC8075699的探针或特异性结合LOC8075699的抗体来检测LOC8075699的水平；优选的，LOC8075699在耐盐植物中表达下调。

　　本发明提供了高粱LOC8075699蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物耐盐性中的应用。

　　本发明提供了高粱LOC8075699蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在耐盐种质资源改良中的应用。

　　本发明提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括降低植物中LOC8075699的表达水平。

　　进一步，通过特异性针对LOC8075699的干扰分子降低植物中LOC8075699的表达水平。

　　本发明的优点和有益效果：

　　本发明首次发现了LOC8075699在耐盐高粱中低表达，通过检测LOC8075699的表达水平，可以鉴定耐盐性植物，根据LOC8075699与植物耐盐的相关性，可以改变LOC8075699的表达水平来培育耐盐植物或者改良植物的耐盐性。

　　附图说明

　　图1是分子标志物LOC8075699在敏盐株和耐盐株中的表达情况图；

　　图2是LOC8075699在盐胁迫中的表达情况图。

　　具体实施方式

　　本发明通过对敏盐高粱和耐盐高粱进行转录组测序，利用遗传学手段来寻找耐盐和敏盐基因表达谱的差异，并同时通过盐胁迫试验检测盐响应的基因，挖掘耐盐的功能基因，解析其复杂的分子机理奠定理论基础，同时为耐盐高粱的鉴定以及育种提供重要的手段。本发明首次发现了耐盐分子标志物LOC8075699，其中LOC8061775在耐盐植物中高表达，LOC8075699在耐盐植物中低表达。

　　“分子标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定的植物性状。

　　在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“分子标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

　　如本文中使用的，分子标志物的“量”或“水平”是样品中的可检测水平。这些可通过本领域技术人员已知的及本文中公开的方法来测量。

　　术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中分子标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA)。

　　“增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有耐盐的植株，内部对照(例如持家型分子标志物)，或来自一个群体的样品中生物标志物的中值表达水平，植株中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

　　“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有耐盐的植株或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个群体的样品中分子标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

　　本发明提供了一种鉴定具有耐盐性的植物的方法，以LOC8075699的水平为指标，通过检测LOC8075699的水平来鉴定植物的耐盐性。LOC8075699在耐盐植株中表达下调，是指与敏盐高粱中的LOC8075699表达的常规值相比，LOC8075699表达下调，LOC8075699作为一种已知基因，本领域技术人员可以方便的了解这种常规值，比较基因及其编码的蛋白的表达的方法也是人们熟知的，如核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

　　在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

　　作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

　　在发明中，术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

　　本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

　　在本发明中，“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。

　　本发明提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括降低植物中LOC8075699的表达水平。降低植物中LOC8075699的表达水平的物质可以是：核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调LOC8075699的表达水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

　　作为本发明的一种选择方式，降低LOC8075699表达水平的物质是一种特异性与LOC8075699结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与LOC8075699蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

　　作为本发明的一种优选方式，降低LOC8075699表达水平的物质是一种LOC8075699特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

　　作为本发明的一种可选方式，降低LOC8075699表达水平的物质也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

　　可以利用基因工程学方法将本发明的降低LOC8075699表达水平的物质导入植物宿主中，进而制作出具有耐盐胁迫的转化植物。作为将本发明的基因导入植物宿主中的方法，可以列举：土壤杆菌感染法等间接导入法；或电穿孔法、基因枪法、聚乙二醇法、脂质体法、微量注射法等直接导入法等。本领域技术人员可以适当选择适当的导入方法。例如，在采用土壤杆菌感染法时，如下操作，可以制作出导入了本发明的DNA或抑制剂的转化植物。

　　下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

　　实施例1耐盐基因的筛选

　　1、实验材料

　　苗期极耐盐品种圪红(GH，00000601，河北)和极敏盐品种褐高粱(HGL，00013200，贵州)。

　　2、实验方法

　　2.1材料的处理

　　选用苗期耐盐品种(00000601)及盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用，每组设三个重复。

　　2.2转录组测序

　　叶片总RNA的提取纯化与质量评估、cDNA文库的构建、转录组测序工作交由北京百迈客生物科技有限公司完成。转录组测序平台使用Oxford Nanopore Technologies的PromethION测序平台。

　　2.2.1 RNA的提取与质量评估

　　液氮研磨幼苗叶片，使用天根生化的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒按说明书提取总RNA，用Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对样品纯度、浓度、RNA完整性等指标进行检测。

　　2.2.2文库的构建与转录组测序

　　整个文库构建与测序工作根据牛津纳米孔技术公司(ONT)提供的方案，用1ug的总RNA经过SQK-PCS109系统进行cDNA文库制备。简而言之，使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen)进行全长mRNA逆转录，然后对cDNA进行PCR扩增反应14个循环，DNA聚合酶使用LongAmp热启动Taq DNA聚合酶(NEB)。对PCR产物进行FFPE DNA损伤修复和末端修复(NEB)，使用T4 DNA连接酶(NEB)进行测序接头连接。随即用Agencourt XP对DNA进行磁珠纯化。将最终的cDNA文库添加到FLO-MIN109流通池中，在百迈客生物科技有限公司(北京)的PromethION平台上测序。

　　2.2.3测序数据与质量控制

　　从原始下机序列中过滤序列中的低质量(长度小于500bp，Qscore小于7)序列和核糖体RNA序列，并根据识别序列两端是否存在引物得到全长序列。

　　全长序列用minimap2软件与参考基因组进行比对，通过比对信息进行聚类后，得到一致性序列。

　　合并每个样品的一致性序列，通过minimap2与参考基因组(Sorghum_bicolor_NCBIv3，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝sorghum)进行比对，对比对到参考基因组的读长序列进一步使用cDNA_Cupcake程序包(https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake)进一步去冗余，过滤identity小于0.9，coverage小于0.85的序列，合并仅5’端外显子有差异的比对。

　　2.2.4数据分析

　　1)新基因、SSR及转录因子的预测

　　使用TransDecoder软件(http://transdecoder.github.io/)预测转录本中编码区序列(Coding Sequence，CDS)，使用MISA软件鉴定转录组的简单重复序列(SimpleSequence Repeats，SSR)，用iTAK软件预测转录因子。

　　2)LncRNA预测

　　因长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)不编码蛋白，因此，通过对转录本进行编码潜能筛选，判断其是否具有编码潜能，从而可以判定该转录本是否为lncRNA。分别应用CPC分析、CNCI分析、CPAT、pfam蛋白结构域分析四种方法对新发现的转录本进行lncRNA的预测。CPC(Coding Potential Calculator)是基于序列比对的蛋白质编码潜能计算工具。CNCI(Coding-Non-Coding Index)分析是一种通过相邻核苷酸三联体特征区分编码-非编码转录本的方法。CPAT(Coding Potential Assessment Tool)分析是一种通过构建逻辑回归模型，基于ORF长度、ORF覆盖度，计算Fickett得分和Hexamer得分来判断转录本编码和非编码能力的分析方法。Pfam数据库是最全面的蛋白结域注释的分类系统构。

　　3)基因功能的注释分类

　　主要利用NR(NCBI non-redundant protein sequences)数据库，该数据库是NCBI中的非冗余蛋白质数据库；Pfam(Protein family)数据库是最全面的蛋白结构域注释的分类系统；COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)数据库是对基因产物进行同源分类的数据库；KOG(euKaryotic Ortholog Groups)数据库是针对真核生物，基于基因直系同源关系，结合进化关系将来自不同物种的同源基因分为不同的Ortholog簇；Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)数据库是由EBI(欧洲生物信息学研究所)负责维护的数据库，包含了有相关参考文献且经过校对的蛋白质注释信息数据库，可信度很高；KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库；GO(GeneOntology)数据库是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的功能属性。

　　4)转录表达水平的定量与差异表达分析

　　转录组测序可以模拟成一个随机抽样的过程，为了让片段数目能真实地反映转录本表达水平，需要对样品中的Mapped Reads的数目进行归一化。采用CPM(counts permillion)作为衡量转录本或基因表达水平的指标，CPM计算公式如下(“reads mapped totranscript”表示比对到某一转录本上的reads数目；“total reads aligned in sample”表示比对到参考转录组的片段总数)：

　　使用DESeq R软件包(1.18.0)和EBSeq软件对盐胁迫下不同处理时间、不同品种幼苗叶片进行差异表达分析。在此过程中，Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。符合筛选条件的基因为差异表达基因。差异倍数(Fold Change)表示两样品(组)间表达量的比值。FDR(False Discovery Rate)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到的。由于转录组测序的差异表达分析是对大量的转录本表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用FDR作为差异表达转录本筛选的关键指标。

　　5)差异表达基因的功能富集分析

　　差异表达基因的功能富集分析主要包括GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析是通过GOseq R程序包完成，KEGG通路富集分析由KOBAS软件进行分析。

　　6)数据的统计与图形绘制

　　差异表达基因的韦恩图统计、GO注释分类、KEGG富集分析图形绘制使用百迈客云分析平台完成，GO富集分析图使用ggplot2 R程序包完成，样本表达量相关性分析聚类热图、盐胁迫响应基因差异表达热图绘制使用pheatmap R程序包完成，差异表达基因统计、转录因子统计柱形图使用origin 8.5完成，使用EXCEL 2016进行数据统计，其他图形绘制由百迈客生物科技公司提供完成。

　　2.3 qRT-PCR验证

　　使用金百特生物的RT Kit With gDNA Eraser试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA,反转录体系以及步骤如下：

　　依次加入，在加入5×RT MasterMix之前，轻轻混匀，42℃孵育2min，全部加入后，轻轻混匀，42℃孵育20min,85℃加热5s。置冰上，合成的cDNA用于qRT-PCR，使用前加180μLddH2O稀释至终浓度约为5ng/μL。

　　随机选取6个差异表达基因，使用ABI 7300Real-Time PCR System(USA)进行qRT-PCR，验证转录组测序数据的准确性，使用金百特生物2×Sybr Green qPCR Mix(High ROX)试剂，反应液配制在冰上进行，PCR反应液体系如下：

　　qRT-PCR反应程序设置如下：

　　反应条件循环数

　　94℃ 3min 1

　　94℃ 10s，60℃ 34s 40

　　Dissociation Stage

　　qRT-PCR引物设计使用NCBI Primer Blast工具完成，具体引物信息见表1，引物序列由北京擎科生物公司合成。使用Sorbi.3007G140700(GAPDH)基因作为内参基因，使用2-ΔΔCt相对定量方法以耐盐品种和敏盐品种非处理样本为对照进行表达定量，每个样本三个重复。

　　表1 qRT-PCR选用基因及引物序列

　　2.4结果与分析

　　2.4.1 RNA质量检测

　　转录组测序对于RNA的质量要求很高，良好的RNA质量是获得可靠测序数据的前提，经Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对总样品进行检测，结果显示8.2<RIN<8.6，2.11<OD260/OD280<2.16，28S/18S在1.3到1.6之间，说明总RNA质量较高，完整性较好，能够满足构建cDNA文库需求。

　　2.4.2测序数据质量

　　对总样品进行全长转录组测序，每个样品测序产出clean data均达到6.38GB,过滤短片度和低质量的reads后的信息见表2得到的clean read数从6319936到10297642不等，N50在1134-1282之间，平均质量值在Q9以上，总的clean data去除核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)并通过reads两端的引物序列鉴定全长(full length)序列详见表3，每个样品得到的全长,率均在80％以上。将clean reads与参考基因组进行比对，比对统计结果见表3，比对上的序列为99.47％以上。

　　表2总样品的clean data数据统计

　　表3总样品全长序列数据统计表

　　2.4.3两个品种的基因表达情况分析

　　对耐盐品种圪红(GH)和敏盐品种(HGL)全部样本进行全长转录组测序分析，与敏盐品种相比，呈现显著性差异的有604个基因，其中，显著上调的有212个，显著下调的有392个。

　　相比敏盐高粱，LOC8075699在耐盐高粱中显著下调(图1)，说明LOC8075699作为可能的耐盐基因在植物的耐盐中起着重要的作用。

　　2.4.5 qRT-PCR验证分析

　　随机挑选6个差异表达基因进行定时荧光定量PCR以验证转录组数据的准确性，结果显示，6个差异表达基因与转录组测序结果中的表达量变化倍数趋势基本一致，说明转录组测序数据准确可靠。

　　实施例2耐盐基因对盐胁迫的响应

　　1、材料处理

　　选用盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，开始用含有150mmol·L-1NaCl溶液胁迫处理幼苗，分别设胁迫处理时间梯度为0h(CK)、6h、24h、48h，每个处理三个重复。为保持盐胁迫浓度，处理NaCl溶液每24h更新一次。胁迫处理结束，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用。

　　2、转录组测序及数据分析方法同实施例1。

　　3、结果

　　结果显示，LOC8075699基因的水平逐渐降低(0h>6h>24h>48h)，接近LOC8075699在耐盐株中的表达水平(图2)；同耐盐株与敏盐株的基因表达趋势一致，说明LOC8075699是耐盐关键基因，可应用于耐盐植物的筛选、鉴定和育种。

　　上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

　　序列表

　　<110> 中国农业科学院作物科学研究所

　　<120> 具有耐盐功能的基因及其应用

　　<160> 14

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 20

　　<212> DNA