一种提高黄芪有效成分多糖和总黄酮的方法
技术领域
本发明涉及黄芪种植技术领域，具体涉及一种提高黄芪有效成分多糖和总黄酮的方法。
背景技术
黄芪（Astragalus mongholicus Bunge），豆科植物，常用中药之一，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根。主产于中国的内蒙古、山西、黑龙江等地。春秋两季采挖，晒干，切片，生用或蜜炙用。性甘，微温，归肺、脾、肝、肾经。具有利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。黄芪的主要成分是总黄酮和多糖，黄芪多糖为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。
吲哚乙酸作为植物生长激素，可以促进植物根部生长，促进不定根的形成，加快营养繁殖速度，提高坐果率。吲哚乙酸作为植物生长激素，具有多方面的生理效应，这与其浓度有关。低浓度时可以促进生长，高浓度时则会抑制生长，甚至使植物死亡。李俊凯等对大豆施用吲哚乙酸，其试验结果表明，施用合适浓度的吲哚乙酸，可促进根的生长和成分的积累，提高产量。张志红等证实施用合适浓度的吲哚乙酸对冬虫夏草中的多糖含量积累具有促进作用。
多效唑是一种植物生长调节剂，具有延缓植物生长，提高产量等效果。陈晓光等人对甘薯施用不同浓度多效唑，结果表明，多效唑能增大甘薯块根，提高甘薯产量。王存在多效唑在植物生产上的应用现状中也阐述了高浓度的多效唑能促进植物根部的生长。
目前，尚未有吲哚乙酸、多效唑对黄芪有效成分多糖和总黄酮的含量影响的相关报道研究。
发明内容
本发明人通过研究发现：施用吲哚乙酸和/多效唑可以提高黄芪有效成分多糖和总黄酮，具体的：黄芪多糖含量最高的是施用多效唑400mg/L，是空白对照的1.7倍，黄芪含量最低的是施用吲哚乙酸100mg/L，是空白对照的1.238倍。两种生长调节剂对黄芪根部多糖含量的积累都有促进作用。在同一种生长调节剂的对比中，施用吲哚乙酸的黄芪根部多糖含量在100mg/L至200mg/L之间呈上升趋势，在200mg/L至400mg/L之间呈下降趋势，在200mg/L时含量最多，是空白对照的1.535倍，效果最好；施用多效唑的黄芪根部多糖随着浓度的升高也随之升高，高浓度的多效唑可以促进多糖含量的积累。施用多效唑要比施用吲哚乙酸的效果要好。在施用多效唑生长调节剂的处理中，黄酮含量随着浓度的增加也随之增加，在400mg/L的时候达到最大值，效果最好；在喷洒吲哚乙酸生长调节剂的处理中，黄酮含量在100mg/L至200mg/L之间呈上升趋势，在200mg/L至400mg/L之间呈下降的趋势，在200mg/L时达到最大值，是空白对照的1.08倍，效果最好。
本发明为提高黄芪有效成分多糖和总黄酮的含量提供了一种新的方法，该方法可以实现促进于黄芪中多糖和总黄酮含量的积累，且对黄芪的产量具有促进作用。
附图说明
图1为葡萄糖标准曲线。
图2为芦丁标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实验例
1材料
两年生蒙古黄芪（2017年移栽在吉林农业科技学院左家校区试验田）。
试验方法
2.1黄芪的田间试验
本试验采用随机区组设计。挑选大小、长势相似，并且无虫害的黄芪种栽，称重。于2017年4月移栽在吉林农业科技学院左家校区试验田。量出90平方米的土地进行全面整地，将土地深翻除去杂草。本实验将吲哚乙酸和多效唑分别设置100、200、400mg/L三个浓度，每个浓度三次重复，对照喷施等量自来水。每个畦长2米，宽1米，行距20厘米，每畦50根。黄芪芽头向上，栽培完后盖土、浇水，并且及时处理田间杂草并做好病虫害防治。待黄芪展叶后开花前对黄芪叶面进行处理，每十天喷一次。
于2017年10月采收。每畦采用五点采样法进行采样，并进行相关指标测定。按区间处理组分好除去须根，洗净，80度烘干、粉碎，过60目筛备用。
黄芪光合速率的测定
光合速率：使用型号Lcpro+的光合速率仪测定。分三次测定，即喷药后三天进行测定。每次测定均采用五点采样法测五根黄芪，由下向上第六个分支的叶片进行测定。
黄芪叶绿素的测定
叶绿素：使用叶绿素仪测定。分三次测定，即喷药后三天进行测定。每次测定均采用五点采样法测五根黄芪，由下向上第六个分支的叶片进行测定。
黄芪丙二醛含量的测定
参考李亚芳在植物丙二醛含量测定试验设计方案中的方法，测定丙二醛含量。
（1）丙二醛的提取：称取黄芪叶片材料1g，剪碎，加入2mL5%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mL三氯乙酸进一步研磨，匀浆在4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。
（2）显色反应和测定：吸取离心的上清液2mL（对照加2mL蒸馏水），加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取出试管并冷却，3000r/min离心15min，吸取上清液，以对照为空白测定532nm、600nm和450nm处的吸光度值。
（3） 结果计算
C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450
MDA含量[μmol/g]＝CVTV1/1000V2W
式中:C－MDA浓度，μmol/L；
VT－样品提取液总体积，mL；
V1－样品提取液和TBA溶液总反应夜体积，mL；
V2－与TBA反应的样品提取液体积，mL；
W－鲜样品质量，g。
黄芪产量的测定
采用五点采样法，采收后去土，称重，记录。
黄芪多糖含量的测定
参考刘瑞生和王必慧的黄芪多糖的提取和含量测定研究的方法进行测定。
葡萄糖标准曲线的绘制
（1）取经 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中加水溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取10mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成 0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。
（2）准确吸取葡萄糖标准溶液 0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、 共 6份，分别置10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充至刻度。
（3）精密吸取上述各溶液 2 mL 置具塞试管中，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0 mL，摇匀，放置5 min，置80 ℃水浴中加热 15 min，取出，迅速冷却至室温。另以2.0 mL蒸馏水同上平衡操作作为空白对照，在 490 nm 波长处测定吸光度。
（4）以无水葡萄糖浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程。
多糖的提取和含量测定
称取黄芪根粉末3g，加7倍的蒸馏水，煮沸1.5 h，用4层纱布过滤，滤渣用同样方法煮沸3次。合并滤液，加热浓缩，将浓缩液以2000 r/min 离心10 min，上清液中加3倍量95 %乙醇沉淀。在离心机中，2000 r/min 离心10 min倾去上清液，沉淀物中再加入95 %的乙醇至浓度为80 %，静置，倾出上清液。滤渣用丙酮洗涤2次，过滤。将滤渣放入烘干箱中，80 ℃烘干得到黄芪多糖。
取提取并经 80 ℃干燥至恒重的黄芪多糖25 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，摇匀，准确吸取 1 mL，置10 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配成0.1 mg/mL的多糖溶液。吸取上述溶液 0.5 mL，置 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水补充至 25mL，测定吸光度值，并代入回归方程计算算出多糖浓度，经过换算得出黄芪多糖含量。
总黄酮含量的测定
参考李春红紫外分光光度法测定黄芪总黄酮的含量。
总黄酮标准曲线的绘制
（1）精密称取芦丁20mg 置于100 mL 容量瓶中，加70%乙醇适量，水浴加热溶解，放冷，用 70%乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成0.2mg/mL的对照品溶液。
（2）精密吸取上述溶液 0.0mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL、2.2mL、2.4.mL于10 mL容量瓶中，加 5%亚硝酸钠0.5 mL，摇匀，放置6min，加入 10%硝酸铝0.5 mL，摇匀放置 6min，再加4%的氢氧化钠4 mL，溶液用 70%乙醇溶液定容，摇匀，放置 15 min。在 425 nm 波长处，以第一管溶液作为空白。测得不同浓度下吸光度值，以吸光度值为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行回归，绘制标准曲线。
总黄酮的提取和含量测定
取黄芪药材粗粉1g于圆底烧瓶中，每组三次重复，加10倍量95%乙醇，浸泡过夜，在 75℃水浴锅中浸提 1h，冷却，过滤，收集滤液，定容于 100 mL 容量瓶中，备用。将溶液稀释10倍，按照上述（2）中的步骤在425nm波长处测吸光度值，带入标准曲线。
结果与分析
3.1不同喷施次数对黄芪光合速率的影响
3.1.1喷施一次对黄芪光合速率的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行生长调节剂各种类之间、各浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表1喷施一次对黄芪光合速率影响的多重比较表（单位：mg CO2/10cm2/hr）
由表1可知，在喷施吲哚乙酸和多效唑的处理下，与空白对照对比，光合速率要高于空白对照，与空白对照都有极显著的差异。经过处理的黄芪中光合速率最强的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，光合速率最弱的是浓度为100 mg/L的吲哚乙酸，二者都有极显著的差异。在喷洒吲哚乙酸的处理中，在200mg/L的浓度时，光合速率最强，与其他两个浓度相比有极显著的差异；在喷洒多效唑的处理中，其他两个浓度之间无显著的差异。多效唑对黄芪处理中，黄芪光合作用随着生长调节剂的浓度提高不断变强，各个浓度之间有极显著的差异。
喷施二次对黄芪光合速率的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行生长调节剂各种类之间、各浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表2喷施二次对黄芪光合速率影响的多重比较表（单位：mg CO2/10cm2/hr）
由表2可知，在喷施两种生长调节剂的处理中，与空白对照相比均有极显著的差异。黄芪光合速率最强的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，光合速率最弱的是喷洒浓度为100mg/L的多效唑。在吲哚乙酸处理组中，浓度在200 mg/L时光合最强，与其他两个浓度有极显著的差异，在400 mg/L时光合最弱，与100 mg/L无显著差异。在多效唑的处理组中，光合速率随着浓度升高而增强。
喷施三次对黄芪光合速率的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行生长调节剂各种类之间、不同浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表3喷施三次对黄芪光合速率影响的多重比较表（单位：mg CO2/10cm2/hr）
由表3可知，在喷施两种生长调节剂的处理中，与空白对照相比均有极显著的差异。黄芪光合速率最强的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，光合速率最弱的是喷洒浓度为100mg/L的吲哚乙酸。在吲哚乙酸处理组中，浓度在200 mg/L时光合最强，与其他两个浓度有极显著的差异，在100 mg/L时光合最弱，与400 mg/L无显著差异。在多效唑的处理组中，光合速率随着浓度升高而增强。
由表1、2、3可知，高浓度的吲哚乙酸不利于黄芪进行光合作用，在多效唑的处理中，随着多效唑浓度升高，利于进行光合作用。
不同喷施次数对黄芪叶绿素含量的影响
3.2.1喷施一次对黄芪叶绿素含量的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01，因而还需进行生长调节剂各种类之间、不同浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表4喷施一次对黄芪叶绿素含量影响的多重比较表（单位：SPAD）
由表4可知，经过处理的黄芪叶绿素含量最高的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，与空白对照相比有明显的差异，其含量是空白对照的1.534倍；叶绿素含量最少的是喷洒浓度为100 mg/L的吲哚乙酸，是空白对照的1.001倍，但无显著差异。
喷施二次对黄芪叶绿素含量的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01，因而还需进行生长调节剂各种类之间、不同浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表5喷施二次对黄芪叶绿素含量影响的多重比较表（单位：SPAD）
由表5可知，经过处理的黄芪叶绿素含量最多的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，与空白对照相比有明显的差异，是空白对照的1.689倍，与其他各组相比均有明显的差异。叶绿素含量最低的是喷洒浓度为400 mg/L的吲哚乙酸，是空白对照的1.060倍，但是与空白对照无显著差异。
喷施三次对黄芪叶绿素含量的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类之间的F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01，因而还需进行生长调节剂各种类之间、不同浓度之间、吲哚乙酸和多效唑与浓度交互作用之间的多重比较。
表6喷施三次对黄芪叶绿素含量影响的多重比较表（单位：SPAD）
由表6可知，经过处理的黄芪叶绿素含量最多是的是喷洒浓度为400 mg/L的多效唑，与空白对照相比有极显著的差异，是空白对照的1.691倍；叶绿素含量最少的是喷洒浓度为100 mg/L的多效唑，是空白对照的1.003倍，但与空白相比，无显著的差异。
由表4、5、6可知，三次测得黄芪叶绿素的含量呈上升状态，表明吲哚乙酸和多效唑都能促进叶绿素含量的增长。在吲哚乙酸的处理中，叶绿素含量在200mg/L时含量最高，在400mg/L时含量最低，高浓度的吲哚乙酸不适合黄芪叶绿素含量的积累。在多效唑的处理中，叶绿素含量随着浓度升高而增加。
不同喷施次数对黄芪丙二醛含量的影响
3.3.1喷施一次对黄芪丙二醛含量的影响
由SPSS分析可知，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，故进行多重比较。
表7喷施一次对黄芪丙二醛含量影响的多重比较表（单位：μmol/L）
由表7可知，浓度为400mg/L的吲哚乙酸丙二醛含量最高，与空白对照和其他处理组都有极显著的差异，其他各组与空白对照相比，均没有显著差异。
喷施二次对黄芪丙二醛含量的影响
由SPSS分析可知，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，故进行多重比较。
表8喷施二次对黄芪丙二醛含量影响的多重比较表（单位：μmol/L）
由表8可知，浓度为400mg/L的吲哚乙酸丙二醛含量最高，与空白对照和其他处理组都有极显著的差异，其他各组与空白对照相比，均没有显著差异。
喷施三次对黄芪丙二醛含量的影响
由SPSS分析可知， F>F0.01（3，16）、P<0.01，故进行多重比较。
表9喷施三次对黄芪丙二醛含量影响的多重比较表（单位：μmol/L）
由表9可知，浓度为400mg/L的吲哚乙酸丙二醛含量最高，与空白对照和其他处理组都有极显著的差异，其他各组与空白对照相比，均没有显著差异。
由表7、8、9可知，高浓度的吲哚乙酸丙二醛含量最大，说明黄芪叶细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重，黄芪叶片出现了胁迫伤害。
不同植物生长调节剂对黄芪产量的影响
由SPSS分析可知生长调节剂各种类F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行不同生长调节剂种类、不同浓度、不同生长调节剂和浓度交互作用之间的多重比较。
表10黄芪产量的多重比较表（单位：g）
由表10可知，黄芪产量最高的是喷施浓度为400 mg/L的多效唑，是空白对照的1.653倍，与其他各组存在极显著的差异；黄芪产量最少的是喷洒浓度为100 mg/L的吲哚乙酸，与空白对照几乎相等，无显著差异。
在吲哚乙酸的处理下，随着吲哚乙酸浓度的增加产量也随之增加，400 mg/L与200mg/L之间无显著的差异，但是这两个浓度与100 mg/L之间存在极显著的差异；在多效唑的处理下，产量随着多效唑浓度提高而增加，三个浓度之间均存在极显著的差异。在400 mg/L的浓度下，喷施多效唑的黄芪产量要高于喷施吲哚乙酸的黄芪产量，是它的1.202倍，且存在极显著的差异。所以，喷洒多效唑的处理要好于吲哚乙酸的处理，高浓度的多效唑有利于黄芪产量的提高。
不同植物生长调节剂对黄芪多糖含量的影响
表11葡萄糖标准曲线浓度及吸光度
经过换算后，由SPSS软件分析可知，生长调节剂各种类F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行不同生长调节剂种类、不同浓度、不同生长调节剂和浓度交互作用之间的多重比较。
表12黄芪多糖多重比较表（单位：mg/g）
由表12可得，吲哚乙酸100mgl/L、200mg/L、400mg/L与空白对照之间均存在较显著的差异，各个浓度之间也存在较明显的差异；多效唑100mg/L、200mg/L、400mg/L与空白对照之间均存在较显著的差异，各个浓度之间也存在较明显的差异；施用多效唑400mg/L的含量最高，与各组之间均有明显的差异；施用吲哚乙酸100mg/L的含量最低，与施用吲哚乙酸400mg/L、多效唑100mg/L之间无明显差异；施用吲哚乙酸200mg/L与多效唑200mg/L之间无明显差异。
在两种生长调节剂的对比中，黄芪多糖含量最高的是施用多效唑400mg/L，是空白对照的1.7倍，黄芪含量最低的是施用吲哚乙酸100mg/L，是空白对照的1.238倍。两种生长调节剂对黄芪根部多糖含量的积累都有促进作用。在同一种生长调节剂的对比中，施用吲哚乙酸的黄芪根部多糖含量在100mg/L至200mg/L之间呈上升趋势，在200mg/L至400mg/L之间呈下降趋势，在200mg/L时含量最多，是空白对照的1.535倍，效果最好；施用多效唑的黄芪根部多糖随着浓度的升高也随之升高，高浓度的多效唑可以促进多糖含量的积累。施用多效唑要比施用吲哚乙酸的效果要好。
3.6不同植物生长调节剂对黄芪总黄酮含量的影响
表13芦丁标准曲线的浓度及吸光度
经换算后由SPSS软件分析可知，生长调节剂各种类F>F0.01（1，16）、p<0.01，浓度的F>F0.01（3，16）、P<0.01，交互作用的F>F0.01（3，16）、p<0.01；因而还需进行不同生长调节剂种类、不同浓度、不同生长调节剂和浓度交互作用之间的多重比较。
表14黄芪总黄酮多重比较表（单位：mg/g）
由图2，表14可得，施用吲哚乙酸100mg/L、200mg/L、400mg/L的黄芪根部总黄酮含量与空白对照相比，都有极显著的差异，但是各个浓度之间差异不显著；施用多效唑100mg/L、200mg/L、400mg/L的黄芪根部总黄酮含量与空白对照相比，都有极显著的差异，各个浓度之间相比较也都有极显著的差异；总黄酮含量最高的是施用浓度为400mg/L的多效唑，与各组之间均有显著的差异，总黄酮含量最低的是施用浓度为100mg/L的多效唑，与100mg/L的吲哚乙酸无显著的差异，与其他各处理都有明显的差异。
在两种生长调节剂的对比中，黄芪根部总黄酮含量积累最多的是施用浓度为400mg/L的多效唑，大约是空白对照的1.2倍，含量积累最少的是浓度为100mg/L的多效唑，大约是空白对照的1.04倍，两种生长调节剂与空白对照相比含量均有所提高，证明两种生长调节剂对黄芪总黄酮含量都有促进作用。在喷洒多效唑生长调节剂的处理中，黄酮含量随着浓度的增加也随之增加，在400mg/L的时候达到最大值，效果最好；在喷洒吲哚乙酸生长调节剂的处理中，黄酮含量在100mg/L至200mg/L之间呈上升趋势，在200mg/L至400mg/L之间呈下降的趋势，在200mg/L时达到最大值，是空白对照的1.08倍，效果最好。高浓度的多效唑对黄芪根部总黄酮含量的积累有促进作用，施用高浓度多效唑的效果要好于吲哚乙酸。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
