一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂及其制备方法。
背景技术
青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的细菌性土传枯萎病，发病早期，植株下部叶片白天萎蔫，傍晚恢复，2～3天后，不再复原，由下向上逐渐发展，4～5天后，病株茎叶萎蔫枯死。青枯病一旦发病便难以控制，易造成作物大面积死亡甚至绝收，严重影响了马铃薯产业的发展。青枯病的发病机理：青枯病菌可通过植物根系在马铃薯的整个生长期侵染并潜伏。在合适条件(如高温、高湿)下潜伏在土壤中的青枯病病菌大量繁殖，堵塞植物的维管束发展成为病害。
目前防治青枯病多采用化学防治、土壤添加剂防治和传统综合防治。传统综合防治法受耕作方式和品种的限制，目前甚少高抗性能的马铃薯品种。化学药剂防治常用广谱杀菌剂，包括百菌清、多菌灵、可杀得等，虽能延缓发病，但防控效果不甚理想，并且长期使用化学药剂会使病菌产生耐药性，污染土壤及水资源，给人畜带来危害。目前市场上尚未有针对马铃薯青枯病的高效低毒和无环境污染的化学药剂。
鉴于化学防治和传统综合防治存在的不足，国内外利用有益微生物防治病虫害逐渐成为研究热点。关于茄科青枯病防治措施的研究目前已有大量的文献报道，包括利用噬菌体或者芽孢杆菌进行生物防治，向土壤中添加赖氨酸和丝氨酸、岩石粉，在植物根部施加香紫苏醇和松香醇，用苏云金杆菌的发酵液处理根系以及用包含恶二唑的砜衍生物进行防治等，然而综合考虑生产成本、防控性能和安全性等因素，该研究成果的推广应用前景尚不明确。因此，寻找有效防治青枯病的技术与方法，仍是当今植物病理学研究的重要课题之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，该生防菌剂可提高植株部分防御酶活性，影响根际土壤中微生物群落结构的变化，增强植株对青枯病的系统抗性，生防效果好。
本发明的技术方案如下：
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，每克菌剂中活菌含量≥1×108cfu，所述生防菌剂的活性成分由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、放线菌、短小芽孢杆菌中的两种复合而成。
进一步的，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、放线菌、短小芽孢杆菌中两菌种复合，其菌落形成有效活菌数(CFU)比例为(2.0-5.0):(2.3-6.0)。
一种所述防治马铃薯青枯病的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a.以青枯病菌为受试菌，将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、放线菌等用划线法转接到对应的LB平板中，于30-35 ℃培养20-25 h；将活化好的菌株分别接种于液体培养基中；30-35℃、160-180r/min条件下培养14-16 h制备种子悬液；
b.取青枯病菌60-70μL均匀涂布在平板上并静置30-40 min，将直径6 mm的无菌滤纸片贴至涂菌后的平板，各取拮抗菌组合菌液4-5μL滴至滤纸片上，于30 ℃培养24 h，根据拮抗效果选取两种菌株进行复配；
c.将干燥、过筛后的载体与两种菌株的种子悬液以10-20mL:200-300g的比例充分混合，以氯化钠5wt%、蔗糖2.5wt%和柠檬酸1.25wt%作为保护剂，常温培养36-48h，待pH＜4后干燥，干燥温度为45-60℃，即得所述生防菌剂。
进一步的，所述载体为豆粉、硅藻土中的至少一种。本发明具有如下有益效果：
本发明选用高的菌种均为青枯病菌的高效拮抗菌，两种菌种复合可提高生防菌剂对青枯病的拮抗作用。本发明生防菌剂可作为诱导因子激活并增强植株体内防御酶的活性，从而增强植株对青枯病的抗性；可提高土壤微生物的代谢强度，从而提高土壤肥力和健康程度，减少病害发生；可稳定根际土壤微生物群落结构，提高根际土微生物群落多样性，有利于增强植物的生防能力。
附图说明
图1为单一菌剂对青枯病菌的拮抗作用；
图2为复合菌剂对青枯病菌的协同抗性；
图3为生防菌剂对马铃薯根际土的活性菌群动态变化图；
图4为各处理组马铃薯叶片防御酶活性对比图；
图5为各处理组马铃薯根际土壤防御酶活性的动态变化图；
图6为高通量测序分析中各处理组的优势门（Phylum）的相对丰度图；
图7为高通量测序分析中LDA值分布柱状图；
图8为高通量测序分析中Weighted unifrac PCoA排序图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌（B1-Y3）按比例1:1复合而成。
实施例2
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分由枯草芽孢杆菌、放线菌（B1-A3）按比例1:1复合而成。
实施例3
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分由枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌（B1-G2）按比例1:1复合而成。
实施例4
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分由地衣芽孢杆菌、放线菌（F2-A3）按比例1:1复合而成。
对比例1
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌(B1)。
对比例2
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分为放线菌(A3)。
一种防治马铃薯青枯病的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株拮抗试验
1.单一菌株拮抗试验
以青枯病菌为受试菌，平板对峙法对实验室保种的49株菌进行多次重复筛选。取培养基上划线活化，于30 ℃培养24 h，将60 μL培养1 d的青枯病菌悬液涂布均匀在平板上，静置30 min后，将直径6 mm的无菌滤纸片贴至涂菌后的平板，滴加5 μL的供试菌液，于30 ℃培养2 d，设置两个平行实验，观察和测量抑菌圈大小。有5株拮抗青枯病的芽孢杆菌和放线菌，按抑菌圈由大到小依次为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, B1） > 放线菌（Actinomycetes sp.,A3）> 短小芽孢杆菌（Bacillus brevis,G2）> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis,Y3）> 地衣芽孢杆菌（B. licheniformis ,F2）。
所述供试菌株为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、放线菌、短小芽孢杆菌中的一种，供试菌株为普通市售产品；受试菌青枯病菌茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）分离自广东省惠州市惠东县铁涌镇马铃薯基地。
测试结果见下表：
2.复合菌株拮抗试验
对上述5株拮抗菌进行协同复配试验：将供试菌株转接到带病菌的平板上，于28 ℃的培养20 h。滤纸片法对供试菌株进行协同复配实验：取60 μL青枯病菌均匀涂布在平板并静置30 min，将直径6 mm的无菌滤纸片贴至涂菌后的平板，将两种供试菌株按比例1:1混匀，取各组复合菌液5 μL滴至滤纸片上，于30 ℃培养24 h，观察和测量抑菌圈大小，测试结果见图2和下表：
结果显示枯草芽孢杆菌-地衣芽孢杆菌（B1-Y3）协同拮抗效果最佳，优于单菌枯草芽孢杆菌B1。其次为枯草芽孢杆菌-短小芽孢杆菌(B1-G2) 、枯草芽孢杆菌-放线菌(B1-A3)(Fig. 1C and 1D)。以筛选结果为基础，研制生防菌剂并进行盆栽实验。
可见，本发明选用的菌种均为青枯病菌的高效拮抗菌，两种菌种复合可提高对青枯病菌的拮抗作用。
二、马铃薯根际的活性微生物测定
以品种为荷兰7号的马铃薯作为供试作物，挑选长势基本相同、无病虫害及机械损伤的植株于温室大棚内进行盆栽试验，实验设5个处理组和1个空白对照组，各组设5个平行，每盆种植马铃薯1株。
分别施用实施例1-2和格喜•田壮肥料（GT肥），菌剂 1:50 稀释后每株施0.2 L，GT肥按配方施用，施用方案如下表所示。
于5d、9d、15d施菌前进行三次采样，每组5株植物随机取3株进行检测，五点采样法获得3份根际土，10倍稀释法制备土悬液至10-6。选合适的稀释度分别用营养琼脂培养基、改良高氏1号培养基、PDA培养基、无氮培养基和蛋白胨氨化培养基接种，28℃培养1-3d后进行细菌、放线菌、真菌、固氮菌和氨化细菌的菌落计数，测试结果见下表和图3：
防病组先施用生防菌后施青枯病菌，治病组先施青枯病菌再施生防菌剂，染病组（DG）仅施青枯病菌而不施生防菌剂，可见在三个不同采样批次，添加了生防菌剂的防病a/b组、治病b组和染病组的活性细菌数均呈先降后升趋势，而治病a组的活性细菌数保持相对稳定，波动不大；防病组和治病组的活性放线菌和氨化细菌均呈上升趋势，而固氮菌则先上升后下降，均与空白对照组（BC）有差异，但差异不够显著。
放线菌是一类（G+C）含量高的生防菌，在植物病害生物防控中具有重要作用。复合芽孢菌剂的施用使放线菌数量增加，可能激发了放线菌对病理生理的应答反应。氨化细菌和固氮菌对土壤的硝化特性和氨化特性调控起至关重要的作用。复合芽孢菌剂显著提高了马铃薯根际土的固氮菌和氨化细菌数量，提示提高了固氮效能和硝化作用，本发明生防菌剂有利于修复土壤生态系统。
三、马铃薯植株防御酶活性测定
以品种为荷兰7号的马铃薯作为供试作物，挑选长势基本相同、无病虫害及机械损伤的植株于温室大棚内进行盆栽试验，实验设6个处理组和1个空白对照组，各组设5个平行，每盆种植马铃薯1株，处理组分别施用实施例1-4和对比例1-2，空白对照组不施拮抗菌，仅浇清水。移栽马铃薯苗后，各组于移栽第15、30、40、50、60、70 d施生防菌剂（OD值约为1.0），每株0.2 L（菌悬液以 1:50 稀释）；于第20 d和35 d施加肥精壮苗。在施加拮抗菌的第3 d施加青枯病菌液以建立抗病模型。
1. 马铃薯叶片防御酶活性测定
以马铃薯（苗期到蕾期）最后一次施肥为起点，每组5株随机取3株来检测，施加青枯病菌第7 d，采集各处理组植株叶片，通过SPSS分析测定马铃薯叶片的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性（n=3），测试结果图4。
实施例1-4和对比例1-2在四种叶片防御酶水平上有显著差异，总体看，双菌复合比单菌效果好。实施例1-4的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化氢酶（CAT）显著高于空白对照组。过氧化物酶（POD）活性则是实施例3和对比例1的结果显著高于空白对照组。
可见，本发明生防菌剂可提高PAL酶、SOD酶、PPO酶和CAT酶的活性，增强马铃薯植株抗性。其中B1-Y3复合菌组（实施例1）防控效果最优，与平板对峙实验的结果吻合。拮抗菌剂可作为诱导因子激活并增强植株体内抗氧化酶和病程相关蛋白的活性，从而增强植株对青枯病的抗性。
2.马铃薯根际土防御酶活性测定
在施加青枯病菌后第3、6、9、12 d进行土壤样品采集；每组随机取3株进行检测，每株在根际处进行5点混合采样。采集样品后去除杂草、石块等杂质并过22目筛，风干后进行防御酶活性测定。
（1）不同菌剂处理的根际土过氧化氢酶（CAT）活性如图5（a）所示：
如图5（a）所示，施加拮抗菌的处理组过氧化氢酶活性逐步上升，在第9d达到最高，实施例和对比例均高于空白对照组。可见，本发明菌剂在6d至9d内可使根际土壤过氧化氢酶活性提高。
（2）不同菌剂处理的根际土蔗糖酶活性如图5（b）所示：
如图5（b）所示，施菌后各处理组的蔗糖酶活性先升高后下降，实施例1-3、对比例2在第9 d的蔗糖酶活性达最大值，其中对比例2高达7.59 mg/g·24h，除对比例1外，其他处理组的蔗糖酶活性均显著高于空白对照组。可见，本发明生防菌剂可以提高根际土壤蔗糖酶活性。
如图5（c）所示，各处理组的脲酶活性先下降后上升，在第9天达到最大值。但实施例和对比例没显著差异。
马铃薯根际土壤酶活检测显示，实施例1-4的过氧化氢酶（CAT）和蔗糖酶活性均高于空白对照组，提示施用复合菌剂能提高土壤微生物的代谢强度，提高土壤肥力及健康程度，增强根际微生物的系统抗性，从而减轻病害的发生。
四、马铃薯根际土菌群结构测定
以品种为荷兰7号的马铃薯作为供试作物，挑选长势基本相同、无病虫害及机械损伤的植株于温室大棚内进行盆栽试验，实验设3个处理组，各组设5个平行，每盆种植马铃薯1株，分别施用实施例1、对比例1和清水。移栽马铃薯苗后，各组于移栽第15、30、40、50、60、70 d施生防菌剂（OD值约为1.0），每株0.2L（菌悬液以 1:50 稀释）；于第20 d和35 d施加肥精壮苗。在施加拮抗菌后第3 d施加青枯病菌液以建立抗病模型。在施加青枯病菌后第3、6、9、12d进行土壤样品采集；每组随机取3株进行检测，每株在根际处进行5点混合采样。采集样品后去除杂草、石块等杂质并过22目筛后进行土壤总DNA的提取。
1. OTUs测定
使用CTAB法提取土样的总DNA，采用Nanodrop 2000 分光光度计测定DNA的质量。对纯度和浓度合格的DNA样品进行PCR扩增。将纯度和浓度合格的DNA样品进行16SrRNA 的HiSeqPE250测序。拼接初步得到的Merged sequences，去除低质量序列后，得到每个样品的序列数（Clean sequence）和去除嵌合体后得每个样品的序列数（Effect sequence）。测序工作由广东美立康生物科技有限公司完成。
对Effect sequence进行OTU聚类分析和注释，采用Uparse将序列相似度大于97%的Reads归为一类Operational taxonomic units (OTUs)，采用Uparse对序列进行OTU划分，每个样品的OTUs数目汇总统计结果如下表所示：
其中，RalS组（对比例1）指采用枯草芽孢杆菌B1为拮抗菌剂，RalS1组指施加青枯病菌前采样分析，RalS2组指施加青枯病菌后采样分析；RalD组（实施例1）指采用枯草芽孢杆菌B1和地衣芽孢杆菌Y3双菌复配为拮抗菌剂，RalD1组指施加青枯病菌前采样分析，RalD2组指施加青枯病菌后采样分析；空白对照组BC，即用清水代替生防菌剂，其他栽培管理相同。
RalS1组OTUs略高于RalS2组，RalD1组OTUs略高于RalD2组；施加青枯病菌使根际土壤中微生物物种丰度降低，降低了土壤的菌群多样性。RalD2组OTUs数目略高于RalS2组，本发明生防菌剂可更好的维持土壤微生物物种数量稳定。
在序列相似度为97%的水平下，将有效序列按照一定的相似性在不同的分类水平上进行划分，各组OTUs在分类水平上的统计结果如下表所示：
RalS2组OTU在门、纲、目、科、属水平上低于RalS1组，且略低于BC组，对比例采用单一拮抗菌，在施青枯病菌后使根际土微生物多样性下降。RalD2组在纲、目、科、属水平上均高于RalD1组，本发明生防菌剂采用复合拮抗菌，施病菌后土壤的微生物群落多样性上升。
由OTU统计结果可得，生防菌剂可在一定程度上稳定根际土壤微生物群落结构，保护土壤微生物物种数量免遭病菌病理作用而急剧下降。对比单一菌剂组和复合菌剂组OTUs，可见复合菌剂在维持土壤微生物物种数量稳定上均优于单一菌剂。
2. α-多样性分析
α-多样性指数可指示微生物群落的多样性情况，包括物种的丰富度和相对丰度。常用的α-多样性指数有物种数、Shannon指数、Phylogenetic diversity （PD）指数、Good’scoverage指数、Chao1指数、Simpson指数等；其中，Good’s coverage指数是间接判断测序数据是否足够的指标。α-多样性指数结果如下表所示：
生防菌剂组(实施例和对比例)的Shannon index和Simpson index均高于空白对照组，施生防菌剂提高了根际土微生物群落多样性，增强土壤微生物群落的丰富度。实施例施病菌后的RalD2组比施病菌前的RalS2组α-多样性指数稍提高，复合菌剂在提高微生物群落多样性方面优于单一菌剂。
由α-多样性指数结果可得，拮抗菌剂的施加可以使α-多样性指数升高，即可提高根际土微生物群落多样性。对比施加单一菌剂组与复合菌剂组，复合菌剂在提高微生物群落多样性方面优于单一菌剂。
3. OTU物种注释分析
（1）OTU在门（Phylum）水平的物种注释
为了阐述马铃薯根际土的微生物群落组成，将获得的OTU代表性序列与数据库中的序列进行比对，进行物种注释分析。各处理组在门（Phylum）水平的物种注释如图6所示，样品在门水平上共含有49类细菌，其中酸杆菌门、放线菌门、变形杆菌门相对丰度＞10%，为优势菌群；拟杆菌门、绿弯菌门、蓝藻门、厚壁菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、疣微菌门相对丰度＞1%，为主要菌群；相对丰度＜0.1%不做统计。施加菌剂前后的马铃薯根际土样品的优势门组成的相对丰度见图6。
各处理组的物种丰度排前10的门基本相同，但每组的物种相对丰度有差别，丰度最高的依次为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门。本试验的测试菌（青枯雷尔氏菌）属于变形杆菌门；所用的拮抗芽孢杆菌属于厚壁菌门，而放线菌属于放线菌门，据此分析下列结果。在RalS组和RalD组中，最大优势菌门依次为变形杆菌门、放线菌门；RalS2组和RalD2组变形杆菌门相对丰度均高于RalS1组和RalD1组，青枯病菌施加后刺激作物的病理生理应答，使变形杆菌门相对丰度升高。RalS2组和RalD2组的放线菌门均高于RalS1组和RalD1组，即施加青枯病菌后放线菌门相对丰度升高，病菌在病理生理上激发了抗性的放线菌门，使其丰度上调。在厚壁菌门中，RalS组施加青枯病菌后厚壁菌门相对丰度下降0.9%，RalD组施加青枯病菌后厚壁菌门相对丰度提高2.1%，体现为厚壁菌门相对丰度大大提高。在酸杆菌门中，RalS2组和RalD2组显著低于RalS1组和RalD1组，施青枯病菌使酸杆菌门相对丰度下降，影响土壤物质循环和生态结构稳定性。
（2）属（Genus）水平上的原核微生物类群分析
在属（Genus）水平上，实施例、对比例和空白对照BC组存在显著差异的优势属的相对丰度统计如下表所示。
青枯雷尔氏菌属于Ralstonia属，芽孢杆菌属于Bacillus属，放线菌属于Actinomyces属，由此分析：
A.实施例和对比例（RalD组和RalS组）与空白对照组（BC）优势属中均无出现Ralstonia属，在这种盆栽试验条件下，青枯病菌没有成为根际土样的微生物优势属，与植株没出现青枯病症状相吻合，说明青枯病菌没在根际土大量定植和繁殖。
B.对于芽孢杆菌属（Bacillus），RalS1组Bacillus相对丰度为1.194%，属于优势属，提示施加单一菌剂可使生防菌在根际土定殖并成为优势属；而RalS2组Bacillus相对丰度下降，提示施加病菌后生防菌相对丰度下降，很可能是青枯病菌的病理生理应答反应所致。实施例RalD2组的Bacillus属相对丰度升高近3倍，远高于空白组；施青枯病菌后提高了生防菌的相对丰度。
由属水平的物种注释结果可得，单一菌剂RalS组优势属在施加病菌后原优势属趋于稳定，Burkholderia、Kaistobacter、Arthrobacter菌属相对丰度显著提高，成为施病菌后的前四优势菌属。复合菌剂RalD组优势属在施加病菌后原优势属趋于稳定，新产生Arthrobacter、Burkholderia菌属并成为前四优势属。施加单一生防菌剂后根际土壤中抗病的菌属主要是Burkholderia、Kaistobacter、Arthrobacter；施加复合生防菌后根际土壤中抗病的菌属主要是新增的Arthrobacter、Burkholderia。
4.组间物种结构差异分析
（1）LDA值分析
基于各样品优势属进行了LEfSe分析，显示了各组中有差异的类群。柱状图的长度代表差异物种的显著性，即为LDA值分析，结果如图7所示。由图中不存在RalS1组，表明该组与其他组没有显著差异的属；RalS2组与其他组丰度差异显著的物种共有19种，其中差异最显著的物种为Proteobacteria；RalD1组共有25种，其中差异最显著的物种为Rhodospirillaceae； RalD2组共有3种，其中差异最显著的物种为Rhodoplanes；BC组共有19种，其中差异最显著的物种为Actinomycetales。
（2）PCoA排序分析
Weighted unifrac PCoA排序图如图8所示，RalS1组和RalS2组之间存在一定的距离，但其距离小于RalD1组和RalD2组之间的距离；对比单一菌剂RalS组，复合菌剂RalD组在施加青枯病菌后物种间的组成结构变化较大。BC组与实施例间的距离最大，表明实验组与空白组间物种的组成结构变化明显。对于贡献值最大的第一主成分而言，RalD1组与RalD2组距离最大，对应组别物种的组成结构的变化最大。其中个别平行组的样点没有聚拢在一起，这与采样的随机性和波动性有关。大部分平行样都较聚拢，表明结果合理。
由微生物群落间Weighted距离结果可得，青枯病菌处理后马铃薯根际土壤的微生物组成及物种丰度产生差异，其中RalD组（实施例1）的微生物群落差异比RalS组(对比例1)大。由PCoA排序结果可得，单一菌剂组施加病菌前后物种间组成结构变化较小，而复合菌剂组变化较大。施用本发明生防菌剂前物种组成结构差异较大，施用后对于土壤微生物群落的结构稳定的维持及在青枯病处理后对土壤微生物群落的结构稳定的维持具有重要作用。
