通过下调UXE基因提高植物糖化效率的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物质能源领域，具体涉及利用生物技术下调植物体内尿苷二磷酸木糖差向异构酶(UDP-Xylose Epimerase，UXE)的活性，UXE下调后的植物具有更高的糖化效率，本发明涉及UXE下调植物在各种应用如生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用；特别涉及一种通过下调UXE基因提高植物糖化效率的方法及其应用。
背景技术
生物质能源的特点，结合了化石能源和新能源的优势，是储量极大、可再生的能源之一。由于其来自于植物或农林产业废弃物，同样具有环境友好的特性。当今世界的主要使用的仍为传统能源，储存有限、不可再生和环境危害严重，亟待提高和推广生物能源。如何高效合理地开发生物质能对经济和社会的可持续发展有着重要意义，也已成为大势所趋的热点。
木质纤维素作为重要的生物质能源，是生产生物乙醇的主要原料。木质纤维素中的纤维素和半纤维素经水解糖化成简单糖类，最后被发酵成乙醇，糖化效率是影响生物质产量的重要因素，木质纤维素的组成与交联方式直接影响糖化效率。禾本科植物的半纤维素主要是以木聚糖(Xylan)为主链，阿拉伯糖(Arabinose)、葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)为侧链的葡萄糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖(Glucuronoarabinoxylan，GAX)和阿拉伯糖基木聚糖(AX)。木聚糖在植物次生壁中通过阿拉伯糖侧链与纤维素、木质素的部分结构交联来提高植物的韧性、抗逆性等，但木聚糖侧链的存在也对木质纤维素的工业应用带来了很大的影响。木聚糖在纤维素周周形成的交联网络结构阻止纤维素分解酶进入，不仅如此，侧链分支的程度也影响了糖化效率。木聚糖侧链合成的底物尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose，UDP-Xyl)会被尿苷二磷酸木糖差向异构酶(UXE)催化生成尿苷二磷酸阿拉伯糖(UDP-arabinose，UDP-Ara)，对UXE的调节会直接影响木聚糖主链上阿拉伯糖侧链的分支程度，进而影响阿拉伯糖通过阿魏酸酯键与木质素的连接，并影响半纤维素和纤维素的交联，最终改变植物的糖化效率。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种通过CRISPR/Cas9下调UXE基因提高植物糖化效率的方法。
本发明通过改变植物木聚糖侧链含量和分支程度，从而使植物糖化效率提高。基于发明人的工作经验和当前生物质材料改良的需求，发明人认为下调阿拉伯糖合成的关键酶UXE可直接导致阿拉伯糖含量的降低，从而改变木质纤维素的组成与结构。通过对水稻基因组中所有UXE的分析可知，水稻基因组中共有3个UXE，通过TMHMM在线预测可知OsUXEs均具有跨膜区，定位于高尔基体。发明人利用CRISPR/CAS9基因编辑技术，对水稻中的三个UXE分别设计了多个靶点并对靶点所在的基因进行敲除。最终得到了三个基因两两突变的植株UXE1UXE2、UXE1UXE3，在测序鉴定可靠性之后，发明人的研究工作正是针对这两个突变体开展的。
在相同生长环境下，UXE1UXE2、UXE1UXE3突变体均表现出和用作对照的正常的水稻植株相同的生长表型，对两个突变体的农艺性状进行统计分析发现，UXE1UXE2和UXE1UXE3突变体株高、叶形、穗数和正常水稻无异。对两个突变体的茎秆切片皆表现出没有变化的细胞壁。对两个突变体细胞壁中的阿拉伯糖进行单糖分析发现，突变体中的阿拉伯糖含量显著减少，而葡萄糖和木糖没有明显变化。不仅如此，突变体木质素单体的比例也发生明显改变，S型木质素增多，更容易被裂解，这也是影响糖化效率的显著原因之一。对突变体材料进行糖化效率分析，二者皆表现出比野生型材料更高的糖化效率。以上实验结果表明，高尔基体定位的UXE突变不会给植物生长发育带来较大的影响，但能使植物木聚糖侧链-阿拉伯糖含量降低从而导致糖化效率提高。
本发明的另一目的在于提供上述方法获得的UXE下调植物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种通过下调UXE基因提高植物糖化效率的方法，通过使植物的UXE基因功能缺失或下调，来提高植物的糖化效率。
所述的UXE基因功能下调优选为通过基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调植物体内的UXE活性，达到提高糖化效率的目的。
所述的植物优选为水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(Populus)、桉树(Eucalyptus)、松树(Pinus)或麻疯树(Jatropha carcas L.)等；更优选为水稻。但同时可以衍生到其它植物，通过基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调该植物体内的UXE活性，达到提高糖化效率的目的。
对水稻中的3个UXE蛋白进行生物信息学分析。通过序列同源性比对分析发现，OsUXE1、OsUXE2、OsUXE3氨基酸序列相似度为：81.24％。用TMHMM软件对3个UXE蛋白进行跨膜区分析发现，OsUXEs均具有跨膜区，定位于高尔基体。
优选的，所述的UXE基因为OsUXE1、OsUXE2、OsUXE3中的至少一种；进一步为OsUXE1、OsUXE2、OsUXE3中的至少二种。
对突变体UXE1UXE2和UXE1UXE3进行表型分析。所有突变体生长均正常，只UXE1UXE3突变体的穗粒数性状表现出弱势，对两个突变体的基部茎段进行切片分析发现，所有突变体木质部导管正常。
对突变体UXE1UXE2和UXE1UXE3的细胞壁成分进行分析。收集突变体的茎段材料，对突变体材料进行了单糖组成分析(
对突变体UXE1UXE2和UXE1UXE3的木聚糖结构进行分析。用0.5M KOH法提取突变体材料的半纤维素(Zhao X,Ouyang K,Gan S,Zeng W,Song L,Zhao S,Li J,Doblin MS,Bacic A,Chen XY,Marchant A,Deng X,Wu AM(2014)Biochemical and molecularchanges associated with heteroxylan biosynthesis in Neolamarckia cadamba(Rubiaceae)during xylogenesis.Front Plant Sci 5:602)。采用2D-HSQC和1H-NMR以及FT-IR进行半纤维素的结构分析。结果表明在OsUXEs突变体中，葡萄糖醛酸(GlcA)的甲基化程度有不明显的降低，而乙酰化程度降低。上述结果表明，两个突变体阿拉伯糖下降十分明显，木聚糖侧链的甲基化程度和乙酰化程度降低，半纤维素的结构发生了较大变化。
对突变体UXE1UXE2和UXE1UXE3的糖化效率进行分析。阿拉伯糖通过阿魏酸交联于木质素，阻碍纤维素分解酶的进入影响糖化效率，得到的突变体木聚糖侧链的结构发生了很大变化，因此突变体糖化效率也会发生较大变化。在对突变体进行纤维素混合酶酶解后，测定得到的单糖含量以计算糖化效率，两个突变体的糖化效率皆有很大提高。
另外，在拟南芥，杨树，桉树，松树，麻疯树等植物中也存在着高尔基体定位的UXE，它们的多突变体也有可预期的糖化效率提高的结果。
一种UXE下调植物，通过上述制备方法制得得到。
所述的UXE下调植物在生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
生物质能源的利用效率很大程度上取决于原材料的好坏，提高原材料的可利用成分，降低原材料的处理成本皆可以提高生物质能源的利用效率，本发明的落脚点就在于这两个方面，得到的突变体材料阿拉伯糖含量降低，相应地增加了S型木质素和G型木质素的比例，即减少了半纤维素分支度，减弱了其与木质素和纤维素交联的紧密，进一步导致突变体材料的糖化效率提高，降低了材料处理成本。现有方法大部分集中在改变材料的预处理方法上，对糖化效率的提高程度有限，本发明从根本上改变了材料的生物质特性，使糖化效率有了根本上的提高，可以节约能源，降低劳动强度。
附图说明
图1是水稻中3个OsUXE(OsUXE1、OsUXE2和OsUXE3)蛋白的氨基酸序列比对图。
图2是水稻中OsUXE1、OsUXE2蛋白跨膜区的预测图。
图3是水稻中OsUXE3蛋白跨膜区的预测图。
图4是pYLCRISPR/Cas9-MH的图谱示意图。
图5是水稻突变体的检测结果图；其中，(a)：序列突变位点示意图；左为Wildtype(WT)，中间为UXE1UXE2或UXE1UXE3突变体1，右为UXE1UXE2或UXE1UXE3突变体2。(b)：染色体突变所在位置；Wildtype是指水稻中花11号。
图6是水稻突变体以及水稻茎段切片图；其中，WT、wildtype是指水稻中花11号，uxe1uxe2是指UXE1UXE2突变体1，uxe1uxe3是指UXE1UXE3突变体1。
图7是实时荧光定量PCR的鉴定结果图。
图8是细胞壁单糖成分分析图，其中，uxe1uxe2是指UXE1UXE2突变体1，uxe1uxe3是指UXE1UXE3突变体1。
图9是糖化效率分析图，其中，uxe1uxe2是指UXE1UXE2突变体1，uxe1uxe3是指UXE1UXE3突变体1。
图10是木聚糖侧链甲基化和乙酰化分析的核磁图；其中，(a)：突变体半纤维素2D-HSQC；(b)：突变体半纤维素H-NMR；(c)：半纤维素侧链修饰局部放大；WT是指水稻中花11号；uxe1uxe2是指UXE1UXE2突变体1，uxe1uxe3是指UXE1UXE3突变体1。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
对水稻中的3个UXE蛋白进行生物信息学分析。用DNAMAN软件对OsUXE的氨基酸序列进行同源性分析，发现OsUXE1(LOC_Os07g04690.1)、OsUXE2(LOC_Os04g52730.1)和OsUXE3(LOC_Os08g03570.1)氨基酸序列相似度为：81.24％，(图1)。进而，对3个OsUXE蛋白进行跨膜区预测(TMHMM，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，OsUXE1、OsUXE2和OsUXE3均具有跨膜区，定位于高尔基体(图2～3)。
实施例2
OsUXE突变体的获得。合成相应的靶点引物，如表1所示。
表1CRISPR/CAS9靶点引物
注：表里序列中的小写字母代表接头的粘性末端，大写字母是基因组的靶序列。
用于基因敲除的靶基因序列从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)数据库中获得。在基因编辑之前，根据UXEs(UXE1，LOC_Os07g04690.1；UXE2，LOC_Os04g52730.1；UXE3，LOC_Os08g03570.1)的序列在http://skl.scau.edu.cn/工具网站上设计并选择最佳靶点和引物(表1)。
首先，构建single guide RNA(gRNA)与敲除靶点序列的表达盒连接pUC18载体，基于pUC18骨架(氨苄青霉素抗性)，每个基因的表达盒单独构建。水稻来源的4个smallnuclear RNA启动子(OsU3，OsU6a～c)，其中，OsU3用于构建敲除OsUXE1的靶点序列的表达盒，OsU6a用于构建敲除OsUXE2或OsUXE3的靶点序列的表达盒。
pUC18骨架利用BsaⅠ酶切位点，产生粘性末端，以此使得启动子、靶点序列、gRNA相互顺序连接，形成表达盒。
此载体质粒在E.coli DH10B繁殖。连接反应体系为：
配制10μL BsaI-连接反应液：加入ATP至终浓度1.0mM，加入约10ng pUC18-U3-gRNA或pUC18-U6a-gRNA质粒(预先配好10ng/μL保存)，1.0μL靶点序列(最终浓度0.1μM)，～5U BsaI，～35U T4 DNA ligase。用变温循环仪(或PCR仪)循环反应5循环：37℃5min，20℃5min。
其中，pUC18-U3-gRNA是将U3-gRNA表达盒用BsaI酶切插入至pUC18中得到的；pUC18-U6a-gRNA是将U6a-gRNA表达盒用BsaI酶切插入至pUC18中得到的。
接着，通过Bsa Ⅰ酶切位点将表达盒从载体上切下，拥有不同敲除靶点序列的表达盒在此过程一一连接，形成串联的表达盒。此过程通过具有特异引物的PCR实现，uxe1uxe2和uxe1uxe3突变体的突变均通过两种特异引物(单独表达盒所在的载体骨架相同)实现表达盒之间的连接：
1F：5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
1R：5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′；
2F：5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
2R：5′-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′；
此连接反应体系为：
2μL连接产物为模板，15μL PCR，使用1F/R、2F/R各0.2μM，高保真PCR酶KOD-Plus。18～25循环，95℃10s，60℃15s，68℃30s。
最终载体使用为潮霉素抗性的pYLCRISPR/Cas9-MH(M＝monocot；H＝HPT，抗潮霉素基因)，图谱如图4所示。
仍通过BsaⅠ酶切位点，使得最终载体形成粘性末端，此与上一步中的表达盒串的互补粘性末端连接配对。
此连接反应体系为：
分装的pYLCRISPR/Cas9-MH(约40～60ng)管中，加入10～15ng的上步酶切PCR产物，在10μL连接反应(加35～70U连接酶)，16℃连接2～3h。
获得转化载体质粒后，送武汉伯远公司做中花11粳稻遗传转化，获得突变体植株。
利用鉴定引物(表2)鉴定获得的突变体的可靠性。
表2鉴定引物
鉴定结果可知，所有突变体都达到了完全突变OsUXE(图5)。
实施例3
水稻茎段切片制作与观察。选取生长成熟植株主茎，在土壤表层以上3cm取1cm茎段，用3％(w/v)的琼脂糖包埋茎段，在Leica VT1000S震动切片机上切片，厚度40μm，甲苯氨蓝染色1～2min，置于载玻片上于光学显微镜下观察拍照。uxe1uxe2、uxe1uxe3突变体的木质部导管形态正常(图6)。
实施例4
实时荧光定量PCR。分别提取成熟水稻根(Root)、主茎的上中下段(Upper Stem、Middle Stem、lower Stem)、叶鞘(Leaf Sheath)、叶(Leave)、穗(Spike)中的总RNA。Q-PCR引物的设计利用oligo7与primer6软件协同设计，至少跨过一个内含子防止基因组DNA污染。
设计多个内参引物进行对比，选出误差较小的内参引物做数据分析。反应体系中的cDNA根据需要稀释10倍，SYBR PremixEXTaqTM购自TAKARA公司。实验所需仪器为罗氏LightCyler480。OsUXEs基因表达量见图7。由于核苷酸糖的转运合成是植物基础的生化过程，因此在目标组织中都发现了不同表达程度的UXE。OsUXE1在成熟水稻中的总表达量显著高于OsUXE2和OsUXE3，而OsUXE3在成熟水稻中表达量最低(图7)。UXE基因在不同的组织内有特异性不同的表达模式。OsUXE1虽然在成熟水稻中各个组织的表达量都远远高于其他基因，但是特别是在茎秆尤其是中部的表达量更出色，说明在成熟水稻中起关键作用的UXE基因是UXE1。OsUXE2除了在上部茎秆有高表达外，叶鞘和叶中也突出表达。OsUXE3更多的是在上部茎秆、叶鞘和根中表达，特别是上部茎秆中的OsUXE3，穗和叶的表达量很低。总的来说UXE基因在茎秆和叶鞘中有更多表达。
表3实时荧光定量PCR引物
实施例5
细胞壁单糖成分分析。收集茎段材料进行粉碎，多步酸解法得到的清液在高效阴离子交换色谱仪Dionex ICS 3000上进行单糖测定，色谱柱为CarboPac PA20阴离子交换柱(3×150mm；Dionex)。分析结果如表4及图8所示，uxe1uxe2突变体的阿拉伯糖含量降低了47.11％，uxe1uxe3突变体的阿拉伯糖含量下降了38.17％。
表4细胞壁单糖成分分析
实施例6
木聚糖侧链甲基化和乙酰化分析，结果如图10所示。对提取到的木聚糖用endo-β-xylanase M6(Megazyme)酶解，酶解产物冻干后用20mg混合0.5mL D2O制样，使用600Hz NMR(Bruker)获得核磁数据。根据2D-HSQC结果，阿拉伯糖的5个1H/13C信号峰所在位置分别对应在109.14/5.15ppm、86.04/4.01ppm、80.27/3.92ppm、78.91/3.66ppm、61.15/3.58ppm，而很明显的五个信号强度的峰(101.77/4.30ppm、75.60/3.63ppm、74.09/3.36ppm、72.81/3.15ppm、63.43/3.95ppm)代表着木糖的大量存在。结果表明，在木糖的信号强度类似的情况下，突变体阿拉伯糖的信号强度有明显减少。除此之外，在4.56-4.62ppm、4.69ppm和5.11-5.17ppm表现出来木糖被乙酰基修饰的信号，分别是3-O-acetylated Xyl(H1)、2-O-acetylated Xyl(H1、H2)和3-O-acetylated Xyl(H3)，wt中的2-O-acetylated Xyl(H1、H2)的峰(4.69ppm)比突变体更明显，并且3-O-acetylated Xyl(H1)的信号(4.56-4.62ppm)也比突变体更明显。以上说明突变体半纤维素的乙酰化和甲基化程度发生了改变。
实施例7
糖化分析。收集茎段材料，在破壁机中粉碎，在0.1M H-Ac buffer中加入4mg纤维素复合酶(β-glucanase(β-葡聚糖酶)3.7×104U，cellulase(纤维素酶)3.4×102U，xylanase(木聚糖酶)6.5×104U；Imperial Jade Bio-technology Co.,Ltd)，50℃处理48h，上清过0.22μm滤膜后用HPLC(Agilent，Shodex sugar SP-0810column，refractiveindex detector)测定。测定结果见图9，uxe1uxe2突变体的糖化效率为63.45％，较WT(48.26％)，提高了15.19％；uxe1uxe3突变体的糖化效率为61.81％，较WT，提高了13.55％；可见，两个突变体的糖化效率皆得到了较大提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 通过下调UXE基因提高植物糖化效率的方法及其应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OsUXE1氨基酸序列：OsUXE1___LOC_Os07g04690.1
<400> 1
Met Leu Pro Thr Asn Arg Asn Arg Pro Gln Gln Arg Pro Ala Arg Ser
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Val Val Met Leu Thr Gln Pro Pro Cys His Arg Arg Thr Pro Ser Val
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Phe Ser Ile His Glu Pro Gly Val Thr His Val Leu Val Thr Gly Gly
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100 105 110
Ile Lys Val Leu Gln Asn Leu Phe Ser Glu Pro Gly Arg Leu Gln Phe
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Asn Thr Leu Val Val Leu Glu Ala Met Ala Ala His Asn Val Arg Thr
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Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Cys Ala Thr Tyr Gly Glu Pro Glu Lys Met
195 200 205
Pro Ile Thr Glu Gly Thr Pro Gln Phe Pro Ile Asn Pro Tyr Gly Lys
210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<210> 2
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 2
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<210> 3
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OsUXE3氨基酸序列：OsUXE3___LOC_Os08g03570.1
<400> 3
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325 330 335
Glu Phe Val Asp Ala Cys Lys Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Lys Ile
340 345 350
Glu Tyr Leu Ser Arg Arg Pro Gly Asp Tyr Ala Glu Val Tyr Ser Asp
355 360 365
Pro Thr Lys Ile Asn Thr Glu Leu Asn Trp Thr Ala Gln Tyr Thr Asp
370 375 380
Leu Lys Glu Ser Leu Ser Val Ala Trp Arg Trp Gln Lys Ser His Pro
385 390 395 400
Arg Gly Tyr Gly Ser Asn
405
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcagatctg gcaggcctct gctg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccagcag aggcctgcca gatc 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcagggcga gtcagactag ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacccccta gtctgactcg ccc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcagacgca agcctaatgt cgtc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacgacgac attaggcttg cgtc 24
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcacaggca aaggtaggtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgctgtacac ttcggcatag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcactggaa gaggtcgttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagcatagtc ccctggcc 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcacaggac atggtagatc 20
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 19
cagcatagtc tcctggtctc c 21
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggccaatcg tgagaagatg accca 25
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgtggctga caccatcacc agag 24
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<211> 20
<212> DNA
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atgataactc gacggatcgc 20
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cttggatgtg gtagccgttt 20
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<212> DNA
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gggctgctag cttcaacatc 20
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<211> 20
<212> DNA
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ttgattgcag ccttgatctg 20
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<400> 26
taccgtgccc ttactgttcc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 27
cggtggaatg tcacagacac 20
