脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞生物制品技术领域，特别是涉及一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法。
背景技术
脂肪来源的间充质干细胞是从脂肪组织分离提纯得到的一类具有多分化潜能的干细胞，能够在一定的诱导因子作用下，分化成软骨、成骨、脂肪、神经组织及其他组织或器官。脂肪来源间充质干细胞作为应用细胞，其优点在于：1原材料来源简单，易获取；2具有间充质干细胞的特性；3对于膝关节及医美等领域的用途广泛，因此，临床上急需能够有安全质量的细胞为临床研究提供相应的技术支持。
现有的技术方法和工艺会用到动物来源成分(动物血清)和非临床级试剂(D-Hanks液等)进行细胞分离和培养，这类工艺条件不符合临床级要求，违背异源动物成分相关的伦理现实问题，对临床试验带来了不可确定的影响。
另有一些技术方法中采用的技术方法存在着脂肪组织采集部位不合理、脂肪采集保存运输环节有问题、脂肪不做清洗就消化、脂肪组织消化过度或不足、脂肪消化后只离心不过滤、脂肪消法得到的SVF成分纯度不高、培养后的脂肪来源间充质干细胞流式结果不理想等情况。如何提高脂肪来源间充质干细胞的量并提高细胞活性和细胞纯度，以保证脂肪来源间充质干细胞临床治疗时的应用安全和效果，是迫切需要解决的问题。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，通过工艺和技术方法的改进，解决脂肪来源间充质干细胞临床级生产制备的问题，满足脂肪来源间充质干细胞在临床研究的需求，提供一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法。
本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，包括以下步骤：
S1.在无菌条件下，采集脂肪组织，转移至含保存液的无菌瓶内保存并冷链运输；
S2.除去血液肿胀液和破碎的脂肪组织，将脂肪组织转移至T75培养瓶中，加入洗涤液洗涤脂肪组织多次至液体清澈；
S3.向培养瓶中加入预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，使脂肪充分消化，使用无菌筛网过滤除去未消化的脂肪组织，获得脂肪SVF细胞滤液；
S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理，得到的沉淀为脂肪SVF；
S5.弃去上清液，再加入适量洗涤液，细胞混匀，离心，再用培养液重悬离心，得到净化脂肪SVF沉淀；
S6.将净化脂肪SVF沉淀用脂肪来源间充质干细胞完全培养基重悬，按照10ml/T75瓶移入培养瓶，适量加入脂肪来源间充质干细胞完全培养基，饱和湿度培养箱将培养瓶放置于培养箱继续传代培养；
S7.脂肪间充质干细胞原代培养，原代培养第24小时后全量换液，去除未贴壁细胞，第5天后再全量换液，第7天得到原代脂肪间充质干细胞原代细胞；
S8.消化收获原代细胞，吸弃培养液，生理盐水洗涤，注意轻轻摇晃，在每个T75培养瓶中加入2-3ml胰酶-EDTA，常温消化，加入培养基5ml终止消化，轻轻摇晃后转移至离心管中，5ml生理盐水冲洗后转移至离心管中，定容后常温离心，加入培养基后重悬取样计数；
S9.将S8得到的细胞悬液再离心后弃去上清液，加入适量培养液重悬，轻轻摇晃，定容，按4.5×105cell/T75培养瓶，将培养瓶放置于培养箱继续传代培养；
S10.待S9中细胞融合达到80％以上时，再重复S8和S9，消化洗涤得到细胞沉淀；
S11.将S10中细胞沉淀适量重悬后，取样检测细胞量和细胞活力、细胞表型检测，离心后取上清做无菌、内毒素检测；
S12.将S11中重悬后得到的细胞沉淀加入完全培养液，重悬细胞，细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％完全培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至待检库内，待检测结果合格后转移至细胞库内长期保存。
进一步优选地，所述S1中，采集脂肪组织50ml。
进一步优选地，所述S3中，向培养瓶中加入等体积浓度为0.1％-0.2％并在37℃预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，在37℃、100rpm的条件下50-60min，使脂肪充分消化。
进一步优选地，所述S4中，将脂肪SVF细胞滤液常温下300g离心处理10min。
进一步优选地，所述S5中，细胞沉淀离心洗涤多次，得到净化脂肪SVF细胞沉淀；
所述S6中，将培养瓶放置于37℃、5％CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
进一步优选地，所述S8中，在每个T75培养瓶中加入2-3ml浓度为0.05％的胰酶-EDTA，常温消化1.5-2.5min；
定容后常温300g离心10min，加入培养基后重悬取样计数，重新300g离心10min；
所述S9中，将培养瓶放置于37℃、5％CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
进一步优选地，所述保存液为60ml无血清间充质干细胞培养基，低温4℃保存。
进一步优选地，所述洗涤液为0.9％生理盐水和160IU/ml硫酸庆大霉素的混合物。
进一步优选地，所述I型胶原酶消化液的配置方法为：1ug/ml的I型胶原酶加50ml无血清间充质干细胞培养基，充分混匀，得到脂肪组织消化液，无菌过滤后使用。
进一步优选地，所述脂肪来源间充质干细胞完全培养基包括2％血清替代物、1％L-谷氨酰胺和500ml无血清间充质干细胞培养基；
所述完全培养基冻存液包括10％临床级DMSO和90％脂肪来源间充质干细胞完全培养基。
相对于现有技术，本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法采用临床级方式方法，所采用的试剂耗材和操作方式方法使得到的脂肪来源间充质干细胞能够满足临床研究的要求；其提纯分离、培养扩增过程可以显著提高脂肪来源间充质干细胞的细胞量、纯度以及细胞活性，能够在同样的总临床研究成本下，有效降低细胞制备的单一成本。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是CD105的检测分析图。
图2是CD90的检测分析图。
图3是CD73的检测分析图。
图4是CD44的检测分析图。
图5是CD166的检测分析图。
图6是CD19的检测分析图。
图7是CD34的检测分析图。
图8是CD45的检测分析图。
图9是CD31的检测分析图。
具体实施方式
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
在实施本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法前，需要做样本筛选和实验室准备工作，具体工作内容如下：
一、样本筛选。
脂肪来源间充质干细胞试验者供体的病史采集级检测：包括供体的基本信息、既往病史、家族史等。
检验筛查供体无传染病(传染病包括HIV、HBV、HCV、梅毒、EB等)，必要时需要检查供体血常规、肝功肾功、凝血四项、血型等。
二、实验室准备。
保存液的配制：60ml无血清间充质干细胞培养基，低温4℃保存。
洗涤液的配制：0.9％生理盐水+160IU/ml硫酸庆大霉素。
消化液的配制：1ug/ml的I型胶原酶加50ml无血清间充质干细胞培养基，充分混匀，得到脂肪组织消化液，无菌过滤后使用。
脂肪来源间充质干细胞完全培养基的配制：2％血清替代物+1％L-谷氨酰胺+500ml无血清间充质干细胞培养基。
完全培养基冻存液的配制：10％临床级DMSO+90％脂肪来源间充质干细胞完全培养基比例混合。
上述保存液、洗涤液、消化液、脂肪来源间充质干细胞完全培养基和完全培养基冻存液用在本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法的相应步骤中。
下面具体介绍本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其包括以下步骤：
S1.在无菌条件下，采集脂肪组织，转移至含保存液的无菌瓶内保存并冷链运输。
优选地，采集脂肪组织50ml。
S2.除去血液肿胀液和破碎的脂肪组织，将脂肪组织转移至T75培养瓶中，加入洗涤液洗涤脂肪组织多次至液体清澈。
S3.向培养瓶中加入预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，使脂肪充分消化，使用无菌筛网过滤除去未消化的脂肪组织，获得脂肪SVF细胞滤液。
在一种实施方式中，向培养瓶中加入等体积浓度为0.1％-0.2％并在37℃预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，在37℃、100rpm的条件下50-60min，使脂肪充分消化。
S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理，得到的沉淀为脂肪SVF。
优选地，将脂肪SVF细胞滤液常温下300g离心处理10min。
S5.弃去上清液，再加入适量洗涤液，细胞混匀，离心，再用培养液重悬离心，得到净化脂肪SVF沉淀。
优选地，细胞沉淀离心洗涤多次，得到净化脂肪SVF细胞沉淀。
S6.将净化脂肪SVF沉淀用脂肪来源间充质干细胞完全培养基重悬，按照10ml/T75瓶移入培养瓶，适量加入脂肪来源间充质干细胞完全培养基，将培养瓶放置于培养箱继续传代培养。
优选地，将培养瓶放置于37℃、5％CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
S7.脂肪间充质干细胞原代培养，原代培养第24小时后全量换液，去除未贴壁细胞，第5天后再全量换液，第7天得到原代脂肪间充质干细胞原代细胞。
S8.消化收获原代细胞，吸弃培养液，生理盐水洗涤，注意轻轻摇晃，在每个T75培养瓶中加入2-3ml胰酶-EDTA，常温消化，加入培养基5ml终止消化，轻轻摇晃后转移至离心管中，5ml生理盐水冲洗后转移至离心管中，定容后常温离心，加入培养基后重悬取样计数。
优选地，在每个T75培养瓶中加入2-3ml浓度为0.05％的胰酶-EDTA，常温消化1.5-2.5min。
进一步优选地，定容后常温300g离心10min，加入培养基后重悬取样计数，重新300g离心10min。
S9.将S8得到的细胞悬液再离心后弃去上清液，加入适量培养液重悬，轻轻摇晃，定容，按4.5×105cell/T75培养瓶，将培养瓶放置于培养箱继续传代培养。
优选地，将培养瓶放置于37℃、5％CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
S10.待S9中细胞融合达到80％以上时，再重复S8和S9，消化洗涤得到细胞沉淀。
具体地，待S9中细胞融合80％以上时，按照上述S8和S9再次传代依次得到P2代次细胞，待P2代次脂肪来源间充质干细胞达到细胞80％-90％融合后，细胞按照S8消化收获细胞。
S11.将S10中细胞沉淀适量重悬后，取样检测细胞量和细胞活力、细胞表型检测，离心后取上清做无菌、内毒素检测。
S12.将S11中重悬后得到的细胞沉淀加入完全培养液，重悬细胞，细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％完全培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至待检库内，待检测结果合格后转移至细胞库内长期保存。
本实施例主要采用脂肪来源间充质干细胞流式检测方法：
检测内容包括：CD105、CD90、CD73、CD44、CD166、CD19、CD34、CD31、CD45。
合格标准：CD105、CD90、CD73、CD44、CD166，五项限值≥98％；
CD19、CD34、CD31、CD45，四项限值≤2％。
样本类型：S12获得的脂肪来源间充质干细胞终制剂细胞悬液。
检测方法：流式细胞检测法。
请参阅图1-图9。如图所示，各附图依次为本实施例采用的流式细胞检测法获得的流式细胞检测分析图。
由附图可知，本发明获得的脂肪来源间充质干细胞终制剂细胞悬液中CD105、CD90、CD73、CD44、CD166以及CD19、CD34、CD31、CD45均符合合格标准。
相对于现有技术，本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法采用临床级方式方法，所采用的试剂耗材和操作方式方法使得到的脂肪来源间充质干细胞能够满足临床研究的要求；其提纯分离、培养扩增过程可以显著提高脂肪来源间充质干细胞的细胞量、纯度以及细胞活性，能够在同样的总临床研究成本下，有效降低细胞制备的单一成本。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
