新活性化合物 篇1：
药物活性化合物
本发明涉及一种药物活性化合物，尤其涉及一种肝脏靶向的药物活性化合物。
在Kramer W等，J.Biol.Chem.;Vol 287：18598-18604，1992和EP-B-0417725中公开了苯丁酸氮芥被作为典型药物连接到胆汁酸甾环的3α-OH位上，以在胆汁酸的3α羟基和羧基之间形成酯键。
同样地，在EP-A-0232788和US 4793949中公开了一种治疗癌症的药物，其中N-卤代烷基氨基甲酰基被结合在甾环中3-OH的位置上。
在Marin等Int.J.Cancer，78：346-352，1998和Macias等，J.LipidRes.;39：1792-1798，1998中报道了：通过甘氨胆酸的甘氨酸部分，共扼于甘氨胆酸的顺铂(cis-platin)的合成，其结果是顺铂中的一个氯原子丢失。在顺铂中的两个氯原子对药物的效力非常重要，因为它们与DNA形成双功能加合物。
在Manoharan等Annals of the New York Academy of Sciences，NewYork，vol.660，1992，306-309，页XP002162255中公开了胆汁酸与寡核苷酸DNA磷酸二酯，与磷酸二酯RNA摹拟物，以及与硫磷酯(phosphorothioates)的共扼作用，其中通过使用氨基连接物以提高反义寡核苷酸的生物利用率。因此，在此发明的连接物与药物活性部分之间没有酰胺键。
在Stephen等1992，Biochen.Pharmacol;43：1969-1974中报道了通过在胆汁酸C25羧基与三碘甲状腺氨酸的丙胺酸侧链的α氨基之间的酰胺键，甲状腺激素L-T3被连接到胆汁酸。药物和胆汁酸的连接引起药物中的氨基丢失，氨基被认为对药物的效力很重要。
在C.O.Mills等，Biochimica et Biophysica Acta，115(1991)，151-156页(见WO99/07325)中，公开了基于胆酰基(cholyl)-赖氨酰-荧光素的荧光胆汁盐，其中，通过使用包括赖氨酸分子α氨基的酰胺键，将赖氨酰连接到胆酰基基团上，同时通过异硫氰酸盐组使荧光组连接到赖氨酸分子的ε氨基组。C.O.Mills等(上述)注意到了在胆酰基-赖氨酰-荧光素和天然胆汁酸胆酰基甘氨酸之间，胆汁输出和肝提取物的相似性，并且建议以类似的方式处理这两种化合物。C.O.Mills等的一个结论是：相对于游离荧光素，具有较高的胆汁分泌和胆酰基-赖氨酰-荧光素肝提取物，该结论虽然没有给出这方面的具体教导，但是提示：与胆汁盐共轭可能是把化合物靶向肝脏的有效方法，。
在M.J.Monte等，Journal of Hepatology，1999;31：521-528中，公开了将胆汁酸用作分子，用于将向肝瘤穿梭运输细胞抑制药物，并阐述了一种抗肿瘤化合物，该化合物是通过下面的方法获得的：将顺铂结合到甘氨酸的羧基上，以产生顺一二氨络物氯胆酰基甘氨酸铂(II)。
本发明的目的是提供一种肝脏靶向的药物活性化合物，其中在肝脏靶向的部分和药物活性部分之间存在强健，但是不会不适当地影响药物活性部分的效果，借此，将药物活性部分靶向肝细胞内部的细胞器是可能的。
本发明提供了肝脏靶向的药物活性化合物，其具有如下的通式(I)：
其中A是α-OH或者β-OH，B是α-H或者β-H，C是-H，α-OH或者β-OH，或者B和C共同形成一个双键，D是-H，α-OH或者β-OH，E是是-H，α-OH或者β-OH，G是侧链部分，-NH-J选自：(i)含有氨基的药物活性化合物的残基，其中所述的NH-基团是由所述的药物活性化合物的氨基基团提供的，和(ii)被加成了氨基的药物活性化合物的残基，其中所述的-NH-基团由所述的被加成的氨基提供;X和Y各自独立代表一个单键，-(CH2)z-(其中z为1到8)，-O-或者-S-;n是0或者1;m是0或者1;和p是0或者1，条件是当-NH-J是(i)时，m是1。
连接J和分子剩余部分的酰胺键很强，这样使得其在体内不会断裂。这明显地不同于以前的建议，那些建议基于：为基于胆汁酸的药物提供运载工具，此运载工具在体内可以很容易地被从药物上切割下来。因此本发明依赖于：提供与药物活性化合物相关的氨基(或者是其它可以提供-NH-J中的-NH-基团的基团)。
当药物活性化合物本身含有提供-NH-J中-NH-的氨基的时候(如在阿霉素中)，m值为1是重要的，因为这样，经由任选-(G)p-基团依附到分子剩余物上的氨基，提供了所述药物活性化合物的被结合的(因此是非官能性)氨基的功能。在这种情况下，优选对G和Y进行选择，从而使得合成侧链上的NH2基团可以在物理上接近于-NH-J的-NH-基团，以此模仿通常出现在未共扼药物活性化合物上的未结合氨基的作用。
在药物活性化合物没有-NH-基团的情况下，这个基团应该被加在药物分子的适当位置上。在-NH-基团是由被添加到药物活性化合物的氨基所提供(如三苯氧胺)的情况下，那么就不需要存在侧链氨基，因此m在此情况下可以为0。在后面这种情况中，药物活性化合物本身可以含有氨基，也可以不含有氨基，但是如果本身含有氨基，由于它没有参与该化合物和胆汁酸部分的连接，所以仍然可以执行其所需的功能。
-NH-J残基可以基于任何选自下面的药物活性化合物：抗生素、利尿剂、肽、抗病毒药物、抗癌药物、肝病治疗药物、抗高血压药物、肾活素抑制剂、脯氨酰羟化酶抑制剂、干扰素诱导剂、DNA反义/正义和核糖体(ribosymes)。或者，-NH-J残基也可以基于多肽、蛋白质、核苷酸(DNA或者RNA)。
例如，-NH-J可以基于：阿霉素，表阿霉素，米托蒽醌，氨甲蝶呤，三苯氧胺，丝裂霉素C，氟尿嘧啶，阿拉伯胞嘧啶糖苷，硫鸟嘌呤，阿昔洛维(acyclovir)，丙氧鸟苷，两性霉素，伯氨喹，熊脱氧胆酰基赖氨酰半胱氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰磺基丙氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰-谷胱甘肽-(还原型)，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸砜，氨甲蝶呤，阿糖胞苷，L-半胱氨酸，磺基丙氨酸，L-半胱氨酸亚磺酸(L-cysteine sulphinic acid)，N-乙酰半胱氨酸，蛋氨酸，蛋氨酸砜，蛋氨酸亚砜，L-谷胱甘肽，S-腺苷基-同型半胱氨酸，S-腺苷基-蛋氨酸，8-氨基喹啉，双二乙氨乙基芴酮(2，7-二[2-(二乙基氨基)乙氧基]-9H-芴-9-酮)，双二乙氨乙基芴酮类似物，如双二乙氨乙基芴酮二盐酸化物，3，6-二[2-(二甲基氨基)乙氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮二盐酸盐，2，7-二[二甲基氨基乙酰基]-9H氧杂蒽二盐酸酸水合物，2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并噻吩二盐酸酸水合物和2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并呋喃-二盐酸酸水合物，苯丙氨酸氮芥(4-(二[2-氯乙基]氨基)-L-苯丙氨酸)。因此，本发明的化合物主要涉及将有利肝脏靶向的活性化合物运送到肝脏。这些化合物可以做如下的分类：
1肝脏治疗药物靶向的化合物。
2治疗胆管紊乱药物靶向的化合物。
3保护性试剂(如射线保护剂)靶向的化合物，该制剂本身不起治疗作用。
4酶靶向的化合物，该酶被设计用来局部活化另一种前体药物(如，通过给予一种惰性的前体药物，该药物在肝脏中被靶定的酶局部活化)。由于药物不是被连接在胆汁酸部分上，所以在体内可能不会被很快清除，因此其具有有潜在优势。
5试剂靶向的化合物，该试剂在肝脏中积极地进行物质替换以形成通常有用的活性物质。
对于侧链部分而言，-G-可以是-(CH2)q-(其中q是1到8，也可以是1到5，优选是3到5，最优选是4)，也可以是-O-或-S-。当将药用活性化合物连接到肝脏靶向的胆酸分子部分的部分上存在侧链氨基的时候(即m=1)，-G-通常都应该存在(即p=1)。当p=1并且-G-是-O-，-S-，或者-(CH2)q-(当q是3到5时)时，优选Y代表单键。
通式(I)化合物中的类固醇部分可以基于：胆酸，鹅脱氧胆酸，脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，猪胆酸，α-、β-、或ω-鼠胆酸，降胆汁酸，石胆酸，3β-羟基胆酸(hydroxycholenoic acid)，熊脱氧胆酸，异胆酸(5α-胆烷-24-酸)(allocholic acid(5α-cholan-24-oic-acid))，或者类似物。
共轭胆酸是相对亲水的，从而不很容易被细胞内的细胞器吸收。因此，它具有快速的肝细胞转运。而共轭脱氧胆酸的亲水性比共轭胆汁酸小，更能够穿透细胞，所以它具有相对较慢的肝细胞转运。共轭脱氧胆酸具有凋亡(apoptotic)的性质，并且被胆管细胞(肝细胞)吸收。因此，当共轭脱氧胆酸与抗肿瘤药物共轭时，就能够将抗肿瘤药物靶向到胆管肿瘤(肝细胞肿瘤)之上。
共轭石胆酸是胆酸盐中疏水性最强的物质，因此最能够穿透细胞。它能够被细胞核吸收，因此当它与药物进行共轭结合时，可以将药物定位到细胞核中。
共轭熊脱氧胆酸的亲水性很强，所以对细胞穿透性较差，它的肝细胞转运介于胆汁酸和石胆酸之间。熊脱氧胆酸盐水具有抗胆汁淤积(anticholestatic)性质，因此若将它与已知的、影响胆汁淤积性质的药物相结合，那么通过协同机制或者另外的机制，可能会增强它们的抗胆汁淤积潜能。
本发明提供了一种制备上述通式(I)化合物的方法，该方法包括下面的步骤：将通式(II)的化合物(其中A，B，C，D，E，G，n，m和p的涵义如前文所述)和具有氨基的药物活性化合物反应，以在药物活性化合物的氨基和通式(II)所示化合物的羧基之间形成酰胺键。
本发明优选的化合物是通式(III)的化合物：其中，G和J的涵义如前文所述。
现在对本发明进行进一步的详细描述：实例1胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)的合成总反应路线
步骤1-胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC(V)的制备
在-5℃的温度下，向化合物(IV)，胆酸(1.46g，3.573mmol)中加入无水丙酮(10cm3)和三乙胺(500μl，3.59mmol)，在反应器中搅拌20min，然后逐滴加入氯甲酸异丁酯(0.534ml，1.3g，4.56mmol)并保持温度在-5和-10℃之间。滴加完成20min后，在15℃下剧烈搅拌反应30min。在25ml的锥形瓶中，将氢氧化钠(0.153g，3.825mmol)水(8cm3，8g)溶液添加到N-ε-FMOC-L-赖氨酸(3.568mmol，1.314g)中，搅拌直至形成澄清的溶液(约20min)。将该溶液迅速加入到前文所述的胆汁酸混合液中，开始在+4℃下剧烈搅拌10min，再在室温继续搅拌50min。
用1M HCl(4.43cm3)将反应液的最终pH调到2左右。将该酸化溶液用乙酸乙酯(3×50ml)在分液漏斗内进行萃取。合并萃取后的乙酸乙酯，过滤，蒸馏水(pH2)洗涤，再用硫酸钠干燥。干燥后的溶液在40℃下旋转蒸发，蒸干后得到化合物(V)，胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC，该物质为白色固体，纯度90%，产率97%。用TLC进行进一步的纯化。步骤2-转化得到化合物(VIII)
将化合物(VI)，阿霉素盐酸化物(24mg，40μmol)和三乙胺(6μl，40μmol)悬浮于300μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加溶解于200μlDMF中的化合物(V)，胆酰基-赖氨酰-N-ε-FMOC(34mg，40μmol);降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(6mg，40μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(8mg，40μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。反应后的DMF溶液用100μl的醋酸稀释溶液(1ml冰醋酸溶解在10ml蒸馏水中)进行酸化。离心，收集上清液。加入二乙醚形成粘性沉淀，随后加入200μl甲醇，在真空浓缩。另外加入甲醇200μl，通过逐滴加入二异丙醚，化合物(VII)，胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素从甲醇溶液中沉淀出来。沉淀出来的胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素用二乙醚洗涤三次，真空中彻底干燥20min，再经过TLC纯化后，其产率为98%，纯度达到96%。
用5%的哌啶(200μl)溶液使胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素进行温和的断裂，在室温下温育10min。加入20μl0.5M的HCl终止反应，随后加入二异丙醚来产生化合物(VIII)，胆酰基-赖氨酰-阿霉素。经过TLC纯化后，胆酰基-赖氨酰-阿霉素的产率≥96%，纯度≥94%。
经过质谱测定化合物(VIII)的分子量为1062.5(见图1，该图显示了化合物(VIII)和其钠加合物的质量(分子量为1084.5)，C-13同位素的质量(分子量=1085.4)，C-14同位素的质量(分子量=1086.4)。已经显示化合物(VIII)能溶于水，甲醇和乙醇，不溶于非极性溶剂，如乙氧基乙烷。体外毒性测试
用原位末端标记的方法，将上述合成的胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)与游离的阿霉素和胆酸盐相对照，进行毒性测试。原位末端标记法可以进行凋亡和坏死的半量测试。
使用24孔板中的HepG2细胞(眼镜蛇美国典型培养中心(CobraAmerican Type Culture Collection))进行实验。将阿霉素、胆酸盐或者胆酰基-赖氨酰-阿霉素(一直到0.86μmol的各种剂量)平行添加三次并且培养4h。用胰蛋白酶处理，使细胞从平板上消化下来，细胞离心(cytospun)，然后冷冻。
为了测量细胞的活性，将切片升至室温30min，再在丙酮中固定10min，用石蜡封存。
制备原位末端标记(ISEL)阳性混合液：缓冲液(1ml)，dATP(1μl)，dCTP(1μl)，dGTP(1μl)，DiglldUTP(1μl)和Klenow DNA聚合酶(4μl)。同样制备原位末端标记(ISEL)阴性混合液：缓冲液(1ml)，dATP(1μl)，dCTP(1μl)，dGTP(1μl)，DiglldUTP(1μl)和水(4μl)。向细胞转子(cytospin)和盖玻片上加入60μl的ISEL阳性混合液或阴性混合液。在37℃下漂浮水浴1h，取走盖玻片，用蒸馏水洗涤3次，每次5min，再用pH7.5的TBS洗涤5min。抗异羟洋地黄毒苷(digoxigen)碱性磷酸酶和TBS以1∶200的比例稀释后加入，并在室温下温育1h后，用pH7.5的TBS洗涤2.5mins，再用pH8.2的TBS洗涤2.5mins。制备的底物混合物包括如下物质：磷酸萘酚(10mg)，N，N-二甲基甲酰胺(1ml)，Tris pH8.2(49)，IM左旋(四)咪唑，(50μl)和坚牢蓝(Fast blue)(50mg)。
将底物混合液加入每个细胞转子，使其显影15min，再用蒸馏水洗涤，然后测定。
所得结果列在表1中所示，与图2相对应
表1
化合物(VIII)与阿霉素以及胆酸盐的毒性比较(死细胞%)
浓度 平均数%(μM) 胆酸盐浓度 平均数%(μM) 阿霉素 浓度 平均数%(μM)化合物(VIII) 0 1 - - 0.03 1 0.06 0 0.12 1.8 - - 0.86 1 0 1 - - 0.03 9.4 0.06 14.9 0.12 28.9 0.45 50 0.86 100 0 0 0.00 3.3 0.03 7.6 0.06 10.8 0.12 20.5 0.45 49 0.86 96.6
从上表的结果可以看出，在0.06到0.86μM的浓度范围内，游离的阿霉素和化合物(VIII)有相似的毒性。体内胆汁分泌测试
将胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)，游离阿霉素和游离胆酸盐按照如下的方式进行胆汁分泌测试。
所有的动物实验均是按照当地机构关于实验室动物使用和保护的相关规定进行的。实验测定Wista大鼠中14C-阿霉素(14C-Dox)和14C-胆酰基-赖氨酰-阿霉素(14C-化合物VIII)的胆汁分泌。麻醉大鼠：用戊巴比妥对体重为250-300g的大鼠进行腹膜内给药(i.p.为50mg/kg体重)。进行剖腹手术后，插入上部带有Portex聚乙烯管的胆管(20cm长，i.d.=0.29mm，o.d.=61mm，A.R.Horwell，London UK)。动物的体温由直肠探针检测并通过连续温度调节器维持在37.5±0.5℃。将14C-Dox(1mg/300ul)或者14C-化合物VIII的药丸溶解在生理盐水中，通过颈静脉直接注射的方法注射进动物(n=6)体内。每隔10min收集一次等量的胆汁，持续60min。60min后，再收集动物的心脏、肝脏、血液、尿样，用放射性分析，分析其中14C-Dox或者14C-化合物VIII的含量。所有胆汁等份样品还针对基底胆汁背景，在液闪测定仪中分析其放射性。
测量结果是以给予剂量中放射性的百分比来表示的。如下面的表2和表3a所示：
表2-胆汁分泌
时间(分)平均数% SD C14-阿霉素C14-阿霉素平均数% SDC14-化合物(VIII)C14-化合物(VIII) 0 10 20 30 40 50 60 0 0 2.3 0.3 4.7 0.7 2.6 0.4 2.4 0.4 1 0.1 0.8 0.1 0 0 41.7 9.7 20 3.1 8 3.5 5.6 2.4 4 2.1 2.5 0.9
表3a
Wistar大鼠中累积的胆汁分泌
时间(分钟)平均数%剂量 SD阿霉素 阿霉素平均数%剂量 SD化合物(VIII)化合物(VIII) 0 10 20 30 40 50 60 0 0 2.3 0.5 7 1.2 9.6 0.8 11.7 1 12.7 1.1 13.5 0.6 0 0 41.7 9.7 61.7 6.4 69.7 5.3 75.3 4.07 79.3 4.2 81.8 3.9
结果同样图解在图3a和图3b中。
从上面可以看出，与游离的阿霉素相比，化合物(VIII)能够快速的到达肝/胆系统。
我们进行进一步的测试，以估计在Wista大鼠的肝脏、心脏、尿和血液中，所测试化合物的剂量百分比。结果如表3b所示，对应的图解为图4。
表3b
60分钟时剂量的百分比
平均数%剂量 SD阿霉素 阿霉素平均数%剂量 SD化合物(VIII)化合物(VIII)肝脏心脏尿血总计 1.9 0.4 10.8 1 4 0.8 74.7 9.6 91.4 - 14.7 2 0 0 2.2 0.4 8.9 1.6 25.8 -
从表3a和3b可以看出，在给药60min后，化合物(VIII)能够有效的靶向肝部，而游离的阿霉素主要存在于血液中，在肝脏中的量极少。实例2
重复实例1的实验过程，除了将步骤1中的N-ε-FMOC-L-赖氨酸替换成3.568mmol(0.879g)的N-ε-tBOC-L-赖氨酸来制取胆酰基-赖氨酰-N-ε-tBOC。随后在第2步中用胆酰基-赖氨酰-N-ε-tBOC(26mg，40μl)用来生产胆酰基-赖氨酰(tBOC)阿霉素，用乙酸乙酯(含3M的HCl)代替哌啶溶液对胆酰基-赖氨酸(tBOC)阿霉素进行断裂来生产化合物(VIII)。实例3
用当量的脱氧胆酸代替胆汁酸生产通式(IX)的化合物，其余均重复实例1和2中的步骤。实例4
用当量的石胆酸代替胆酸生产通式(X)的化合物，其余均重复实例1和2中的步骤。实例5
将阿霉素盐酸化物(24mg，40μmol)和三乙胺(6μl，40μmol)悬浮于300μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加熊脱氧胆酰基-赖氨酰-N-ε-FMOC(34mg，40μmol);降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(6mg，40μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(8mg，40μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。在反应结束时，过滤该混合物，将甲醇(400μl)添加到滤液中，随后加入二异丙醚沉淀出熊脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素-FMOC(UCLDFmoc)。用二异丙醚将沉淀洗涤三次，溶解在氯仿(1ml)中，再用二异丙醚沉淀得到UCLDFmoc，其产率为90-96%，纯度范围是91-94%。
将哌啶(5μl)溶解在200μl的DMF中，并用该溶液对6mg UCLDFmoc进行温和断裂，反应条件为：室温下搅拌5.5分钟，以得到熊脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92%，纯度为90-92%)。实例6
用脱氧胆酰基-赖氨酰-FMOC(30.6mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)来得到脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92%，纯度为90-92%)，其余均重复实例5中的步骤。实例7
用猪胆酰基-赖氨酰-FMOC(34mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)生产猪胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92%，纯度为90-92%)，其余均重复实例5中的步骤。实例8
用石胆酰基-赖氨酰-FMOC(30mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)生产石胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92%，纯度为90-92%)，其余均重复实例5中的步骤。实例9
将10mmol(3.72g)三苯氧胺(1-(p-β-二甲基氨基乙氧基苯基)-反-1，2-联苯丁-1-烯)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或四亚甲基砜(8ml)中，在无水的条件下，将其加入到由0.4mg四氟硼酸硝化物溶解于6ml DMF或四亚甲基砜所得到的溶液中，加入时要用一定的速度搅拌，使温度保持在15℃和25℃之间。添加完成之后，在20℃和35℃之间继续搅拌30min。而后将反应液小心地倒入5ml冷水中。分离有机层，用水洗涤两次，氯化钙干燥。在减压的条件下蒸馏除去过剩的芳香族底物，得到三苯氧胺硝酸盐。
三苯氧胺硝酸盐在酸(H3O+)中与氯化锡(SnCl2)反应，再加入氢氧化钠以得到三苯氧胺胺，产率为92%。所得到的三苯氧胺胺以类似于实例1或2中所描述的方式那样，与胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC或胆酰基-赖氨酸-N-ε-tBOC反应，以使阿霉素与胆酰基-赖氨酸FMOC或胆酰基-赖氨酸-tBOC连接。再用5%的哌啶进行温和断裂，得到胆酰基赖胺酰三苯氧胺(cholyllysltamoxifen)。将胆酰基赖胺酰三苯氧胺进行磺化，得到能够溶于水的胆酰基赖胺酰三苯氧胺磺酸盐。比较实施例胆酰基赖氨酰CBZ阿霉素(CL(CBZ)-Dox)的合成
将阿霉素盐酸化物(48mg，80μmol)和三乙胺(12μl，80μmol)悬浮于600μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加溶解在0.4mlDMF中的胆酰基赖氨酸-N-ε-FMOC(64mg，80μmol);降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(12mg，80μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(16mg，80μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。用200μl的稀释醋酸溶液酸化所形成的DMF溶液。离心后，收集上清液，加入乙酸乙酯沉淀出CL(CBZ)-Dox，干燥沉淀物以得到CL(CBZ)-Dox，其产率为92%。细胞毒性分析
图5显示了从细胞毒性测试中得到的结果。细胞毒性测试操作如下：将大鼠的肝细胞单层培养物与铬-51(4μCi)共培育18小时，接着与0.012M的CL(CBZ)和CL(CBZ)-Dox共培育。测量上清液和细胞的活性。铬-51的释放用总活性(培养基+细胞)的百分比表示。数值为：平均数+/-SD[n=5]。*=p<0.001 CL(CBZ)/(CBZ)-Dox和对照(与铬-51培育后，没有加入任何物质)。
在对照(37.61+/-1.56%)，(CBZ)-Dox(36.45+/-3.77%)和CL(CBZ)(49.01+/-2.57%)之间，没有观察到显著差异(P>0.1)。这表明提供一个游离的氨基来代替阿霉素的氨基是非常重要的，阿霉素的氨基已经被用于：在与胆酰基赖胺酰部分的连接中形成酰胺基。进一步毒性测试
我们用12种人肿瘤细胞系(包括大细胞肺癌H460，乳腺癌细胞系MCF7，子宫癌细胞系UXF1138L和大细胞肺癌LXFL529L)测试胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)的体外抗增殖活性，并与游离的阿霉素和胆汁酸进行了对照比较。5-20.000细胞/孔的细胞被铺在96孔板上。24小时后，加入待分析的化合物，其剂量水平的范围分别为：3nM-30μM(胆酰基-赖氨酰-阿霉素和胆酸)，0.3nM-3μM(阿霉素)。连续在测试化合物中暴露4天后，用碘化丙锭确定细胞DNA含量，该物质会产生与细胞数目有关联的荧光信号。
研究发现胆酰基-赖氨酰-阿霉素具有类似于阿霉素的潜在活性。胆酰基-赖氨酰-阿霉素的IC70平均值为1.3μM，游离阿霉素的为0.7μM。胆酰基-赖氨酰-阿霉素和游离阿霉素表现出不同的细胞毒性模式，但是这些化合物对肿瘤细胞的选择性却基本相同。对胆酰基-赖氨酰-阿霉素最敏感的细胞株系是大细胞肺癌H460、乳腺癌细胞系MCF7、子宫癌细胞系UXF1138L和大细胞肺癌LXFL529L。游离的胆酸在体外没有显示出抗肿瘤活性。
新活性化合物 篇2：
活性化合物结合物
本发明主要涉及活性化合物结合物，其包括(A)丙森锌和成分(B)， 所述成分(B)包括(B1)一种或多种含有硼(B)的盐和(B2)一种或 多种含有锰(Mn)的盐。更具体地，本发明的活性化合物结合物可用于 改善植物品质。本发明还涉及本发明的活性化合物结合物的相应方法和用 途。
丙森锌的分子式为(C5H8N2S4Zn)x，其是聚合的亚丙基双(二硫代氨基 甲酸锌)(CAS登记号12071-83-9)并可由下列化学式(I)描述：
已知丙森锌具有杀真菌性能并可用于防治各种植物病害(参见例如 GB935981)。
WO2011/107443A1教导了丙森锌用于在锌缺乏情况下的生理预防 性处理和治疗性处理的用途。其中也报道了，除了生理治疗性作用外，丙 森锌处理带来更高的产量。出于在温室中的实验性目的，在WO 2011/107443A1中，播种了某些植物并使其在岩棉中生长，所述岩棉用霍 格兰溶液以滴灌方式施肥。然后，在一定的时间间隔后，将丙森锌通过喷 洒施用施加到各个植物。
WO2012/089724A1涉及用于改善植物品质的方法，该方法包括采用 植物品质改善量的含有微量营养素的活性成分处理作物植物，和/或处理 作物植物的生长地点或期望生长的地点，和/或处理植物繁殖体。
2011年10月在印度海得拉巴的第三届国际锌讨论会上展示了标题为 “-AFungicideImprovingZincNutritioninPlants”的海报 (http://www.zinccrops2011.org/presentations/2011_zinccrops2011_goertz_ abstract.pdf)于。其中，可得出这样的结论，即除了其广谱杀真菌活性外， 在商业施用率下施用的(有效成分：丙森锌)对于在锌缺乏情 况下种植的作物的生长、发育和品质具有显著积极的影响。施用 可避免植物中的锌缺乏。结果证明，在病害的情况下，当农民 施用杀真菌剂时，也能为植物提供改善的锌营养，减少对于锌 肥的需求。
DE2558385A1涉及提供改善的作物产量的组合物，该组合物含有 (1)某些二硫代氨基甲酸盐(dithiocarbamidates)和(2)无机酸或有 机酸的锰(Mn)盐。
此外，WO2005/070204报道了微量营养素在杀虫剂组合物中用于降 低植物毒性的用途。
强加于现代作物保护组合物上的环境和经济要求不断提高。这不仅涉 及到，例如，作用谱、毒性、选择性、施用率等，还涉及到改善的植物品 质，特别是增加的产量，和/或涉及到改善的植物活力。
现已令人惊讶地发现，本发明的活性化合物结合物，不仅带来关于待 防治的植物病原体的作用谱方面的增强，而且实现了改善的植物品质，特 别是提高的产量，和/或改善的植物活力。本发明的活性化合物结合物具 有协同特性，如改善的植物性能，例如更好的生长、增加的采收产量、更 发达的根系、更大的叶面积、更绿的叶子、更强壮的枝条，特别是更绿的 叶子。
因此，本发明涉及活性化合物结合物，其包括：
(A)丙森锌，
和成分(B)，其包括
(B1)一种或多种含有硼(B)的盐，和
(B2)一种或多种含有锰(Mn)的盐，
在本发明的活性化合物结合物中，成分(B1)的一种、几种或所有 组分优选选自硼的氧化物和硼酸类以及它们的盐。
在本发明的活性化合物结合物中，成分(B1)的一种、几种或所有 组分优选选自三氧化二硼(B2O3)、H3BO3、H2B4O7、硼酸钠盐(优选 硼砂，也称为硼酸钠、四硼酸钠或四硼酸二钠，优选无水硼砂(Na2B4O7)、 五水硼砂(Na2B4O7·5H2O)或十水硼砂(Na2B4O7·10H2O))、硼酸钾盐(优 选K2B4O7及其水合物，优选其四水合物K2B4O7·4H2O)、硼酸钙盐(优 选CaB4O7、Ca3(BO3)2及其水合物)、硼酸镁盐(优选MgB4O7、Mg3(BO3)2及其水合物)、硼氢化钾、硼氢化钠、硼酒石酸钾和硼酸镍(II)。
在本发明的优选的活性化合物结合物中，成分(B2)的一种、几种 或所有组分选自锰(II)盐，优选选自乙酸锰(II)、硫酸锰(II)、氯 化锰(II)、硝酸锰(II)和磷酸锰(II)。
在本发明的更优选的活性化合物结合物中，
成分(B1)包括四硼酸二钠和/或四硼酸二钠水合物或由四硼酸二钠 和/或四硼酸二钠水合物组成，
和/或
成分(B2)包括硫酸锰(II)和/或氯化锰(II)或由硫酸锰(II)和 /或氯化锰(II)组成。
如果本发明的活性化合物结合物中的活性成分以一定的重量比存在， 所述协同效应尤其显著。
因此，在本发明的优选的活性化合物结合物中，成分(A)相对于成 分(B)的硼和锰的总重量的重量比在1250:1至25:1的范围内，优选在 1000:1至50:1的范围内，更优选在500:1至75:1的范围内，且特别优选 在350:1至100:1的范围内，各自基于所述活性化合物结合物的总重量 计。
在本发明的优选的活性化合物结合物中，其中硼[成分(B1)的]的总 量相对于镁[成分(B2)的]的总量的重量比在3:1至1:3的范围内，优选 在2:1至1:2的范围内，更优选在3:2至2:3的范围内，甚至更优选在4:3 至3:4的范围内，且最优选在5:4至4:5的范围内，各自基于所述活性化 合物结合物的总重量计。
在优选的实施方案中，本发明的活性化合物结合物还包括：
-选自锌(Zn)、铜(Cu)、铁(Fe)、钼(Mo)、硒(Se)、铝 (Al)、钴(Co)和镍(Ni)中的一种、几种或所有的微量营养素，
和/或
-选自氮(N)、磷(P)和钾(K)中的一种、几种或所有的大量营 养素。
优选地，本发明的活性化合物结合物还包括：
-氮(N)、磷(P)和钾(K)，
和
-选自锌(Zn)、铜(Cu)、铁(Fe)、钼(Mo)、硒(Se)、铝 (Al)、钴(Co)和镍(Ni)中的至少一种、优选两种或更多种、更优 选三种或更多种的微量营养素。
优选地，本发明的活性化合物结合物包括一种或更多种选自下列的组 分：氧化锌、乙酸锌、苯甲酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、硝酸锌、水杨酸锌; 乙酸铜、丁酸铜、氯酸铜、氯化铜、柠檬酸铜、葡糖酸铜、甘氨酸铜、硝 酸铜、水杨酸铜、乙酸亚铜、氯化亚铜;氯化铁、柠檬酸铁、果糖铁、甘 油磷酸铁、硝酸铁、三氧化二铁、含糖氧化铁、氯化亚铁、柠檬酸亚铁、 富马酸亚铁、葡糖酸亚铁、琥珀酸亚铁;钼酸、钼酸钙、钼酸钾、钼酸钠; 亚硒酸钠、亚硒酸钾、硒酸钠、硒酸钾;磷酸铝、硅酸铝;乙酸高钴、乙 酸钴、氯化钴、草酸钴、硫酸钴钾、硫酸钴;氯化镍(II)和硫酸镍(II)。
根据本发明，表述“结合物”代表成分(A)和(B)的各种组合， 例如单一的“即用混合物”形式、由单一活性化合物的单独制剂构成的合 并的喷洒混合物形式(例如“桶混物”)，以及当单一活性成分依序施用 时(即在短时间内，优选在小于两个小时内一个接一个施用)的合并使用 的方式。
本发明涉及通过将本发明的活性化合物结合物施用于植物、植物部位 和/或其生境中来改善植物品质的新方法。
术语“植物品质”(植物的品质)被定义为所述作物植物和/或其产 物的状况，其由几个方面单独决定或者由互相组合的方式来决定，例如产 量(例如增加的生物量，增加的有价值成分的含量和/或某些成分的改善 的含量或组成)和植物活力(例如改善的植物生长和/或更绿的叶子)。
用于衡量植物的品质，特别是植物状况的一个指标是它的产量。“产 量”应理解为由植物生产的具有经济价值的任何植物部位或产物，例如籽 粒、叶、根、适当意义上的果实、蔬菜、坚果、种子、木材(例如在林业 的情况下)或者甚至花卉(例如在园艺和观赏植物的情况下)。所述植物 产物可在采收后再被进一步利用和/或处理。
根据本发明，作物植物的“增加的产量”是指相对于在相同条件下生 产、但没有施用所述含有微量营养素的活性成分的植物的相同产物的产量， 各作物植物的产物的产量增加可测量的量。增加的产量尤其可通过以下的 改善的作物植物的性能来表征：
·增加的植物重量，
·增加的株高，
·增加的锌含量，
·增加的铁含量，
·增加的钙含量，
·增加的生物量，例如更高的鲜重(FW)和/或干重(DW)，
·更高的谷物产量，
·更高的酸度，
·更高的花青素含量，
·更多的分蘖，
·更大的叶片，
·增加的枝条生长，
·增加的(例如可溶性蛋白)，
·增加的油含量，
·增加的淀粉含量，
·增加的色素含量，
·增加的营养素含量，
·增加的蛋白质含量，
·增加的维生素含量(例如维生素B1、B2、C和E)，
·增加的脂肪酸含量，
·增加的代谢物含量，
·增加的类胡萝卜素含量(例如维生素A)，
·增加的必需氨基酸量，
·改善的营养素组成，
·改善的蛋白质组成，
·改善的脂肪酸组成，
·改善的代谢物组成，
·改善的类胡萝卜素组成，
·改善的糖组成，
·改善的氨基酸组成，
·改善的或优化的果实颜色，
·改善的叶色，
·更高的贮存能力，
·采收产物的更高的加工性。
根据本发明的一个实施方案，取决于所改善的性能的类型，产量增加 至少5%或更多，优选10%或更多，更优选15%或更多，甚至更优选20% 或更多，并且甚至更优选25%或更多，各自相比于相应的未处理的对照 植物而言。
用于衡量植物的品质，特别是作物植物状况的另一指标是“植物活力”。 所述植物活力体现在几个方面，例如总的视觉外观和生长。改善的植物活 力尤其可通过以下改善的植物性能来表征：
·改善的植物生命力，
·改善的植物生长，
·改善的植物发育，
·改善的视觉外观，
·改善的植物立根(更少的植物倾倒/倒伏)，
·改善的出苗，
·增强的根生长和/或更发达的根系，
·增强的结瘤，尤其是根瘤菌结瘤，
·更大的叶片，
·更大的尺寸，
·增加的植物重量，
·增加的鲜重(FW)
·增加的干重(DW)，
·增加的株高，
·增加的分蘖数，
·增加的枝条生长，
·增加的根系生长(扩展的根系)，当在贫瘠的土壤中或不利气候下 生长时增加的产量，
·增强的光合活性，
·增强的色素含量(例如叶绿素含量)，
·更早的开花，
·更早的结果，
·更早的和改善的萌芽，
·更早的籽粒成熟，
·更好的大小分布，
·更高的籽粒硬度，
·改善的自我防御机制，
·改善的胁迫耐受性和植物对生物和非生物胁迫因素(如真菌、细菌、 病毒、昆虫、热胁迫、冷胁迫、干旱胁迫、紫外线胁迫和/或盐胁迫)的 抗性，
·更少的非生产性分蘖，
·更少的死亡基生叶，
·更少的投入需要(如化肥或水)，
·更绿的叶子，
·在缩短的生长期下完全成熟，
·更少的肥料需要，
·更少的种子需要，
·更容易的采收，
·更快和更均匀的催熟，
·更长的保质期，
·更长的圆锥花序，
·延迟老化，
·更强和/或更具生产力的分蘖，
·更好的成分可提取性，
·改善的种子品质(用于在随后的季节播种用于种子生产)，
·降低的乙烯产量和/或乙烯被植物接收的抑制，
·更高的亮度，
·更强烈的色彩，
·改善的质地，
·更高的硬度，
·更高的白利糖度值。
根据本发明的一个实施方案，取决于所改善的性能的类型，所述植物 活力增加至少5%或更多，优选10%或更多，更优选15%或更多，甚至 更优选20%或更多，并且甚至更优选25%或更多，各自相比于相应的未 处理的对照植物。
取决于所处理的植物，更优选增加与其他植物不同的品质参数。接下 来，将根据所处理的作物植物而提及一些品质参数。
优选地，采用本发明的活性化合物结合物处理下面的植物和植物部位： 谷物如小麦、大麦、黑麦、小黑麦、高粱/粟和燕麦、玉米、棉花、大豆、 稻、马铃薯、向日葵、菜豆、咖啡，甜菜类(例如糖用甜菜和饲用甜菜)， 花生，油菜，水果(如苹果、梨和柑橘类水果)，蔬菜(如番茄、黄瓜、 洋葱和莴苣)，草地和观赏植物(也参见下文)。
对于谷物(的种子)的处理，优选小麦、大麦、黑麦、小黑麦和燕麦， 特别优选玉米和稻。此外，优选依照本发明处理属于茄科种(Solanaceae sp.)(例如番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)的植物和植物部 位。
根据本发明的一个实施方案，对于马铃薯而言，优选的品质参数为：
·增加的蛋白质含量(例如可溶性蛋白)，
·增加的淀粉含量，
·增加的生物量，如更高的鲜重(FW)和/或干重(DW)，
·增加的锌含量，
·更好的大小分布。
根据本发明的一个实施方案，对于稻而言，优选的品质参数为：
·增加的类胡萝卜素含量(例如维生素A)，
·增加的锌含量，
·增加的铁含量，
·增加的蛋白质含量(例如可溶性蛋白)，
·改善的籽粒硬度(更低的断裂力)。
根据本发明的一个实施方案，对于小麦而言，优选的品质参数为：
·增加的类胡萝卜素含量(例如维生素A)，
·增加的锌含量，
·增加的铁含量，
·增加的蛋白质含量(例如可溶性蛋白)，
·改善的籽粒硬度(更低的断裂力)。
根据本发明的一个实施方案，对于玉米/玉蜀黍(maize)而言，优选 的品质参数为：
·增加的类胡萝卜素含量(例如维生素A)，
·增加的锌含量，
·增加的铁含量，
·增加的蛋白质含量(例如可溶性蛋白)，
·增加的油含量，
·增加的淀粉含量。
根据本发明的一个实施方案，对于苹果而言，优选的品质参数为：
·增加的锌含量，
·增加的钙含量，
·更强烈的色泽，
·改善的质地，
·更高的硬度，
·更高的白利糖度值。
根据本发明的一个实施方案，对于柑桔类植物而言，优选的品质参数 为：
·增加的锌含量，
·增加的维生素C含量，
·更强烈的色泽，
·改善的质地，
·更高的硬度，
·更高的白利糖度值。
根据本发明的一个实施方案，对于番茄、黄瓜和胡椒而言，优选的品 质参数为：
·更好的大小均匀性，
·更强烈的色泽，
·改进的质地，
·更高的硬度，
·更高的白利糖度值，
·增强的根系生长，
·增加的锌含量，
·增加的钙含量。
根据本发明的一个实施方案，对于葡萄/藤本植物而言，优选的品质 参数为：
·更高的花青素含量，
·更高的酸度，
·更高的锌含量，
·更高的白利糖度值，
·更高的硬度，
·更强烈的色泽，
·改善的质地，
·更好的口感。
本发明还涉及组合物，该组合物包括有效量且优选非植物毒性量的本 发明的活性化合物结合物。这些组合物也适用于防治不需要的微生物，尤 其是不需要的真菌和细菌。所述优选的杀真菌组合物包括农业上适宜的助 剂、溶剂、载体、表面活性剂和/或填充剂。
在本发明的上下文中，“有害微生物的防治”是指与未处理的植物相 比，在有害微生物侵染方面的减少，其以杀真菌功效量度，侵染优选减少 25-50%(与未处理的植物相比)，更优选减少40-79%(与未处理的植物 相比);甚至更优选地，有害微生物的侵染几乎完全或彻底地被抑制 (80-100%)。有害微生物的防治可以是治疗性的，即用于处理已侵染的 植物;或保护性的，即用于保护尚未被侵染的植物。
“有效但无植物毒性的量”是指足以以令人满意的方式防治植物的真 菌病害或者完全根除真菌病害的量，且该量同时不会引起任何显著的植物 毒性症状。通常，该施用率可在相对宽的范围内变化。这取决于几个因素， 例如取决于待防治的真菌、植物、气候条件和本发明的活性化合物结合物 的组分。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包括：
(i)本发明的活性化合物结合物，优选如在上述优选实施方案之一 中所定义的，
(ii)水，和
(iii)一种或多种佐剂(助剂)，优选一种或多种选自有机溶剂、表 面活性剂、无机载体、有机载体和其他填充剂的佐剂。
优选地，本发明的组合物包括以下的总量：
(i)本发明的活性化合物结合物，优选如在上述优选实施方案之一 中所定义的，其在0.05-0.5重量%的范围内，优选在0.1-0.3重量%的范 围内，
和/或
(ii)水，其在70-99.9重量%的范围内，优选在85-99.8重量%的范 围内，
各自基于所述组合物的总重量计。
更优选地，本发明的组合物包括以下的总量：
(i)本发明的活性化合物结合物，优选如在上述优选实施方案之一 中所定义的，其在0.1-0.3重量%的范围内，
和/或
(ii)水，其在70-99.9重量%的范围内，优选在85-99.8重量%的范 围内，
各自基于所述组合物的总重量计。
本发明的组合物可优选通过以下方法得到，该方法的特征在于包括以 下步骤：
(i)提供(A)丙森锌，(B1)一种或多种含有硼(B)的化合物， 和(B2)一种或多种含有锰(Mn)的化合物，
或
提供本发明的活性化合物结合物，优选如在优选实施方案之一中所定 义的，
(ii)提供水，
(iii)提供一种或多种佐剂(助剂)，优选一种或多种选自有机溶剂、 表面活性剂、无机载体、有机载体和其他填充剂的佐剂，
并混合组分(i)至(iii)，从而得到本发明的组合物。
合适的有机溶剂包括通常用于制剂目的的所有极性和非极性有机溶 剂。优选地，所述溶剂选自酮，例如甲基异丁基酮和环己酮;酰胺，例如 二甲基甲酰胺和链烷羧酸酰胺，例如N,N-二甲基癸酰胺和N,N-二甲基辛 酰胺;还有环状溶剂，例如N-甲基吡咯烷酮、N-辛基吡咯烷酮、N-十二 烷基吡咯烷酮、N-辛基己内酰胺、N-十二烷基己内酰胺和丁内酯;还有 强极性溶剂，例如二甲基亚砜;和芳族烃，例如二甲苯、SolvessoTM、矿物 油(例如石油溶剂油、石油、烷基苯和锭子油);以及酯，例如丙二醇单 甲醚乙酸酯、己二酸二丁酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、柠檬酸三正丁酯和邻 苯二甲酸二正丁酯;以及醇类，例如苄醇和1-甲氧基-2-丙醇。
根据本发明，载体是天然的或合成的、有机的或无机的物质，为了获 得更好的适用性，尤其是适用于施用于植物或植物部位或种子，将活性成 分与载体混合或者结合。所述载体，可为固体或液体，通常是惰性的并且 应该适用于农业。
有用的固体或液体载体包括：例如铵盐和天然岩石粉，如高岭土、粘 土、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土;和合成岩石粉，如 细碎二氧化硅、氧化铝和天然或合成硅酸盐;树脂;蜡;固体肥料;水; 醇类(特别是丁醇);有机溶剂;矿物油和植物油，以及它们的衍生物。 同样可以使用这些载体的混合物。
合适的固体填料和载体包括平均粒径在0.005至20μm之间，优选在 0.02至10μm之间的无机颗粒，例如碳酸盐、硅酸盐、硫酸盐和氧化物， 例如硫酸铵、磷酸铵、尿素、碳酸钙、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、氧化铝、 二氧化硅，所谓的细粒二氧化硅、二氧化硅凝胶、天然或合成的硅酸盐和 铝硅酸盐和植物产物，像谷粉、木粉/锯末和纤维素粉末。
用于颗粒剂的有用的固体载体包括：例如粉碎并分级的天然岩石(例 如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石)以及无机和有机粉末的合成 颗粒，还有有机物质(例如木屑、椰子壳、玉米穗轴和烟草茎)的颗粒。
有用的液化气体填充剂或载体是那些在标准温度和标准压力下是气 态的液体，例如气溶胶推进剂如卤代烃，以及丁烷、丙烷、氮气和二氧化 碳。
在制剂中，可以使用增粘剂，如羧甲基纤维素，以及天然和合成的以 粉末、颗粒或胶乳形式的聚合物(例如阿拉伯胶、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯 酯)，或其他天然磷脂(如脑磷脂和卵磷脂)和合成的磷脂。其他的添加 剂可以是矿物油和植物油。
也可以采用有机溶剂作为助溶剂。有用的液体溶剂基本上是：芳烃， 如二甲苯、甲苯或烷基萘;氯代芳烃和氯代脂族烃，如氯苯、氯乙烯或二 氯甲烷;脂族烃例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分、矿物油和植物油; 醇类，例如丁醇或乙二醇及它们的醚和酯;酮类如丙酮、甲基乙基酮、甲 基异丁基酮或环己酮;和/或强极性溶剂，如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
本发明的活性化合物结合物还可包含其他组分，例如表面活性剂。有 用的表面活性剂是具有离子或非离子性质的乳化剂和/或泡沫形成剂、分 散剂或润湿剂，或这些表面活性剂的混合物。这些表面活性剂的实例是聚 丙烯酸的盐，木素磺酸的盐，苯酚磺酸的盐或萘磺酸的盐，环氧乙烷与脂 肪醇或脂肪酸或脂肪胺的缩聚物，取代的苯酚(优选烷基苯酚或芳基苯酚)， 磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(优选烷基牛磺酸盐)，聚乙氧基化醇 类或酚类的磷酸酯，多元醇的脂肪酯，以及含有硫酸根、磺酸根和磷酸根 的化合物的衍生物(例如烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、 芳基磺酸盐)，蛋白质水解产物，木素磺酸盐废液和甲基纤维素。如果所 述活性组分之一和/或所述惰性载体之一是不溶于水的且当施用是在水中 进行时，那么表面活性剂的存在是必要的。表面活性剂的比例优选在本发 明的组合物的5至40重量%的范围内。
合适的表面活性剂(佐剂、乳化剂、分散剂、保护性胶体、润湿剂和 粘合剂)包括所有常见的离子型和非离子型物质，例如乙氧基化的壬 基酚，直链或支链醇的聚亚烷基二醇醚，烷基苯酚与环氧乙烷和/或环氧 丙烷的反应产物，脂肪酸胺与环氧乙烷和/或环氧丙烷的反应产物，还有 脂肪酸酯，烷基磺酸盐，烷基硫酸盐，烷基醚硫酸盐，烷基乙醚磷酸盐， 芳基硫酸盐，乙氧基化芳基烷基酚类(例如三苯乙烯基苯酚-乙氧基化物)， 还有乙氧基化和丙氧基化的芳基烷基酚类(像硫酸化或磷酸化芳基烷基酚 类-乙氧基化物以及-乙氧基-和丙氧基化物)。其他实例是天然和合成的水 溶性聚合物，例如木质素磺酸盐、明胶、阿拉伯树胶、磷脂、淀粉、疏水 改性淀粉和纤维素衍生物，尤其是纤维素酯和纤维素醚，还有聚乙烯醇、 聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和(甲基)丙 烯酸与(甲基)丙烯酸酯的共聚合产物，以及用碱金属氢氧化物中和的甲 基丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚合产物，还有任选取代的萘磺酸盐与甲醛 的缩合产物。
可以使用着色剂，如无机色素，例如氧化铁、氧化钛和普鲁士蓝，以 及有机染料，例如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料。
可存在于制剂中的消泡剂包括例如硅氧烷乳液、长链醇、脂肪酸和它 们的盐，以及氟代有机物质及其混合物。
增稠剂的实例是多糖，例如黄原胶或硅酸镁铝;硅酸盐，例如绿坡缕 石、膨润土以及细粒二氧化硅。
如果合适，也可存在其他额外的组分，例如保护胶体、粘合剂、胶粘 剂、增稠剂、触变物质、渗透剂、稳定剂、螯合剂、络合剂。通常，活性 成分可与通常用于制剂目的的任何固体或液体添加剂相结合。
本发明的活性化合物结合物或组合物可以其本身使用，或者根据它们 特定的物理和/或化学性质，以它们的制剂或由它们制备的使用形式来使 用，例如气雾剂、胶囊悬浮液、冷-雾化浓缩剂、暖-雾化浓缩剂、包覆的 颗粒剂、细粒剂、用于种子处理的可流动浓缩剂、即用溶液、粉剂、乳油、 油包水乳剂、水包油乳剂、大颗粒、微粒、油可分散性粉剂、油可混溶的 可流动浓缩剂、油可混溶液体、气体(在压力下)、气体发生产品、泡沫 剂、糊剂、农药包衣的种子、悬浮浓缩剂、悬浮乳液浓缩剂、可溶性浓缩 剂、悬浮液、可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉剂和颗粒剂、水溶性性和水分 散性颗粒剂或片剂、用于种子处理的水溶性和水分散性粉剂、可湿性粉剂、 用活性成分浸渍的天然产物和合成物质，且还有用于种子的于聚合物质于 包衣材料中的微型胶囊，且还有ULV冷-雾化和暖-雾化制剂。
本发明的活性化合物结合物不仅包括已经即用且可通过合适的装置 施用于植物或种子的制剂，还包括在使用之前必须用水稀释的商品化的浓 缩剂。常规应用为例如在水中稀释且随后喷洒所得的喷洒溶液、在油中稀 释后施用、不稀释直接施用、颗粒剂的种子处理或土壤施用。
所提到的制剂可以本身已知的方式制备，例如通过将活性成分与至少 一种常规的填充剂、溶剂或稀释剂、佐剂、乳化剂、分散剂、和/或粘合 剂或固定剂、润湿剂、防水剂，如果合适，还有干燥剂和UV稳定剂，以 及如果合适，还有着色剂和色素、消泡剂、防腐剂、无机和有机增稠剂、 粘合剂、赤霉素以及其他加工助剂和水混合来制备。根据待制备的制剂类 型，其他加工步骤是必要的，例如，湿法研磨、干法研磨和造粒。
本发明的活性化合物结合物可以本身形式存在或以它们(市售可得) 的制剂形式存在和以由这些制剂作为与其他(已知)的活性成分的混合物 而制备的使用形式存在，所述其他活性成分例如杀虫剂、引诱剂、灭菌剂、 杀细菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、生长调节剂、除草剂、肥料、 安全剂和/或化学信息素。
本发明的采用活性成分或组合物对植物和植物部位进行的处理是直 接进行的或通过常规处理方法作用于它们的环境、生境或贮存空间来进行， 所述常规处理方法例如通过浸渍、喷雾、雾化、浇灌、蒸发、撒粉、弥雾、 撒施、发泡、涂覆、涂布、浇水(浸渍)、滴灌，并且对于繁殖材料(特 别是对于种子)，还通过干种子处理、湿种子处理、浆液处理、结壳作用、 用一层或多层包衣涂覆等。还可通过超低容量方法施用活性成分或者将活 性成分制剂或活性成分自身注入到土壤中。
本发明的活性化合物结合物或组合物显示出有效的杀微生物活性并 可在作物保护和在材料保护中用于防治不需要的微生物，如真菌和细菌。
本发明还涉及用于防治不需要的微生物的方法，其特征在于将本发明 的活性成分结合物或组合物施加于植物病原真菌、植物病原细菌和/或其 生境。
杀真菌剂可用于在作物保护中防治植物病原真菌。杀真菌剂的特征在 于具有对抗广谱植物病原真菌的显著功效，所述植物病原真菌包括土壤传 播的病原体，特别是根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、卵菌纲 (Peronosporomycetes)(同义词：卵菌纲(Oomycetes))、壶菌纲 (Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲 (Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲 (Deuteromycetes)(同义词：半知菌纲(Fungiimperfecti))的成员。 一些杀真菌剂具有内吸活性且可作为叶片、种子包衣或土壤杀真菌剂用于 植物保护中。此外，它们适合用于防治真菌，特别是侵扰植物的木材或根 部的真菌。
杀细菌剂可用于在作物保护中防治假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、 根瘤菌科(Rhizobiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆 菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)。
可根据本发明处理的真菌性病害的病原体的非限制性实例包括：
由白粉病病原体引起的病害，所述白粉病病原体例如，布氏白粉菌 属(Blumeria)种，例如禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminis);叉丝 单囊壳属(Podosphaera)种,例如苹果白粉菌(Podosphaeraleucotricha); 单丝壳属(Sphaerotheca)种,例如黄瓜白粉菌(Sphaerothecafuliginea); 钩丝壳属(Uncinula)种,例如葡萄白粉菌(Uncinulanecator);
由锈病病原体引发的病害，所述锈病病原体例如，裸孢子囊菌属 (Gymnosporangium)种，例如梨锈菌(Gymnosporangiumsabinae); 驼孢锈菌属(Hemileia)种，例如咖啡锈菌(Hemileiavastatrix);层锈 菌属(Phakopsora)种，例如豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和 山马蝗层锈菌(Phakopsorameibomiae);柄锈菌属(Puccinia)种， 例如小麦隐匿柄锈菌(Pucciniarecondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、 禾柄锈菌(P.graminis)或小麦条锈病菌(P.striiformis);单孢锈菌 属(Uromyces)种，例如疣顶单孢锈菌(Uromycesappendiculatus);
由卵菌纲(Oomycetes)病原体引起的病害，所述病原体例如白锈菌 属(Albugo)种，例如白锈病菌(Albugocandida);盘梗霉属(Bremia) 种，例如莴苣盘梗霉菌(Bremialactcae);斜尖状孢子菌属(Peronospora) 种，例如豌豆霜霉(Peronosporapisi)或者芸苔霜霉(P.brassicae); 疫霉属(Phytophthora)种，例如马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans); 单轴霉属(Plasmopara)种，例如葡萄单轴霉(Plasmoparaviticola); 假霜霉属(Pseudoperonospora)种，例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或者黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis);腐霉菌属 (Pythium)种，例如终极腐霉菌(Pythiumultimum);
由例如以下病原体引起的叶斑病和叶萎蔫病：链格孢属(Alternaria) 种，例如索兰尼链格孢(Alternariasolani);尾孢属(Cercospora)种， 例如病原菌甜菜尾孢菌(Cercosporabeticola);枝孢属(Cladiosporium) 种，例如黄瓜叶霉病菌(Cladiosporiumcucumerinum);旋孢腔菌属 (Cochliobolus)种，例如禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)(分生孢 子形式：德氏霉属(Drechslera)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium))、 水稻旋孢腔菌(Cochliobolusmiyabeanus);毛盘孢属(Colletotrichum) 种，例如豆刺盘孢菌(Colletotrichumlindemuthanium);环黑星霉属 (Cycloconium)种，例如油橄榄孔雀斑菌(Cycloconiumoleaginum); 间座壳属(Diaporthe)种，例如柑橘褐色蒂腐病菌(Diaporthecitri); 痂囊腔菌属(Elsinoe)种，例如疮痂病的柑桔痂囊腔菌(Elsinoefawcettii); 盘长孢属(Gloeosporium)种，例如桃树腐烂病菌(Gloeosporium laeticolor);小丛壳属(Glomerella)种，例如炭疽病菌(Glomerella cingulata);球座菌属(Guignardia)种，例如葡萄球座菌 (Guignardiabidwelli);小球腔菌属(Leptosphaeria)种，例如十字花科 小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum);间座壳属(Magnaporthe)种，例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea);微结节菌属(Microdochium)种，例如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale);球腔菌属(Mycosphaerella)种，例如禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、花生球腔菌(M.arachidicola)和斐济球腔菌(M.fijiensis); 球腔菌属(Phaeosphaeria)种，例如小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum);核腔菌属(Pyrenophora)种，例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratriticirepentis);柱隔孢属 (Ramularia)种，例如柱隔孢叶斑病菌(Ramulariacollo-cygni)、白 斑柱隔孢(Ramulariaareola);喙孢属(Rhynchosporium)种，例如大 麦云纹病菌(Rhynchosporiumsecalis);壳针孢属(Septoria)种，例 如芹菜壳针孢菌(Septoriaapii)、番茄壳针孢菌(Septorialycopersii); 核瑚菌属(Typhula)种，例如肉孢核瑚菌(Typhulaincarnata);黑星 菌属(Venturia)种，例如苹果黑星菌(Venturiainaequalis);
由例如以下病原体引起的根和茎的病害：伏革菌属(Corticium)种， 例如禾伏革菌(Corticiumgraminearum);镰刀菌属(Fusarium)种， 例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum);禾顶囊壳属(Gaeumannomyces) 种，例如小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis);丝核菌属 (Rhizoctonia)种，诸如，例如立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani);例如由 稻帚枝霉(Sarocladiumoryzae)引起的帚枝霉属(Sarocladium)病害; 例如由小球菌核菌(Sclerotiumoryzae)引起的小核菌属(Sclerotium) 病害;Tapesia属种，例如Tapesiaacuformis;根串珠霉属(Thielaviopsis) 种，例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola);
由例如以下病原体引起的肉穗花序和圆锥花序病害(包括玉米穗 轴)：链格孢属(Alternaria)种，例如链格孢属种(Alternariaspp.); 曲霉菌属(Aspergillus)种，例如黄曲霉菌(Aspergillusflavus);分枝 孢子菌属(Cladosporium)种，例如支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides);麦角菌属(Claviceps)种，例如紫色麦角菌(Claviceps purpurea);镰刀菌属(Fusarium)种，例如大刀镰刀菌(Fusarium culmorum);赤霉菌(Gibberella)种，例如玉米赤霉(Gibberellazeae); 小画线壳属(Monographella)种，例如雪腐小画线壳(Monographella nivalis);壳针孢属(Septoria)种，例如小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum);
由黑粉菌引起的病害，所述黑粉菌例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca) 种，例如玉米丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana);腥黑粉菌属(Tilletia) 种，例如小麦腥黑穗病菌(Tilletiacaries)、小麦矮腥黑穗病菌(T. controversa);条黑粉菌属(Urocystis)种，例如黑麦杆黑穗病菌(Urocystis occulta);黑粉菌属(Ustilago)种，例如裸黑粉菌(Ustilagonuda)、 散黑穗病菌(U.nudatritici);
由例如以下病原体引起的果实腐烂：曲霉菌属(Aspergillus)种， 例如黄曲霉菌(Aspergillusflavus);葡萄孢属(Botrytis)种，例如灰 霉病菌(Botrytiscinerea);青霉属(Penicillium)种，例如扩展青霉菌 (Penicilliumexpansum)、产紫青霉(P.purpurogenum);核盘菌属 (Sclerotinia)种，例如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum);轮枝孢属 (Verticilium)种，例如黑白轮枝孢(Verticiliumalboatrum);
由例如以下病原体引起的种传的和土传的腐败、发霉、萎蔫、腐烂和 猝倒病害：链格孢属(Alternaria)种，例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起的;丝囊霉属(Aphanomyces)种，例如由根腐丝囊 霉(Aphanomyceseuteiches)引起的;壳二孢属(Ascochyta)种，例如 由晶状体壳二孢(Ascochytalentis)引起的;曲霉菌属(Aspergillus)种， 例如由黄曲霉菌(Aspergillusflavus)引起的;分枝孢子菌属 (Cladosporium)种，例如由分支胞子菌(Cladosporiumherbarum)引 起的;旋孢腔菌(Cochliobolus)种，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)引起的;(分生孢子形式：德氏霉属(Drechslera)、双极霉属 (Bipolaris)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium));毛盘孢属 (Colletotrichum)种，例如由球炭疽菌(Colletotrichumcoccodes)引 起的;镰刀菌属(Fusarium)种，例如由镰刀菌属(Fusariumculmorum) 引起的;赤霉菌(Gibberella)属种，例如由玉米赤霉(Gibberellazeae) 引起的;亚大茎点霉属(Macrophomina)种，例如由菜豆壳球孢菌 (Macrophominaphaseolina)引起的;小画线壳属(Monographella) 种，例如由雪腐小画线壳(Monographellanivalis)引起的;青霉属 (Penicillium)种，例如由扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)引起 的;茎点霉属(Phoma)种，例如由病原黑胫茎点霉(Phomalingam) 引起的;拟茎点霉属(Phomopsis)种，例如由大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的;疫霉属(Phytophthora)种，例如由恶疫霉(Phytophthora cactorum)引起的;核腔菌属(Pyrenophora)种，例如由麦类核腔菌 (Pyrenophoragraminea)引起的;梨孢属(Pyricularia)种，例如由稻 瘟病菌(Pyriculariaoryzae)引起的;腐霉菌属(Pythium)种，例如由 终极腐霉(Pythiumultimum)引起的;丝核菌属(Rhizoctonia)种，例 如由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的;根霉菌属(Rhizopus)种， 例如由稻根霉菌(Rhizopusoryzae)引起的;小菌核属(Sclerotium)种， 例如由齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)引起的;壳针孢属(Septoria) 种，例如由小麦颖枯壳针孢菌(Septorianodorum)引起的;核瑚菌属 (Typhula)种，例如由肉孢核瑚菌(Typhulaincarnata)引起的;轮枝 孢属(Verticillium)种，例如由棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)引 起的;
由例如以下病原体引起的癌症、虫瘿和扫帚病(witches’broom) 病害：丛赤壳属(Nectria)种，例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectriagalligena);
由例如以下病原体引起的萎蔫病害：链核盘菌属(Monilinia)种， 例如核果链核盘菌(Monilinialaxa);
由例如以下病原体引起的叶疱病或卷叶病病害，外担子菌属 (Exobasidium)种，例如坏损外担菌(Exobasidiumvexans);
外囊菌属(Taphrina)种，例如畸形外囊菌(Taphrinadeformans);
木本植物的退行性病害：由例如根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremoniumaleophilium和Fomitiporia mediterranea引起的Esca病害;由例如侧弯孢壳属(Eutypalata)引起 的葡萄顶枯病(Eutypadyeback);由例如岛灵芝(Ganodermaboninense) 引起的灵芝属(Ganoderma)病害;由例如木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌属(Rigidoporus)病害;
由例如以下病原体引起的花和种子的病害：葡萄孢属(Botrytis) 种，例如灰葡萄孢(Botrytiscinerea);
由例如以下病原体引起的植物块茎病害：丝核菌属(Rhizoctonia) 种，例如立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani);长蠕孢菌属 (Helminthosporium)种，例如茄病长蠕孢(Helminthosporiumsolani);
由例如以下病原体引起的根肿病病害：根肿菌属(Plasmodiophora) 种，例如芸薹根肿菌(Plamodiophorabrassicae);
由细菌性病原体引起的病害，所述细菌性病原体例如，黄单胞 (Xanthomonas)种，例如稻黄单胞菌白叶枯变种(Xanthomonas campestrispv.oryzae);假单胞(Pseudomonas)种，例如丁香假单胞 菌黄瓜致病变种(pseudomonassyringaepv.lachrymans);欧文氏 (Erwinia)种，例如噬淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)。
优选可防治以下大豆病害：
由例如以下病原体引起的位于叶、茎、荚和种子上的真菌病害，如 链格孢属叶斑病(Alternarialeafspot)(Alternariaspec.atrans tenuissima)、炭疽病(Colletotrichumgloeosporoidesdematiumvar. truncatum)、褐斑病(大豆壳针孢(Septoriaglycines))、尾孢属叶 斑病和叶枯病(Cercosporaleafspotandblight)(菊池尾孢(Cercospora kikuchii))、笄霉属(Choanephora)叶枯病(漏斗笄霉(Choanephora infundibuliferatrispora(Syn.))、dactuliophora叶斑病(Dactuliophora glycines)、霜霉病(downymildew)(东北霜霉(Peronospora manshurica))、德氏霉属(drechslera)枯萎病(Drechsleraglycini)、 蛙眼病叶斑病(大豆尾孢(Cercosporasojina))、小光壳属 (leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulinatrifolii))、 叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllostictasojaecola))、 荚和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(Phomopsissojae));白粉病(扩散叉丝 壳(Microsphaeradiffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病 (Pyrenochaetaglycines)、丝核菌属地上部分、叶枯病和立枯病(立 枯丝核菌(Rhizoctoniasolani))、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌(Phakopsorameibomiae))、痂病(大豆 痂圆孢(Sphacelomaglycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯病 (匍柄霉(Stemphyliumbotryosum))、靶斑病(targetspot)(山扁 豆生棒孢(Corynesporacassiicola))。
由例如以下病原体引起的根部和茎基部的真菌病害，如黑根腐病 (blackrootrot)(Calonectriacrotalariae)、炭腐病(菜豆生壳球孢 (Macrophominaphaseolina))、镰孢属枯萎病或萎蔫、根腐病以及荚 和根颈腐烂((尖镰孢(Fusariumoxysporum)、直喙镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusariumsemitectum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscusterrestris)、新赤 壳属(neocosmospora)(侵菅新赤壳(Neocosmopsporavasinfecta))、 荚和茎枯病(菜豆间座壳(Diaporthephaseolorum))、茎溃疡(大豆北 方茎溃疡病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivora))、疫霉属腐病(大 雄疫霉(Phytophthoramegasperma))、褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌 (Phialophoragregata))、腐霉菌属腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉 (Pythiumdebaryanum)、群结腐霉(Pythiummyriotylum)、终极腐霉 (Pythiumultimum))、丝核菌属根腐病、茎腐和猝倒病(立枯丝核菌 (Rhizoctoniasolani))、核盘菌茎腐病(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、核盘菌白绢病(Sclerotiniarolfsii)、根串珠霉属根腐病 (根串珠霉(Thielaviopsisbasicola))。
本发明的活性化合物结合物或组合物可用于治疗性或保护性/预防性 地防治植物致病真菌。因此，本发明还涉及通过使用本发明的活性化合物 结合物或组合物而防治植物致病真菌的治疗性和保护性方法，其中将本发 明的活性化合物结合物或组合物施加于种子、植物或植物部位、果实或植 物生长的土壤。
所述活性成分在防治植物病害所需的浓度下具有良好的植物耐受性， 这一事实使得其能够处理植物的地上部分、繁殖的根状茎和种子以及土壤。
根据本发明可处理所有的植物和植物部位。植物意指所有的植物和植 属种群，例如需要和不需要的野生植物、栽培种和植物变种(无论是否受 植物品种或植物育种者的权利保护)。栽培种和植物变种可以是通过常规 的繁殖和育种方法或通过生物工程和基因工程方法而获得的植物，所述常 规的繁殖和育种方法可通过一种或多种生物技术方法来辅助或补充，例如 通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记物。 植物部位意指植物的所有的地上和地下部分和器官，例如芽、叶、花和根， 据此列出例如叶、针叶、茎、枝、花、子实体、果实和种子以及根、球茎 和根茎。作物以及无性和有性繁殖材料，例如插条、球茎、根茎、匍匐茎 和种子也属于植物部位。
本发明的活性化合物结合物或组合物具有有利的恒温动物毒性且可 被环境完全耐受，适用于保护植物和植物器官，用于提高采收产量，改善 采收材料的品质。优选地将它们用作作物保护组合物。它们对一般敏感及 具有抗性的物种具有活性，并且对所有的或一些发育阶段具有活性。
本发明的活性化合物结合物也适用于保护在农业、温室、森林或园艺 和葡萄栽培中使用的任何植物品种的种子。
可依照本发明进行处理的植物包括以下主要作物植物：玉米、大豆、 苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属(Brassica)油料种子(例如欧洲油菜(Brassica napus)(例如芸苔、油菜籽)、芜青(Brassicarapa)、芥菜(B.juncea) (例如(田)芥子)和埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata))、槟榔科种 (Arecaceaesp.)(例如油棕，椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、 黑麦、大麦、粟和高粱、小黑麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及来自 各种植物分类单位的各种水果和蔬菜，例如蔷薇科种(Rosaceaesp.)(如 仁果类水果(如苹果和梨)，还有核果类水果(如杏、樱桃、扁桃、李子 和桃)，以及浆果类水果(如草莓、覆盆子、红加仑和黑茶藨子以及醋粟))、 茶藨子科种(Ribesioidaesp.)、胡桃科种(Juglandaceaesp.)、桦木科种 (Betulaceaesp.)、漆树科种(Anacardiaceaesp.)、壳斗科种(Fagaceaesp.)、 桑科种(Moraceaesp.)、木犀科种(Oleaceaesp.)(例如橄榄)、猕猴桃 科种(Actinidaceaesp.)、樟科种(Lauraceaesp.)(例如油梨、桂皮、樟 脑)、芭蕉科种(Musaceaesp.)(例如香蕉树和香蕉种植园)、茜草科种 (Rubiaceaesp.)(例如咖啡)、山茶科种(Theaceaesp.)(例如茶)、梧桐 科种(Sterculiceaesp.)、芸香科种(Rutaceaesp.)(例如柠檬、橙、桔和葡 萄柚);茄科种(Solanaceaesp.)(例如，番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、 茄子、烟草)、百合科种(Liliaceaesp.)、菊科种(Compositaesp.)(例如莴 苣、朝鲜蓟和菊苣-包括根菊苣、菊苣或普通菊苣)、伞形科种 (Umbelliferaesp.)(例如胡萝卜、荷兰芹、芹菜和根芹菜)、葫芦科种 (Cucurbitaceaesp.)(例如黄瓜-包括腌食用小黄瓜、西葫芦、西瓜、 葫芦和木瓜)、葱科种(Alliaceaesp.)(例如韭、洋葱)、十字花科种 (Cruciferaesp.)(例如白甘蓝、红甘蓝、青花菜、花椰菜、抱子甘蓝、 小白菜、球茎甘蓝、小萝卜、山葵、水芹和大白菜)、豆科种(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆、扁豆和菜豆–例如刀豆和蚕豆)、藜科种 (Chenopodiaceaesp.)(例如唐莴苣、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻 科种(Linaceaesp.)(例如大麻)、大麻科种(Cannabeaceasp.)(例如 印度大麻)、锦葵科种(Malvaceaesp.)(例如黄秋葵、可可)、罂粟科 (Papaveraceae)(例如罂粟)、百合科(Asparagaceae)(例如芦笋);园艺 和森林中的有用植物和观赏植物，包括草地、草坪、牧草和甜叶菊 (Steviarebaudiana);以及这些植物各自的基因修饰型。
本发明的活性化合物结合物还表现出在植物中有效的强化作用。因此， 它们可用于调动植物的防御系统以抵抗来自不期望的微生物的侵袭。
植物强化(抗性诱导)物质在本上下文中应理解为意指能够以这样的 方式激活植物防御体系的那些物质：当随后接种不期望的微生物时，经处 理的植株显示出对这些微生物的高度抗性。
本发明的活性化合物结合物适合用于提高作物的产量。
此外，在本发明的上下文中，植物生理学效应包括以下内容：
非生物胁迫的耐受性，包括温度耐受性，干旱耐受性和干旱胁迫后的 恢复，水利用效率(对应于减少的水消耗)，洪水耐受性，臭氧胁迫和紫 外线耐受性，对像重金属、盐类、农药(安全剂)等化学品的耐受性。
生物胁迫的耐受性，包括增加的真菌抗性和增加的对抗线虫、病毒和 细菌的抗性。在本发明的上下文中，生物胁迫耐受性优选包括提高的真菌 抗性以及增加的对抗线虫的抗性。
提高的植物活力(包括植物健康/植物品质和种子活力)，减少的立 根失败，改善的外观，增强的恢复，改善的绿化效果和提高的光合效率。
对植物激素和/或功能酶的作用。
对生长调节剂(促进剂)的作用，包括更早的萌芽，更好的出苗，更 发达的根系和/或改善的根系生长，增强的分蘖能力，更高效的分蘖，更 早开花，增加的株高和/或生物量，缩短的茎，在枝条生长、核/穗数目、 每平方米的穗的数目、匍匐茎的数目和/或花数目方面的改进，提高的采 收指数，更大的叶片，更少的死亡基生叶，改进的叶序，更早成熟/更早 的果实结果，均匀的成熟，提高的灌浆持续时间，更好的果品光洁度，更 大的水果/蔬菜尺寸，发芽抗性和减少的倒伏。
增加的产量，是指每公顷的总生物量、每公顷的产量、核/果实重、 种子大小和/或百升重量以及改进的产物品质，包括：
改善的加工性，涉及大小分布(核、果实等)、均匀的成熟、谷物水 分、更好的制粉，更好的酿酒，更好的酿造，增加的汁液产率、可采收性、 可消化性、沉降值、降落值、荚果稳定性、储存稳定性，改进的纤维长度 /强度/均匀性，增加的青贮饲料喂养的动物的牛奶和/或肉的品质，适用于 烹饪和油炸;
还包括改进的可销售性，涉及改进的果实/谷物的品质、大小分布(核、 果实等)、增加的储存/保质期、硬度/柔软性、味道(香气、质地等)、 等级(大小，形状、浆果数等)、每一串的浆果/水果数目、脆度、新鲜 度、用蜡覆盖度、生理病症的频率、颜色等;
还包括增加的期望成分，例如蛋白质含量、脂肪酸、油含量、油品质、 氨基酸组成、糖含量、酸含量(pH)、糖/酸比率(白利糖度)、多酚、 淀粉含量、营养素状况、谷蛋白含量/指标、能量含量、味道等;
并且还包括降低的不期望的成分，例如更少的真菌霉素，更少的黄曲 霉毒素、土臭味素水平、酚的香气、漆酶、多酚氧化酶和过氧化物酶、硝 酸盐含量等。
可持续农业，包括营养素利用效率，尤其是氮(N)-利用效率、磷(P) -利用效率，水分利用效率，提高蒸腾作用、呼吸和/或CO2同化速率，更 好的结瘤，改善的钙代谢等。
延迟的衰老，包括显现的植物生理学的改善，例如，在更长的籽 粒充实阶段中，导致更高的产量、植物的绿叶着色持续时间更长，并 且因此还包括颜色(绿化)、水含量、干燥度等。因此，在本发明的上 下文中，己发现具体的本发明的活性化合物结合物的施用使得可以延 长绿叶面积持续时间，其延迟植物的成熟(老化)。对农民的主要益处 是更长的籽粒充实阶段，其导致更高的产量。对农民的另一益处是收 获时间上更大的灵活性。
其中“沉降值”是蛋白质品质的量度，根据Zeleny(Zeleny值)， 沉降值描述在标准的时间间隔期间悬浮在乳酸溶液中的面粉沉降的程 度。这被视为烘焙质量的量度。面粉的谷蛋白部分在乳酸溶液中的溶 胀影响面粉悬浮液的沉降速率。更高的谷蛋白含量和更好的谷蛋白品 质都导致更慢的沉降和更高的Zeleny测试值。面粉的沉降值取决于小 麦蛋白组成，且主要与蛋白质含量、小麦硬度以及平锅和灶台的体积 相关。与SDS沉降体积相比，面包体积和Zeleny沉降体积之间更强的 关联可能是由于蛋白含量影响体积和Zeleny值二者所致(CzechJ. FoodSci.第21卷，第3期：91–96，2000)。
此外，如本文所提及的“降落数值”是谷类——特别是小麦—— 的烘焙质量的量度。降落数值测试表明，可能己经发生芽损伤。这意 味着小麦仁中的淀粉部分的物理性质己发生了变化。其中，降落数值 仪器通过测量面粉和水面糊对降落柱塞的阻力而分析粘度。其发生的 时间(以秒为单位)称为降落数值。降落数值结果被记录为小麦或面 粉样品中酶活性的指数，且结果以时间——秒表示。高的降落数值(例 如，高于300秒)表明最小的酶活性和品质优良的小麦或面粉。低的 降落数值(例如，低于250秒)表明显著的酶活性和芽受损的小麦或 面粉。
术语“更发达的根系”/“改善的根生长”是指更长的根系、更深 的根生长、更快的根生长、更高的根干重/鲜重、更高的根体积、更大 的根表面积、更大的根直径、更高的根稳定性、更多的根分枝、更高 数量的根毛和/或更多的根尖，并且可通过采用合适的方法和图像分析 程序(例如WinRhiz)分析根构造而进行测量。
术语“作物水利用效率”在技术上是指所消耗的每单位水产生的 农业量，在经济上是指所消耗的每单位水体积产生的产物的值，且可 例如以每公顷的收率、植物的生物量、千核质量和每平方米穗的数量 的方式进行测量。
术语“氮利用效率”在技术上是指所消耗的每单位氮产生的农业 量，在经济上是指所消耗的每单位氮产生的产物的值，反映吸收和利 用效率。
绿化的改善/改善的颜色和改善的光合效率以及衰老的延迟可采用 众所周知的技术如HandyPea系统(Hansatech)进行测量。Fv/Fm是 广泛用于指示光合系统II(PSII)的最大量子效率的参数。该参数被 广泛认为是植物光合性能的选择性指征，采用健康样品通常可实现约 0.85的最大Fv/Fm值。如果样品己暴露于一些类型的生物或非生物胁 迫因素(所述因素己降低了PSII内的能量的光化学猝灭能力)，则将 观察到低于此的值。Fv/Fm表示可变荧光(Fv)相对于最大荧光值(Fm) 的比值。该性能指数基本上是样品活力的指标(参见例如Advanced TechniquesinSoilMicrobiology，2007，11，319-341;AppliedSoil Ecology，2000，15，169-182.)。
绿化的改善/改善的颜色和改善的光合效率以及衰老的延迟也可以 通过测量净光合率(Pn)、测量叶绿素含量(例如通过Ziegler和Ehle 的色素提取方法)、测量光化效率(Fv/Fm比)、测定枝条生长和最终 根和/或冠生物量、测定分蘖密度以及根死亡率而进行评估。
在本发明的上下文中，优选改善选自以下的植物生理学效应：增 强的根生长/更发达的根系、改善的绿化、改善的水利用效率(与降低 的水消耗相关)、改善的营养素利用效率(包括特别是改善的氮(N) 利用效率)、延迟的衰老和增强的产量。
在增强的产量中，优选指沉降值和降落数值的改善以及蛋白质和 糖含量的改善——特别是对于选自谷物(优选小麦)的植物。
优选地，本发明的杀真菌组合物的新用途涉及a)在有或没有抗性 管理的情况下预防性和/或治疗性地防治病原性真菌和/或线虫，与b) 增强的根系生长、改善的绿化、改善的水利用效率、延迟的衰老和增 强的产量中至少一种的结合的用途。从b)组中，特别优选增强的根 系、水利用效率和氮利用效率。
本发明的活性化合物结合物或组合物也适用于处理种子。由有害 生物引起的作物植物的大部分损害是由种子在储存期间或播种后以及 在植物发芽期间和发芽后的感染引起的。由于生长中的植物的根和芽 特别敏感，因此这个阶段特别关键，即使微小的损伤也可能导致植物 死亡。因此，通过使用合适的组合物保护种子和发芽植物引起人们的 极大关注。
通过处理植物种子来防治植物致病真菌是长时间以来已知的，并 且是不断改进的主题。然而，种子处理带来一系列问题，而这些问题 常常并不能以令人满意的方式来解决。因此，期望开发保护种子和发 芽植物的方法，该方法省去或至少显著降低在播种后或植物发芽后作 物保护组合物的额外施用。也期望最优化所使用的活性成分的量以为 种子和发芽植物提供最佳的保护使其免受植物致病真菌的侵袭，而所 使用的活性成分不对植物本身造成损害。特别地，处理种子的方法也 应考虑转基因植物固有的杀真菌性能，以采用最少量的作物保护组合 物实现对种子和发芽植物的最佳保护。
因此，本发明还涉及通过采用本发明的活性化合物结合物或组合 物处理种子来保护种子和发芽植物免受植物致病真菌侵袭的方法。本 发明还涉及本发明的活性化合物结合物或组合物用于处理种子以保护 种子和发芽植物免受植物致病真菌侵袭的用途。本发明还涉及经本发 明的活性化合物结合物或组合物处理以保护其免受植物致病真菌侵袭 的种子。
对苗后损害植物的植物致病真菌的防治主要通过采用作物保护组 合物处理土壤和植物的地上部位而进行。鉴于对作物保护组合物对环 境以及人类和动物健康可能产生的影响的关切，因此努力降低活性成 分的用量。
本发明的优点之一是，本发明的活性化合物结合物或组合物的特 殊的内吸性能意味着采用所述活性成分和组合物处理种子不仅保护种 子自身，还保护萌芽后得到的植物免受植物致病真菌的侵袭。因此， 可省去在播种时或播种后不久对作物的直接处理。
同样被认为有利的是，本发明的活性化合物结合物或组合物还可 特别地用于转基因植物和/或种子，其中所述植物或由所述种子长成的 植物能够表达抵抗害虫的蛋白质。通过采用本发明的活性化合物结合 物或组合物处理所述种子(仅表达蛋白，例如杀虫蛋白)可防治某些 害虫。出人意料地，在该情况中还可观察到协同效应，该协同效应进 一步增加对抗害虫侵袭的保护作用的有效性。
在下文中还将描述，采用本发明的活性化合物结合物或组合物处 理转基因植物或种子是特别重要的。这涉及包含至少一种异源基因的 植物的种子。合适的异源基因的定义和实例将在下面给出。
在本发明的上下文中，将本发明的活性化合物结合物或组合物单 独地或于合适的制剂中施用于种子。优选地，在种子足够稳定的状态 下处理种子以避免在处理中造成损害。通常，对种子的处理可在采收 和播种之间的任何时间进行。经常，使用已从植物中分离并已去除穗 轴、外壳、茎、表皮、毛或果肉的种子。例如，可使用已采收、清洁 并干燥至含湿量小于15重量%的种子。或者，也可使用干燥后例如已 用水处理过然后再次干燥的种子。
当处理种子时，通常必须注意，选择施用于种子的本发明的活性 化合物结合物或组合物的量和/或其他添加剂的量，以使得不损坏种子 的发芽，或使得不对所得植物造成损害。特别是对于在某些施用率下 可能具有植物毒性效应的活性成分而言，必须加以注意。
本发明的活性化合物结合物可直接施用，即不包括任何其他组分 并不被稀释。通常优选将组合物以合适的制剂形式施用于种子。用于 种子处理的合适的制剂和方法为本领域技术人员已知并在例如以下文 献中有描述：US4,272,417、US4,245,432、US4,808,430、US5,876,739、 US2003/0176428A1、WO2002/080675、WO2002/028186。
可将可依据本发明使用的活性成分转化为常规的拌种制剂，例如 溶液、乳剂、悬浮剂、粉剂、泡沫、浆液或其他种子包衣组合物，以 及ULV制剂。
这些制剂以已知方式通过将活性成分与常规添加剂混合来制备， 所述常规添加剂例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿 剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘合剂、赤霉 素和水。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的有用的着色剂为常用 于此目的的所有着色剂。可以使用微溶于水的色素，也可以使用溶于 水的染料。实例包括已知的名称为罗丹明B(RhodamineB)、C.I.颜 料红12(C.I.PigmentRed112)和C.I.溶剂红1(C.I.SolventRed1) 的着色剂。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的有用的润湿剂为促进 润湿并常规用于农用化学活性成分制剂中的所有物质。优选使用烷基 萘磺酸盐，如二异丙基萘磺酸盐或二异丁基萘磺酸盐。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的有用的分散剂和/或乳 化剂为常规用于农用化学活性成分制剂中的所有非离子的、阴离子或 阳离子的分散剂。优选使用非离子或阴离子分散剂，或非离子或阴离 子分散剂的混合物。合适的非离子分散剂特别包括环氧乙烷/环氧丙烷 嵌段聚合物、烷基苯酚聚乙二醇醚和三苯乙烯基苯酚聚乙二醇醚，以 及其磷酸化或硫酸化衍生物。合适的阴离子分散剂特别为木素磺酸盐、 聚丙烯酸盐和芳基磺酸盐/甲醛缩合物。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂为通常用于农 用化学活性成分制剂中的所有泡沫抑制物质。优选使用硅酮消泡剂和 硬脂酸镁。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的防腐剂为在农用化学 组合物中用于此目的的所有物质。实例包括二氯酚和苯甲醇半缩甲醛。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的二次增稠剂为在农用 化学组合物中用于此目的的所有物质。优选的实例包括纤维素衍生物、 丙烯酸衍生物、黄原胶、改性粘土、以及细碎的二氧化硅。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的粘合剂为可用于拌种 产品的所有常规粘合剂。优选的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙 烯酯、聚乙烯醇和甲基纤维素。
可存在于可依据本发明使用的拌种制剂中的赤霉素优选为赤霉素 A1、A3(=赤霉酸)、A4和A7;特别优选使用赤霉酸。
可依据本发明使用的拌种制剂可直接使用或预先用水稀释之后使 用，用于处理宽范围的不同种子，包括转基因植物的种子。在这种情 况下，与通过表达形成的物质相互作用，也可出现额外的协同效应。
对于采用可依据本发明使用的拌种制剂或由所述拌种制剂通过添 加水而制备的制剂进行的种子处理而言，所有可常规用于拌种的混合 单元都可用。具体而言，在拌种操作中进行以下程序：将种子置于混 合器中，加入特定的所需量的拌种制剂(以其自身形式或预先用水稀 释过)，混合所有物质直到制剂均匀地分布于种子上。如果合适，随后 进行干燥步骤。
本发明的活性化合物结合物或组合物可在材料保护中用于保护工 业材料免受不想要的微生物(例如真菌和昆虫)的侵袭和破坏。
此外，本发明的活性化合物结合物可单独地或与其他活性成分结 合用作防污组合物。
在本发明上下文中，工业材料应理解为是指已经被制备以用于工 业的非活体材料。例如，意图通过本发明的活性化合物结合物或组合 物保护以免受微生物改变或损坏的工业材料可为粘合剂、胶料、纸、 墙纸和板/纸板、纺织物、地毯、皮革、木材、纤维和组织、涂料和塑 料制品、冷却润滑剂、以及其他可被微生物侵袭或损坏的材料。也可 在意图保护的材料范围内提及可被微生物的繁殖所损坏的生产车间和 建筑物的部分，例如冷却水循环、冷却和加热系统以及通风和空调单 元。本发明范围内的工业材料优选包括粘合剂、胶料、纸和板、皮革、 木材、涂料、冷却润滑剂和传热液体，更优选为木材。
本发明的活性化合物结合物或组合物可防止不利影响，如腐烂、 朽化、变色、褪色或形成霉菌。
在处理木材的情况下，本发明的活性化合物结合物还可用于抵抗 易于生长在木料表面或内部的真菌病害。术语“木料(timber)”意指 所有类型的木材种类，以及所有类型的经加工可用于建设的木材，例 如实木、高密度木、层积材和胶合板。本发明的用于处理木料的方法 主要在于与本发明的一种或多种化合物或本发明的组合物接触;这包 括例如直接施用、喷洒、浸渍、注入或任何其他合适的方法。
此外，本发明的活性化合物结合物可用于保护与盐水或半咸水接 触的物体，特别是船体、筛、网、建筑物、系泊用具和信号系统以防 产生污损。
本发明的用于防治不想要的真菌的方法还可用于保护储存物品。 储存物品应理解为是指植物或动物来源的天然物质或其天然来源的加 工产品，其需要长期保护。植物来源的储存物品，例如，植物或植物 部位，如茎、叶、块茎、种子、果实、谷物，可以刚采收后保护或经 加工后保护，所述加工为(预)干燥、湿润、粉碎、磨碎、压制或烘烤。 储存物品还包括木料，包括未加工的，例如建筑木料、电线杆和栅栏， 或以制成产品的形式，如家具。动物来源的储存物品为，例如皮、皮 革、毛皮和毛发。本发明的活性化合物结合物或组合物可以预防不利 影响，如腐烂、朽化、变色、褪色或形成霉菌。
能够降解或改变工业材料的微生物包括，例如细菌、真菌、酵母 菌、藻类和粘液生物(slimeorganism)。本发明的活性化合物结合物 或组合物优选用于抵抗真菌，特别是霉菌、使木材变色和破坏木材的 真菌(子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)、半知 菌纲(Deuteromycetes)和接合菌纲(Zygomycetes))，以及抵抗粘液 生物和藻类。实例包括以下属的微生物：链格孢属(Alternaria)，例如 纤细链格孢(Alternariatenuis);曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉 (Aspergillusniger);毛壳菌属(Chaetomium)，例如球毛壳菌 (Chaetomiumglobosum);粉孢革菌属(Coniophora)，例如单纯粉孢 革菌(Coniophorapuetana);香菇属(Lentinus)，例如虎皮香菇菌 (Lentinustigrinus);青霉属(Penicillium)，例如灰绿青霉(Penicillium glaucum);多孔菌属(Polyporus)，例如杂色多孔菌(Polyporus versicolor);短梗霉属(Aureobasidium)，例如出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans);核茎点属(Sclerophoma)，例如 Sclerophomapityophila;木霉属(Trichoderma)，例如绿色木霉 (Trichodermaviride);长喙壳状属种(Ophiostomaspp.)、长喙壳属 种(Ceratocystisspp.)、腐质霉属种(Humicolaspp.)、彼得壳属种 (Petriellaspp.)、毛束霉属种(Trichurusspp.)、云芝属种(Coriolus spp.)、褶菌属种(Gloeophyllumspp.)、侧耳属种(Pleurotusspp.)、茯 苓属种(Poriaspp.)、龙介虫属种(Serpulaspp.)和干酪菌属种 (Tyromycesspp.)、分枝孢子菌属种(Cladosporiumspp.)、拟青霉属 种(Paecilomycesspp.)、毛霉菌属种(Mucorspp.);埃希氏菌属 (Escherichia)，例如大肠杆菌(Escherichiacoli);假单细胞菌属 (Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa);葡 萄球菌属(Staphylococcus)，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);念珠菌属(Candidaspp.)和酵母属种(Saccharomycesspp.)， 例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)。
此外，本发明的活性化合物结合物或组合物还具有非常好的抗霉 菌活性。它们具有非常宽的抗霉菌活性谱，特别是对皮肤真菌和酵母 菌、霉菌和双相性真菌(例如对念珠菌属(Candida)种，例如白色念 珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata))和絮状表皮癣菌 (Epidermophytonfloccosum)、曲霉属(Aspergillus)种(例如黑曲霉 (A.niger)和烟曲霉(A.fumigatus))、发癣菌属(Trichophyton)种 (例如须发癣菌(T.mentagrophytes))、小孢子菌属(Microsporon) 种(例如犬小孢子菌(M.canis)和奥杜盎小孢子菌(M.audouinii))。 所列举的这些真菌并不限制可覆盖的霉菌谱，而仅是为了说明。
因此，本发明的活性化合物结合物或组合物可用于医疗和非医疗 应用中。
如上面已提及的，可根据本发明处理所有的植物和植物部位。在 一优选实施方案中，处理野生植物品种和植物栽培种，或处理通过常 规生物育种方法(例如交叉育种或原生质融合)获得的那些植物及其 部位。在另一优选实施方案中，处理通过基因工程方法(如果合适， 与常规方法结合)获得的转基因植物和植物栽培种(遗传修饰的生物) 及其植物部位。术语“部位”或“植物的部位”或“植物部位”在上 文中已有解释。更优选地，根据本发明处理市售的或使用中的植物栽 培种的植物。植物栽培种应理解为意指具有新性能(“性状(trait)”) 的植物，其可以通过常规育种、诱变或重组DNA技术获得。它们可以 为栽培种、变种、生物型或基因型。
本发明的处理方法可用于处理遗传修饰的生物(GMO)，例如植 物或种子。遗传修饰植物(或转基因植物)是异源基因被稳定地整合 到基因组中的植物。表述“异源基因”主要指在植物体外提供或组装 的基因，并且当它们被引入核基因组、叶绿体基因组或线粒体基因组 时，通过表达感兴趣的蛋白质或多肽，或通过下调或沉默存在于植物 体内的其他基因(利用例如反义技术、共抑制技术、RNA干扰-RNAi 技术或微RNA–miRNA技术)，而赋予这些转基因植物新的或改进的 农学特性或其它特性。位于基因组中的异源基因也被称作转基因。通 过其在植物基因组中的具体位置而定义的转基因被称为转化株系或转 基因株系(event)。
根据植物种或植物栽培种，其位置和生长条件(土壤、气候、生 长期、营养)，本发明的处理还可导致超加和(“协同”)效应。例 如，可取得以下超过实际预期的效果：降低可依据本发明使用的活性 化合物和组合物的施用率和/或拓宽其活性谱和/或提高其活性、改善植 物生长、提高对高温或低温的耐受性、提高对干旱或对水或土壤含盐 量的耐受性、提高开花性能、使采收较容易、加速成熟、采收产量更 高、果实更大、植株更高、叶色更绿、开花更早、采收产品的品质和/ 或其营养价值更高、果实中糖的浓度更高、采收产品的储存稳定性和/ 或加工性更好。
本发明的活性化合物结合物在植物中也具有强化作用。因此，它们 也适用于调动植物的防御体系以抵抗不想要的微生物。这可能，如果合 适，是本发明的活性化合物结合物具有增强的活性的理由之一。在本文 中，植物强化(抗性诱导)物质应理解为意指能够以这样一种方式刺激 植物防御体系的物质或物质的结合，即当随后接种不想要的微生物时， 经处理的植物对这些微生物表现出很大程度的抗性。在这种情况下， 不想要的微生物可以理解为指的是植物病原真菌、细菌和病毒。因此， 可将本发明的物质用于保护植物在处理后的一定时期内免受上述病原 体的侵害。在采用活性化合物处理植物后，实现保护作用的时间通常 持续1-10天，优选1-7天。
优选依据本发明处理的植物和植物栽培种包括所有具有遗传物质 的植物，所述遗传物质赋予这些植物特别有益的、有用的性能(无论是 通过育种和/或通过生物技术方法得到)。
同样优选依据本发明处理的植物和植物栽培种对一种或多种生物 胁迫因素具有抗性，即所述植物对动物和微生物害虫(如对线虫、昆虫、 螨类、植物致病真菌、细菌、病毒和/或类病毒)具有更好的防御性。
线虫或昆虫抗性植物的实例为，例如在WO2012/045798A1和WO 2012/089757A1中提到的那些。
还可依据本发明处理的植物和植物栽培种是对一种或多种非生物 胁迫因素具有抗性的植物。非生物胁迫条件可包括，例如干旱、低温 暴露、热暴露、渗透胁迫、水涝、增加的土壤含盐量、增强的矿物质 暴露、臭氧暴露、强光暴露、有限的氮营养素利用度、有限的磷营养 素利用度、避荫。
还可依据本发明处理的植物和植物栽培种是以增强的产量特性为 特征的那些植物。所述植物的提高的产量可由以下因素导致：例如，改 进的植物生理机能、生长和发育，如用水效率、持水效率、改进的氮利 用、增强的碳同化作用、改善的光合作用、提高的发芽率和加速的成 熟。产量还可受到改进的植物构造(plantarchitecture)的影响(在胁 迫和非胁迫条件下)，包括但不限于：提早开花、对杂种制种的开花 控制、秧苗活力、植株大小、节间数和节间距、根系生长、种子大小、 果实大小、荚果大小、荚果数或穗数、每个荚果或穗的种子数目、种 子质量、提高的种子饱满度、减少的种子散布、减少的荚开裂以及抗 倒伏性。其他产量特征包括种子组成，如碳水化合物含量、蛋白质含 量、油含量及组成、营养价值、抗营养化合物的减少、改进的加工性 和更好的贮存稳定性。
可依据本发明处理的植物为已经表达出杂种优势或杂种活力特征 的杂种植物，所述杂种优势或杂种活力通常导致更高的产量、更高的活 力、植物更加健康和对生物胁迫和非生物胁迫更好的抗性。这种植物通 常通过将一种自交雄性不育亲系(母本)与另一种自交雄性能育亲系(父 本)杂交而制得。杂种种子通常采收自雄性不育植物并出售给种植者。 雄性不育植物有时(例如在玉米中)可通过去雄(即机械地移去雄性生 殖器官或雄花)而制得，但是，更通常地，雄性不育性是由植物基因组 中的遗传决定因子导致的。在这种情况下，特别是当种子是待从杂交植 物上采收的所需产品时，确保杂交植物中的雄性能育性的完全恢复通常 是有用的。这可通过确保父本具有合适的育性恢复基因而完成，该基因 能够恢复含有负责雄性不育性的遗传决定因子的杂种植物的雄性能育 性。负责雄性不育的遗传决定因子可位于细胞质中。细胞质雄性不育 (CMS)的实例例如在芸苔属(Brassica)种中描述过(WO92/05251、 WO95/09910、WO98/27806、WO2005/002324、WO2006/021972和 US6,229,072)。然而，负责雄性不育的遗传决定因子也可位于细胞核 基因组中。雄性不育植物还可通过植物生物技术方法如基因工程获得。 一种获取雄性不育植物的特别有用的方法记载于WO89/10396中，其 中，例如，在雄蕊中的绒毡层细胞中选择性表达核糖核酸酶例如芽孢杆 菌RNA酶。随后可通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制因子如芽 孢杆菌RNA酶抑制因子来恢复能育性(例如WO91/02069)。
可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法 如遗传工程而获得)是除草剂耐受性植物，即对一种或多种给定的除 草剂耐受的植物。这些植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予所述 除草剂耐受性的突变的植物而获得。
除草剂抗性植物为例如草甘膦(glyphosate)耐受植物，即对除草 剂草甘膦或其盐耐受的植物。可通过不同方法使植物对草甘膦耐受，例 如在WO2012/045798A1和WO2012/089757A1中提到的那些方法。
其他对除草剂具有抗性的植物为，例如对抑制谷氨酰胺合成酶的 除草剂耐受的植物，所述除草剂如双丙氨膦(bialaphos)、草丁膦 (phosphinothricin)或草铵膦(glufosinate)。这些植物可以通过在 WO2012/045798A1和WO2012/089757A1中提到的方法获得。
其他除草剂耐受植物还为对抑制羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的 除草剂耐受的植物。HPPD是催化对羟苯基丙酮酸盐(HPP)转化为 尿黑酸的反应的酶。耐受HPPD抑制剂的植物可用编码天然存在的抗 HPPD酶的基因或者用编码突变的或嵌合的HPPD酶的基因转化而获 得，例如在WO2012/045798A1和WO2012/089757A1中提到的。
其他除草剂耐受植物是对乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂耐受的 植物。已知的ALS抑制剂包括，例如，磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧 啶、嘧啶氧(硫)基苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已 知ALS酶(也称为乙酰羟酸合成酶，AHAS)中的不同突变赋予对不 同除草剂和除草剂组的耐受性(参见在WO2012/045798A1和WO 2012/089757A1中提到的相应参考)。
还可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方 法如遗传工程获得的)是对昆虫具有抗性的转基因植物，即对某些目 标昆虫的侵袭具有抗性的植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择 含赋予所述昆虫抗性的突变的植物而获得。
本文所用的“昆虫抗性转基因植物”特别涉及WO2012/045798A1 和WO2012/089757A1中提到的昆虫抗性转基因植物。
还可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方 法如遗传工程而获得的)对非生物胁迫具有耐受性。这类植物可通过 遗传转化或通过选择含有赋予所述胁迫抗性的突变的植物而获得。特 别有用的胁迫耐受性植物是在WO2012/045798A1和WO 2012/089757A1中提到的那些。
还可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方 法如遗传工程而获得)显示出采收产品的数量、品质和/或贮存稳定性 的改变，和/或采收产品的特定成分特性的改变，所述植物或植物栽培 种例如在WO2012/045798A1和WO2012/089757A1中提到的那些转 基因植物。
还可依据本发明处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方 法如遗传工程而获得的)是具有改变的油分布特性的植物，例如油菜 和相关的芸苔属植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予 所述改变的油分布特性的突变的植物而获得，包括在WO2012/045798 A1和WO2012/089757A1中提到的那些油料种子油菜植物。
可依据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化株系或者 含有转化株系的结合的植物，这些植物是在美国向美国农业部(USDA) 的动植物卫生检查署(APHIS)申请成为非管制状态的对象，无论所 述申请已经被批准或仍未决。
可依据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化株系或者 含有转化株系的结合的植物，是在WO2012/045798A1和WO 2012/089757A1中提到的那些。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于实现下列效果中的一项、几 项或所有的方法：
-防治在植物中或在植物上的植物致病真菌，
-在作物保护中防治植物致病真菌，
-提高植物的活力和/或改善植物发育(尤其是改善植物生长，优选 增加植物生长速率)，
-提高色素含量和/或增强光合活性(优选增加叶绿素含量，从而优 选得到更绿的叶子(“绿化”)和/或更大的叶子(特别是更大的叶片))，
-增加生物量，例如更高的鲜重(FW)和/或干重(DW)，优选增 加植物重量(尤其是更高的果实重量(每个果实)或更高的粒重(每粒) 和/或更高的总果实或更高的总粮食产量)和/或增加株高，
-增加营养素含量，尤其是增加微量营养素含量，尤其是增加大量营 养素含量(尤其是N、P和/或K的行亮)、增加蛋白质含量(尤其是水 溶性蛋白质的增加)、增加维生素含量(尤其是维生素A、B1、B2、C和 /或E的含量)和/或增加必需氨基酸的量，
所述方法的特征在于，将本发明的活性化合物结合物或组合物施用于 种子、植物、植物部位(优选果实和/或叶)，或者植物生长或期望植物 生长的土壤中。
在本发明的上下文中，特别地，所观察到的效果是在用本发明的 活性化合物结合物(如上所定义，优选在优选实施方案之一中所定义 的)或本发明的组合物(如上所定义，优选在优选实施方案之一中所 定义的)对植物或其部位的叶处理中观察到的。
当使用本发明的活性化合物结合物或组合物时，施用率可根据施 用类型在相对宽的范围内变化。
在本发明的优选方法中，将本发明的活性化合物结合物或本发明 的组合物施用于种子或叶上，其中在该施用中，在叶上的活性化合物结 合物的量在400至3000g/ha的范围内(优选为500至2500g/ha，更优选 的为600至2000g/ha，且甚至更优选为700至1700g/ha)，且在种子的 处理中在2-200g每100kg种子的范围内，优选为5-150g每100kg种子， 更优选为10-100g每100kg种子。
可将本发明的活性化合物结合物或本发明的组合物用于保护植物 在处理后的一段时间内免受所提及的病原体侵袭。在采用所述活性成 分处理植物后，提供保护的时间通常延续1至28天，优选为1至14 天，更优选为1至10天，最优选1至7天;或在种子处理后长达200 天。
所列植物可依据本发明采用本发明的活性化合物结合物或本发明 的组合物特别有利地处理。本发明的活性化合物结合物具有活性，该 活性超过了各组分活性的简单相加。本发明的活性化合物结合物的改 进的活性从以下实例中是显而易见的。
当活性化合物结合物的活性超过活性化合物在单独施用时的活性总 和时，则存在协同效应。
两种活性化合物的给定结合的预期活性可如下计算(参考Colby，S.R., “CalculatingSynergisticandantagonisticResponsesofHerbicide Combinations”，Weeds1967,15,20-22):
如果
X为活性化合物A以mppm(或g/ha)的施用率施用时的功效，
Y为活性化合物B以nppm(或g/ha)的施用率施用时的功效，
E为活性化合物A和B分别以m和nppm(或g/ha)的施用率施用 时的功效，
则
功效的程度以%表示。0%意指相当于对照组的功效。
如果所观测到的活性超过计算值，则所述结合的活性为超加和的，即 存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效必定大于由上述公式计 算出的预期功效(E)。
另一方面，本发明涉及本发明的活性化合物结合物或本发明的组合 物的用途，用于：
-防治在植物中或在植物上的植物致病真菌，
-在作物保护中防治植物病原真菌，
-提高植物的活力和/或改善植物发育(尤其是改善植物生长，优选 增加植物生长速率)，
-提高色素含量和/或增强光合活性(优选增加叶绿素含量，从而优 选得到更绿的叶子(“绿化”)和/或更大的叶子(特别是更大的叶片))，
-增加生物量，例如更高的鲜重(FW)和/或干重(DW)，优选增 加植物重量(尤其是更高的果实重量(每个果实)或更高的粒重(每粒) 和/或更高的总果实或更高的总粮食产量)和/或增加株高，
-增加营养素含量，尤其是增加微量营养素含量，尤其是增加大量营 养元素含量(尤其是N、P和/或K的含量)、增加蛋白质含量(尤其是 水溶性蛋白质的增加)、增加维生素含量(尤其是维生素A、B1、B2、C 和/或E的含量)和/或增加必需氨基酸的量。
另一方面，本发明涉及丙森锌用于增加或改进微量营养素(优选选自 Mn、B、Zn、Cu、Fe、Mo、Se、Al、Co和Ni中一种、两种、三种或 更多种微量营养素)和/或大量营养素(优选选自N、P和K中的一种、两种 或所有大量营养素)在植物中的摄取或通过植物的摄取的用途。
另一方面，本发明涉及本发明的活性化合物结合物或本发明的组合 物用于植物或其部位的叶处理的用途，其中所述植物可以是转基因植 物。
另一方面，本发明涉及本发明的活性化合物结合物或本发明的组合 物用于处理种子、转基因植物的种子和转基因植物的用途。
又一方面，本发明涉及采用本发明的活性化合物结合物或本发明的组 合物处理过的种子。
另一方面，本发明涉及试剂盒，其包括：
(A)丙森锌，
和成分(B)，其包括
(B1)一种或多种含有硼(B)的盐，和
(B2)一种或多种含有锰(Mn)的盐，
任选地还包括用于以某种方式施加成分(A)和(B)以得到本发明 的活性化合物结合物或本发明的组合物的操作说明。
实施例：
对丙森锌与Mn和B的结合对于生长特性的影响进行了评估，并且 评估了生理变化。此外，评估了由所述处理造成的营养-生理变化以及对 于病害防止、产量和作物产品品质的影响。
在下面的实验中，丙森锌以含有70重量%含量的丙森锌的可湿性粉 剂的形式使用，称为Antracol70WP。Antracol70WP商购自拜耳作物科 学。
实验在印度哥印拜陀区TamilNadu的田地里实施。
作物：番茄
样地面积：50m2
重复：3
间距：45×30cm
处理：8组
喷洒数目：2次喷洒：35DAP(种植后的天数)和45DAP
处理详情：
在实验中采用如下处理方式：
T1：对照组
T2：Antracol70WP(1250g/ha)
T3：锰(0.2%)
T4：Antracol70WP(1250g/ha)+锰(0.2%)
T5：硼(0.2%)
T6：Antracol70WP(1250g/ha)+硼(0.2%)
T7：锰(0.2%)+硼(0.2%)
T8：Antracol70WP(1250g/ha)+锰(0.2%)+硼(0.2%)
用优质水进行叶面喷洒(pH：7.3)
在第二次喷洒后第20天，在株高、根长、叶数和叶面积方面进行形 态学观测以及使用SPAD量器测量叶子叶绿素指数。此外，在收获时也 记录产量和其构成。此外，也记录病害得分(番茄早期和晚期枯萎病)和 植物营养素状况。不同处理的各种参数的结果在各表中给出。
将收集到的数据使用ANOVA包(AGRES版本7.01)在随机化完全 区组设计中进行数据分析。
所使用的田地布局
行I T3 T6 T4 T7 T2 T8 T1 T5 行II T6 T8 T5 T3 T1 T4 T2 T7 行III T7 T2 T8 T4 T5 T3 T1 T6
表1：在实验中所使用的初始土壤参数(处理前)
表2：丙森锌、锰和硼对番茄生长方面的影响
生长参数
关于生长参数，所述株高没有达到统计学显著性(表2)。Antracol 70WP与Mn和B的叶面喷洒显示出更高的植株(81.20cm)，其次是 Antracol70WP+Mn(T4：79.40cm)和Antracol70WP(T2：79.00cm)。
相比之下，在单独使用锰(T3)的叶面喷洒中观察到了较小的植株。关 于根长，在接受Antracol70WP+Mn处理的T4中记录了27.90cm的显 著优异的根长，该处理T4与处理T8(Antracol70WP+Mn+B)相当。 在未喷洒的对照处理中记录了24.55cm的最低值。
表3：丙森锌、锰和硼对番茄叶的影响
叶片特性
所有叶片特性达到了统计学显著性(表3)。关于叶数，Antracol70WP +Mn+B叶面喷洒显示出更高的叶数(36)，这显著优于其他处理。关于 叶面积和叶面积指数(LAI)，经Antracol70WP+Mn+B处理的植物记 录了对应于LAI(T8:0.50)的每株673.50cm2的更高的叶面积，其次是 Antracol70WP(每株624.60cm2和0.46)。在单独使用硼进行叶面喷洒 的处理(T5)中发现了每株530.39cm2的较小的叶面积和LAI(0.39)。
表4：丙森锌、锰和硼对番茄生物化学参数的影响
生化参数
关于生化参数，所有参数达到了统计学显著性(表4)。在处理Antracol 70WP+Mn+B中记录了显著更高的叶绿素指标值(47.7)，其次是 Antracol70WP+锰(45.7)、Antracol70WP+硼(45.6)和Antracol70WP (45.5)。关于可溶性蛋白，经Antracol70WP+Mn+B喷洒的植物表现 出11.3mgg-1更高的可溶性蛋白质含量，其次是Antracol70WP+B(10.5 mgg-1)和Antracol70WP+Mn(10.2mgg-1)。关于以未氧化植物生长 素含量表示的IAA氧化酶活性，对照组记录了15.85μgg-1h-1的更高的未 氧化植物生长素含量，这接近于单独接受Antracol70WP处理的T2(15.73 μgg-1h-1)。使用Mn的处理显示出更高的IAA氧化酶活性(低的未氧化 植物生长素含量)，其中Mn单独显示了更高的活力(12.32)，其次是 Mn+B(T7)和Antracol+Mn+B(T8)。
表5：丙森锌、锰和硼对番茄植物营养素含量的影响
关于营养素状况，所有的营养素达到了统计学显著性(表5)。关于 氮含量，T8(Antracol70WP+Mn+B)记录了更高的N百分比(1.55%)， 其次是T6(Antracol+B：1.42%)和T7(锰+硼：1.40%)。在处理T8 (Antracol70WP+Mn+B)中记录了0.44的更高的P含量百分比，仅 次于T6(Antracol70WP+B：0.41)，T6与T7(Mn+B：0.40)相当。 关于K，在处理T8(Antracol70WP+Mn+B：1.28)中再次记录了更 高的K百分比，其次是处理T4(Antracol70WP+Mn：1.18)，T4与 T6(Antracol70WP+B：1.17)和T2(Antracol70WP：1.14)相当。
关于锰含量，T8(Antracol70WP+Mn+B)记录了更高的Mn百分 比(0.033%)，其次是T7(Mn+B：0.028%)和T4(Antracol70WP+Mn： 0.025%)。关于硼(B)的含量，T8(Antracol70WP+Mn+B)记录了 更高的B百分比，其次是T7(Mn+B：0.044%)和T6(Antracol70WP +B：0.040%)。整体性能方面，在处理Antracol70WP+Mn+B中记录 了明显更高的N(1.55%)、P(0.44%)、K(1.28%)、Mn(0.033%) 和B(0.058%)含量。未喷洒的对照处理(T1)中记录了较低的N(1.20%)、 P(0.32%)、K(0.93%)、Mn(0.018%)和B(0.028%)含量。
表6：丙森锌、锰和硼对番茄作物生长率(CGR)(gm-2d-1)的影响
作物生长率(CGR)(gm-2d-1)
在如下两个阶段中计算作物生长率：种植后的60-90天和90-120天 (DAP)，作物生长率在作物生长的两个阶段均达到了统计学显著性(表 6)。经Antracol70WP+Mn+B(T8)的叶面喷洒处理的植物分别在 60-90和90-120DAP期间记录了27.35和14.84gm-2d-1的更高的生长速 率。T8与处理Antracol70WP+B(T6：26.69gm-2d-1)和Antracol70WP +锰(T4：26.69gm-2d-1)在60-90DAP期间的作物生长率相当。未处 理的对照植物在60-90DAP记录了24.29gm-2d-1的较低的生长速度。
表7：丙森锌、锰和硼对番茄产量参数和果实产量的影响
产量参数
关于产量参数，除水果直径以外所有的产量参数都达到了统计学显著 性(表7)。关于平均果重，经Antracol70WP+Mn+B(T8)处理的果 实达到27.85g的更高的平均重量，这与处理Antracol70WP+B(T6： 27.46)、Antracol70WP+Mn(T4：27.32)和Antracol70WP(T2：27.15) 相当。然而，相对于未喷洒的对照组(T1：26.13g)果重增加6.6%(T8)。 关于果实体积，经Antracol70WP+Mn+B喷洒的果实，果实的体积更大 (28.96cc)，其相对于对照组(26.59cc)增大了8.9%。类似的趋势与 果重的情况一样。果实直径没有达到统计学显著性。在处理T8中记录了 更高的果实直径且在对照组中得到了较低的果实直径(5.36)。
关于果实数量，在Antracol70WP+Mn+B处理中记录了每株植物 29个果实的更高数量，其与Antracol70WP+B(T6：28)的处理相当。 在未喷洒的对照组(T1：23)中记录了较少的果实数量。与T3和T1相 比，T8记录了26.1%的增加的果实数量。关于果实产量，经Antracol70WP +Mn+B(T8)喷洒的样地收获了每块样地251kg的更高的果实产量，其 与处理T6(Antracol70WP+B)收获的每块样地245kg的果实产量相 当。未喷洒的对照植株(T1)记录了较低的果实产量(每块样地224kg)。 计算了产量增加的百分比且比较了这些处理。与未喷洒的对照组相比， Antracol70WP+Mn+B记录了12.1%的更高的百分比增量，其次是 Antracol70WP+B(8.0)和Antracol70WP+Mn(9.4)。再次比较Antracol 处理，与未喷洒的对照组相比，Antracol70WP+Mn+B记录了8.2%的 果实产量增量，其次是Antracol70WP+B(5.6)和Antracol70WP+Mn (4.3)。
表8：丙森锌、锰和硼对番茄病害百分比指数的影响
关于病害指数值(表8)，在用Antracol70WP+Mn+B(T8：13.22)、 Antracol70WP+B(T6：15.33)、Antracol70WP+Mn(T4：13.42) 和Antracol70WP(T2：15.66)进行叶面喷洒的Antracol喷洒处理中观 察到了更低的病害百分比指数。在未喷洒的对照田中，观察到了更高的病 害百分比指数值(87.64)。相对于未喷洒的对照组，Antracol70WP+Mn +B记录了84.92%的更高的百分比下降，其次是Antracol70WP+Mn (84.69)、Antracol70WP+B(82.51)和Antracol70WP(82.13)。
表9：丙森锌、锰和硼对番茄品质参数的影响
品质参数
关于品质参数，总可溶性固体(TSS)含量达到了统计学显著性(表 9)。关于番茄红素含量，在处理Mn+B中记录了4.75mg100g-1果实的 更高含量，其次是单独使用B的处理(4.68)。在未喷洒的对照组中(T1： 4.51)记录了最低值。考虑到TSS值，经Antracol70WP+Mn+B(T8) 喷洒的植株记录了4.3的更高的白利糖度值，其与T7(锰+硼：4.2)相当， 其次是T6(4.1)。计算了从收获的第一天到收获后在室温下贮存第五天 的果实重量损失百分比。在对照组以及T4(Antracol70WP+Mn)中记 录了更高的百分比。在处理T5(单独的硼)、T7(锰+硼)和T8(Antracol 70WP+Mn+B)中记录了27.2%的较低的百分比。
结论
在番茄植株上使用Antracol70WP与Mn和B的结合的叶面喷洒在生 长和发育以及降低的发病率趋势到最终的果实产量方面表现良好。
-在番茄中，经Antracol70WP与Mn和B的叶面喷洒比未喷洒的 对照组示出了13.4%的根长增量;
-通过Antracol70WP与Mn和B的叶面喷洒，观察到了叶绿素指 数(SPAD值)的23.6%的增量以及可溶性蛋白(24.2%)的增量;
-与未喷洒的对照相比，通过Antracol70WP与Mn和B处理，记 录了番茄植株营养素状况的改善，N(1.55%)、P(0.44%)、K(1.28%)、 Mn(0.033%)和B含量(0.058%);
-通过Antracol与Mn和B处理，作物生长速度增加了12.6%，这 产生了26.1%的果实数目增量;
-与未喷洒的对照相比，Antracol70WP与Mn和B的叶面喷洒记录 了12.1%果实产量增量。
新活性化合物 篇3：
含硫药理学活性化合物
第一、技术领域
本发明涉及含硫药理活性化合物，其可转化成药理学活性二硫化物化合物;并且涉及在活体外制备所述化合物或者调配以允许活体内形成所述二硫化物化合物的方法。根据本发明的化合物优选在含有硫醇(巯基)、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的医药活性化合物与药理学上可接受的硫醇化合物之间形成。
第二、背景技术
有机化合物中的硫对于生物系统起到不同且至关重要的作用。简单的含硫氨基酸半胱氨酸是重要的蛋白质构件。其参与复杂的金属结合作用、与其它硫基结合、蛋白质折叠键结和还原-氧化(REDOX)功能。硫原子还是肽、蛋白质、酶、膜、核酸和DNA的氨基酸构件的重要部分。
许多医药活性化合物(PAC)含有硫醇(巯基)、亚磺酰基(SO)、磺酰基(SO2)或磺酰胺基(SONR′R′，其中R′为氢或烷基)，其与连接到蛋白质、酶(例如，胃H、K、ATPase)、肽(例如，谷胱甘肽)或简单分子(例如，半胱氨酸)的硫醇(巯基)、二硫化物、亚磺酰基或磺酰基进行氧化-还原(REDOX)反应。PAC与这些基团的结合是一个受多种因素影响的可逆过程，所述因素包括pH值、其它氧化和还原基团的存在、生理学REDOX缓冲系统、REDOX催化剂、酶和温度。
在大多数生理系统中，都需要维持内部与外部细胞的健康动态REDOX平衡。
PAC的硫基对于药物活性特别重要。含有硫基的PAC的活性范围涵盖抗菌、消炎、抗风湿、抗溃疡、抗病毒、抗精神病、肝保护(hepatoprotectant)、利尿、杀真菌、糖尿病活性等。PAC中硫基的含量程度表明药物分子中含硫量的生物/药理学重要性。
含有亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的医药活性化合物(PAC)的实例包括质子泵抑制剂(PPI);和具有抗溃疡活性的化合物，诸如奥美拉唑(Omeprazole)，奥美拉唑异构体，诸如S-奥美拉唑、埃索美拉唑(Esomeprazole)()、R-奥美拉唑、兰索拉唑(Lansoprazole)、潘托拉唑(Pantoprazole)、雷贝拉唑(Rabeprazole)、帕瑞拉唑(Pariprazole)、泰妥拉唑(Tenatoprazole)、雷米拉唑(Leminoprazole)和其异构体或代谢物。
然而，尽管含有硫基的PAC具有生物活性和医药益处，但其通常相对不稳定，可呈现调配困难和/或具有较低生物可用性。
含硫PAC还可能在胃部的酸性环境中不稳定。实例包括质子泵抑制剂(PPI)，诸如奥美拉唑。已研发出完善且昂贵的调配物并且将继续研发以尝试解决这些问题(例如参看WO 94/25070、WO 00/27366和AU 13541/00)。因此，需要不涉及肠衣但在胃部酸性条件下仍稳定的PPI调配物。
第三、发明内容
根据本发明第一方面，提供一种制备式I化合物的方法
PAC-SA-SB-R* (I)，
其中
PAC-SA为含有共价键结的呈还原巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基形式的硫原子SA的医药活性药物、其代谢物或其医药学上可接受的盐的残基，其中SA与药理学上可接受的巯基化合物的经氧化巯基的硫原子SB共价键结，并且R*表示烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸或氨基，其视情况经一个或一个以上选自以下基团的取代基取代：烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸、乙酰胺、羟基、卤素、-CN、-CF3、-NO2;或者R*表示氨基酸、乙酰化氨基酸、肽、蛋白质或其衍生物，
所述方法包含在不存在酸的情况下，使含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物以PAC比巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比反应，以形成式I化合物。
根据本发明第二方面，提供一种由根据本发明第一方面的方法制备的化合物。
根据本发明第三方面，提供一种具有结构(A)的化合物：
其中R1、R2、R3和R4相同或不同并且为氢、烷基、环烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、卤素、-CN、-CF3、-NO2、-COR10、烷硫基、烷基亚磺酰基、芳基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基，或者其中R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成一个或一个以上5元、6元或7元环，其各自可为饱和或不饱和的，并且可含有0-3个选自N、S和O的杂原子，且各环可视情况经1-4个选自具有1-3个碳原子的烷基的取代基取代，或者两个或四个上述取代基一起形成一个或两个氧代基
或者R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成彼此稠合的两个环;
R5、R6和R8相同或不同并且选自氢和烷基;
R7为氢、烷基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、烯氧基或炔氧基;或
R6与R7或R7与R8连同吡啶环中的相邻碳原子一起形成5元或6元饱和或不饱和环，其可视情况含有氧或视情况烷基化的氮原子;
R10表示烷基、芳基、芳氧基和烷氧基;且
R9为药理学上可接受的巯基化合物的基团，其中所述巯基化合物是选自由以下物质组成的群组：N-乙酰基-半胱氨酸、青霉胺(penicillamine)、硫代烷(烯)醇、硫代山梨糖醇(thiosorbitol)、硫代甘油、硫代葡萄糖、硫代乙酸、硫代苹果酸、硫代聚氧乙醇、硫代聚烷氧乙醇、硫代尿嘧啶、硫代鸟苷、硫代组氨酸和巯乙酰替萘胺。
根据本发明第四方面，提供一种具有结构(V)的化合物：
其中：
RA、RB和RC独立地表示氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C3-6环烷氧基、C1-6氟烷基或C1-6氟烷氧基;且
RD表示氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6氟烷基或C1-6氟烷氧基，或卤素。
根据本发明第五方面，提供一种活体外制备式I化合物的方法
PAC-SA-SB-R* (I)，
其中
PAC-SA为含有共价键结的呈还原巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基形式的硫原子SA的医药活性药物、其代谢物或其医药学上可接受的盐的残基，其中SA与药理学上可接受的巯基化合物的经氧化巯基的硫原子SB共价键结，并且R*表示烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸或氨基，其视情况经一个或一个以上选自以下基团的取代基取代：烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸、乙酰胺、羟基、卤素、-CN、-CF3、-NO2;或者R*表示氨基酸、乙酰化氨基酸、肽、蛋白质或其衍生物，
所述方法包含在不存在酸的情况下，使含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物以PAC比巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比反应，以在活体外形成式I化合物。
根据本发明第六方面，提供一种由根据本发明第五方面的方法制备的化合物。
根据本发明第七方面，提供一种活体内制备式I化合物的方法
PAC-SA-SB-R* (I)，
其中
PAC-SA为含有共价键结的呈还原巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基形式的硫原子SA的医药活性药物、其代谢物或其医药学上可接受的盐的残基，其中SA与药理学上可接受的巯基化合物的经氧化巯基的硫原子SB共价键结，并且R*表示烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸或氨基，其视情况经一个或一个以上选自以下基团的取代基取代：烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸、乙酰胺、羟基、卤素、-CN、-CF3、-NO2;或者R*表示氨基酸、乙酰化氨基酸、肽、蛋白质或其衍生物，
所述方法包含在不存在酸的情况下，使含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物以PAC比巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比以及视情况与一种或一种以上佐剂或赋形剂混合，对个体投药后其允许活体内形成式I化合物。在一个实施例中，PAC为干粉形式，其掺有也为干粉形式的巯基化合物连同视情况一种或一种以上佐剂或赋形剂。
根据本发明第八方面，提供一种由根据本发明第七方面的方法制备的化合物。
根据本发明第九方面，提供一种组合物，其包含一种或一种以上根据本发明第二方面、第三方面、第四方面、第六方面或第八方面中任一方面的化合物以及一种或一种以上佐剂或赋形剂。
根据本发明第十方面，提供一种用于活体内制备一种或一种以上根据本发明第二方面、第三方面、第四方面、第六方面或第八方面中任一方面的化合物的调配物。调配物可为干粉、片剂、液体、乳液、栓剂、溶液、膏药、凝胶、糊状物、颗粒、丸粒、胶囊、可注射物以及糖果和食品的形式。在特定实施例中，干调配物或片剂调配物可包括奥美拉唑、潘托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑或其医药学上可接受的盐中任一种作为PAC以及N-乙酰基半胱氨酸作为巯基化合物。
根据本发明第十一方面，提供一种用于活体外制备一种或一种以上根据本发明第二方面、第三方面、第四方面、第六方面或第八方面中任一方面的化合物的可注射调配物。可注射调配物可包括奥美拉唑、潘托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑或其医药学上可接受的盐中任一种作为PAC以及N-乙酰基半胱氨酸作为巯基化合物。
根据本发明第十二方面，提供一种通过投与一种或一种以上根据本发明第二方面、第三方面、第四方面、第六方面或第八方面中任一方面的化合物治疗或预防胃肠病症的方法。
根据本发明的化合物具有有利的药理特性，诸如对胃酸分泌的显著的抑制作用，和动物(包括人类)的胃肠保护作用。由于根据本发明的调配物和化合物具有独特的稳定性特征，故其特别适于制备稳定的PPI剂型，无需肠包衣。其尤其适用于人类和兽用药物，其中，其尤其可用于治疗和/或预防胃肠病症。
第四、附图说明
图1绘示根据实例3在活体外制备的奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物溶液样品的高效液相色谱。
图2绘示根据实例4制备并且在进行高效液相色谱(HPLC)分析前存储12个月的奥美拉唑、N-乙酰基半胱氨酸二硫化物和轻质氧化镁干粉掺合物样品的高效液相色谱。
第五、具体实施方式
本发明涉及在活体外或活体内条件下，在不存在酸的情况下制备在含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物的巯基之间形成的二硫化物化合物的方法。这具有在酸性胃部环境中使正常酸不稳定PPI稳定的作用，而无需肠包衣或油包衣型调配物。这对于PAC的调配成本、稳定性、生物可用性和毒性特别有益。由于所述化合物展现迅速的二硫化物REDOX交换，故进一步使用硫醇反应性分子(诸如，N-乙酰基半胱氨酸)作为药理学上可接受的巯基化合物来增强所需医药作用的药物动力学。
在一个实施例中，本发明提供一种制备式I化合物的方法：
PAC-SA-SB-R* (I)，
其中
PAC-SA为含有共价键结的呈还原巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基形式的硫原子SA的医药活性药物、其代谢物或其医药学上可接受的盐的残基，其中SA与药理学上可接受的巯基化合物的经氧化巯基的硫原子SB共价键结，并且R*表示烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸或氨基，其视情况经一个或一个以上选自以下基团的取代基取代：烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸、乙酰胺、羟基、卤素、-CN、-CF3、-NO2;或者R*表示氨基酸、乙酰化氨基酸、肽、蛋白质或其衍生物，
所述方法包含在不存在酸的情况下，使含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与医药学上可接受的巯基化合物以PAC比巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比反应，以形成式I化合物。
根据本发明，可将含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的任何医药活性化合物用作式I中的基团PAC-SA，其中SA表示巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的经还原硫原子。因此，式I化合物可包括消炎、抗风湿或抗病毒化合物作为PAC。出于本发明的目的，还包括医药学上可接受的PAC盐。举例来说，质子泵抑制剂的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和锌盐也包括在PAC的定义中。可将PAC通过一个或一个以上共价键与SA原子键结。
可用于本发明中的PAC的实例包括抗溃疡剂，诸如奥美拉唑，奥美拉唑异构体，诸如S-奥美拉唑、埃索美拉唑()、R-奥美拉唑、兰索拉唑、潘托拉唑、雷贝拉唑、帕瑞拉唑、雷米拉唑、泰妥拉唑和其异构体、医药学上可接受的盐或代谢物。
SB为药理学上可接受的巯基化合物的经氧化巯基的硫原子。式I中的SBR*表示例如下式的药理学上可接受的巯基化合物的基团：
HSBR*，
其中
R*表示烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸或氨基，其视情况经一个或一个以上选自以下基团的取代基取代：烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、烷硫基、烷氧基、烷氧基烷氧基、二烷基氨基、N-哌啶基、吗啉、苯基烷基、苯基烷氧基、羧酸、乙酰胺、羟基、卤素、CN、-CF3、-NO2，或者R*表示氨基酸、乙酰化氨基酸、肽、蛋白质或其衍生物。
可根据本发明利用的药理学上可接受的巯基化合物的非限制性实例包括L-半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、半胱胺、青霉胺、谷胱甘肽、硫代乙醇、硫代烷(烯)醇、硫代山梨糖醇、硫代甘油、硫代葡萄糖、硫代乙醇酸、硫代乙酸、硫代乳酸、硫代苹果酸、硫代聚氧乙醇、硫代聚烷氧乙醇、硫代尿嘧啶、硫代鸟苷、硫代组氨酸、巯乙酰替萘胺和硫代水杨酸。
所述化合物的巯基与PAC的巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基形成二硫键。许多巯基化合物凭其自身在临床上显著的益处的特性而具有非常确实的药理学相互作用记录，所述化合物包括N-乙酰基半胱氨酸和谷胱甘肽。
在特定实施例中，R*表示：
在特定实施例中，R*SBH为半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸或谷胱甘肽。
本发明还提供多种化合物，诸如式IA
-ve抗衡离子 (IA)，
其中：
R11、R12和S+一起表示医药活性化合物的残基;且SBR*表示药理学上可接受的巯基化合物的基团。SBR*的非限制性实例包括L-半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、半胱胺、青霉胺、谷胱甘肽、硫代乙醇、硫代烷(烯)醇、硫代山梨糖醇、硫代甘油、硫代葡萄糖、硫代乙醇酸、硫代乙酸、硫代乳酸、硫代苹果酸、硫代聚氧乙醇、硫代聚烷氧乙醇、硫代尿嘧啶、硫代鸟苷、硫代组氨酸、巯乙酰替萘胺和硫代水杨酸。
当硫原子具有正电荷以平衡分子的总电荷时，将存在-ve抗衡离子。负离子包括所属领域技术人员已知的离子并且可衍生自一种或一种以上以下物质：卤素(诸如氯、溴或碘)、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、肉桂酸、乙烷磺酸、富马酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖酸、盐酸、氢溴酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲烷磺酸、萘甲酸、羟萘甲酸、萘磺酸、萘二磺酸、萘丙烯酸、油酸、草酸、草酰乙酸、磷酸、丙酮酸、对甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、丙三羧酸、水杨酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸和琥珀酸。
在一个实施例中，抗衡离子为氯离子。
本发明还涉及具有结构(A)的式I化合物：
其中R1、R2、R3和R4相同或不同并且为氢、烷基、环烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、卤素、-CN、-CF3、-NO2、-COR10、烷硫基、烷基亚磺酰基、芳基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基;或者
其中R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成一个或一个以上5元、6元或7元环，其各自可为饱和或不饱和的，并且可含有0-3个选自N、S和O的杂原子，且各环可视情况经1-4个选自具有1-3个碳原子的烷基的取代基取代，或者两个或四个上述取代基一起形成一个或两个氧代基
或者R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成彼此稠合的两个环;
R5、R6和R8相同或不同并且选自氢和烷基;
R7为氢、烷基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、烯氧基或炔氧基;或
R6与R7或R7与R8连同吡啶环中的相邻碳原子一起形成5元或6元饱和或不饱和环，其可视情况含有氧或视情况烷基化的氮原子;
R10表示烷基、芳基、芳氧基和烷氧基;且
R9为药理学上可接受的巯基化合物的基团，其中所述巯基化合物是选自由以下物质组成的群组：N-乙酰基-半胱氨酸、青霉胺、硫代烷(烯)醇、硫代山梨糖醇、硫代甘油、硫代葡萄糖、硫代乙酸、硫代苹果酸、硫代聚氧乙醇、硫代聚烷氧乙醇、硫代尿嘧啶、硫代鸟苷、硫代组氨酸和巯乙酰替萘胺。
本发明还提供式IB化合物：
其中R1、R2、R3和R4相同或不同并且为氢、烷基、环烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、卤素、-CN、-CF3、-NO2、-COR10、烷硫基、烷基亚磺酰基、芳基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基，或者R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成一个或一个以上5元、6元或7元环，其各自可为饱和或不饱和的，并且可含有0-3个选自N、S和O的杂原子，且各环可视情况经1-4个选自具有1-3个碳原子的烷基的取代基取代，或者两个或四个上述取代基一起形成一个或两个氧代基
或者如果R1与R2、R2与R3或R3与R4连同苯并咪唑环中的相邻碳原子一起形成两个环，这些环可彼此稠合;
R5、R6和R8相同或不同并且选自氢和烷基;R7为氢、烷基、烷氧基、芳基、芳基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、烯氧基或炔氧基;或者
R6与R7或R7与R8连同吡啶环中的相邻碳原子一起形成5元或6元饱和或不饱和环，其可视情况含有氧或视情况烷基化的氮原子;且
R10表示烷基、芳基、芳氧基和烷氧基。
如本文所使用，术语“烷基”用于包括具有1到6个碳原子的直链和支链饱和烷基，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。更优选烷基含有优选1到4个碳原子，尤其甲基、乙基、丙基或异丙基。
如本文所使用，术语“烷氧基”也包括具有1到6个碳原子的直链和支链饱和烷基。
环烷基包括C3-6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所使用，术语“芳基”用于包括苯基、苯甲基、联苯基和萘基，并且可视情况经一个或一个以上C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、羰基、C1-C4烷氧羰基、C1-C4烷基羰氧基、硝基或卤基取代。
如本文所使用，术语“卤素”意谓氟、溴、氯或碘。
如本说明书上下文中所使用，“二硫键”意谓两个硫原子之间的任何共价键。
如本文中所使用，“胃肠保护”意谓预防和治疗胃肠病症，尤其胃肠炎症和损伤，诸如胃溃疡(Ulcus ventriculi)、十二指肠溃疡(Ulcus duodeni)、胃炎、由酸产量增加或药物引起的肠易激疾病、GERD、克罗恩病(Crohn′s disease)、IBD。所述病症可能是由(例如)微生物(诸如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori))、细菌毒素、药物(诸如某些消炎药和抗风湿药物)、化学物质(诸如乙醇)、胃酸或应激引起。
根据本发明，式I化合物是通过含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物在活体外或活体内反应形成。活体外反应可在不加入酸的情况下在水溶液、极性质子溶剂(诸如甲醇、乙醇、丁醇)或水与极性质子溶剂的混合物中发生。在一个实施例中，活体外反应是在水溶液中以PAC比药理学上可接受的巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比进行。可在不加入酸的情况下，通过将含有巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基的PAC与药理学上可接受的巯基化合物以PAC比药理学上可接受的巯基化合物为至少1∶2到1∶10的摩尔比以及视情况与一种或一种以上佐剂或赋形剂混合，在活体内制备式I化合物。在一个实施例中，PAC为干粉形式，其掺有也为干粉形式的巯基化合物。对个体投与混合物或干粉掺合物允许在活体内形成式I化合物。
所得式I化合物为水溶性的，并且可通过标准技术浓缩，所述技术诸如色谱(包括高效液相色谱(HPLC)、或柱色谱)、透滤或蒸发。或者，可根据标准技术从溶液中再结晶出式I化合物。
可根据本发明加以使用的PAC的实例为以下所示的通式B的质子泵抑制剂(PPI)：
其中
如上文所示，PPI的硫基可为巯基形式并且通过两个共价键与PAC结构的剩余部分键联。
PPI的结构和合成揭示于以下专利中，所述专利是以引用的方式并入本文中：奥美拉唑揭示于美国专利4,255,431和EP0005129中;潘托拉唑揭示于美国专利4,758,579和EP 166287中;兰索拉唑揭示于美国专利4,628,098和EP 174726中;雷米拉唑揭示于GB 2163737中;泰妥拉唑揭示于EP254588中;并且雷贝拉唑揭示于美国专利5,045,552中。
这些PPI都为经取代苯并咪唑并且具有相同的作用机制。其不同之处在于：在酸性条件下，质子化吡啶和苯并咪唑的氮导致形成具有末端硫醇基的四环亚磺酰胺，其为药物的活性形式，其在胃壁细胞表面与氢-钾ATPase酶系统上暴露的半胱氨酸残基结合形成抑制泵活性的共价二硫键。
其它PAC的结构和合成描述于如上文所述的文献中并且将为所属领域技术人员所知。
在本发明的特定实施例中，所使用的PAC为奥美拉唑，奥美拉唑异构体，诸如S-奥美拉唑、埃索美拉唑()、R-奥美拉唑、兰索拉唑、潘托拉唑、雷贝拉唑、帕瑞拉唑、雷米拉唑、泰妥拉唑和其异构体、医药学上可接受的盐或代谢物。
在本发明的特定实施例中，式(I)化合物具有结构(V)：
其中：
RA、RB和RC独立地表示氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C3-6环烷氧基、C1-6氟烷基或C1-6氟烷氧基;且RD表示氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6氟烷基或C1-6氟烷氧基，或卤素。
式(V)化合物包括下表1中所示的化合物。
表1-式(V)化合物
化合物 RA RB RC RD V1 CH3 OCH3 CH3 OCH3 V2 H OCH3 OCH3 OCHF2 V3 H OCH2CF3 CH3 H V4 H O(CH2)3OCH3 CH3 H V5 H OCH2CH(CH2)2 H F
与通常通过肠包衣或油包衣来防止酸不稳定PPI暴露于酸性条件的所有当前PPI调配物相比，如本文所揭示，本发明允许通过将PPI在活体外或活体内转化成二硫化物复合物来使其稳定。
本发明还提供适于以液体、凝胶、糊状物、粉末、片剂形式直接投与或者填充到胶囊中以供人类或动物使用的固体或液体形式的稳定、现成的经口或可注射投与的酸稳定PPI组合物。所述组合物还可视情况包含一种或一种以上佐剂或赋形剂。
本发明还提供包含一种或一种以上如上文所定义的式I化合物的组合物，例如本发明提供干粉、片剂或可注射调配物以用于在活体内制备如上文所定义的式I化合物，所述化合物具有一种或一种以上如上文所述的质子泵抑制剂和一种或一种以上如上文所述的巯基化合物。
根据本发明使用的PPI在胃中具有增加的对酸失活的防护并且能够直接有效地吸收到胃区中。本发明的组合物具有极高功效和生物可用性。
本文所涵盖的用于本发明中的PPI包括奥美拉唑，奥美拉唑异构体，诸如S-奥美拉唑、埃索美拉唑()、R-奥美拉唑、兰索拉唑、潘托拉唑、雷贝拉唑、帕瑞拉唑、泰妥拉唑、雷米拉唑和其异构体、其医药学上可接受的盐以及其代谢前药形式。然而，所属领域技术人员将理解，本发明不受此限制，而且可使用任何药理学上可接受的PPI。由PPI与巯基化合物反应产生的二硫化物化合物在胃部的酸性条件下稳定，并且当调配成固体剂型时，所述调配物无需经肠包衣。
US 6,093,743提及通过制备与苯并咪唑氮连接的可水解亚磺酰基或芳磺酰基或者包括与苯并咪唑氮形成曼尼希碱(Mannich base)的基团来产生“质子泵抑制剂前药”。申请者相信，所述花合物在酸性条件下仍不稳定。
PPI本身也归类为前药，其在投药后会变成具有末端硫醇基的四环亚磺酰胺，所述四环亚磺酰胺为药物的活性形式，其与壁细胞的分泌型膜中的H+/K+ATPase胃质子泵中的半胱氨酸残基结合形成抑制泵活性的共价二硫键。
最初认为这一结合过程是不可逆的，但现已了解，这一过程可在壁细胞中通过谷胱甘肽和其它内源还原剂逆转。本发明利用PPI与这些类型的还原剂可逆结合的能力，这一能力会导致产生具有增加的生物可用性的稳定质子泵抑制剂。
本发明适用于任何医药学上可接受的化合物(PAC)，其含有与药理学上可接受的硫醇化合物的巯基形成共价键的巯基、亚磺酰基、磺酰基或磺酰胺基。所得化合物或复合物在胃部的酸性条件下稳定，并且在组织吸收过程中与体内的相关酶或蛋白质经历二硫化物互换。
为描述可在体内与其它生物性巯基和二硫基迅速交换的二硫键形式的PAC的转运机制，本发明的发明者已创造出术语“拉链效应(Zipper Effect)”。尽管不希望受任一理论的束缚，但本发明的发明者相信，这一机制还暂时揭开动态可逆使得蛋白质二硫键脱离的路径。这一拉链效应引起改进的化学转运以及增加的有益生物化学物质的微循环或(尤其)扩散。其它简单硫化合物(诸如，N-乙酰基-半胱氨酸)通常也会破坏蛋白质二硫键并且用作稀释粘液的粘液溶解剂。另一实例是简单血浆含硫化合物谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的作用，其在动态平衡状态下充当血浆还原-氧化缓冲系统。
本发明的化合物使得可最优化适当的PAC/二硫化物化合物配对。相信二硫键形成和上文所提及的拉链效应的动态REDOX可逆性质明显促进生物可用性。本发明化合物中PAC和巯基含量提供由可逆二硫键形成而引起的改进的治疗益处。
如本文所揭示，本发明的化合物可在活体外作为调配物的部分形成，或者在活体内通过将未反应PAC和硫醇化合物并入调配物中来形成。
通常，在水性条件下，视情况在介于5到40℃之间的温度下，如本文前文所述的PAC可与如前文所述的硫醇化合物以介于1∶2到1∶10之间的摩尔比反应。所得化合物可为水溶性的。
可将本发明的二硫化物化合物或PAC和硫醇化合物并入典型医药组合物中，诸如液体、乳液、栓剂、溶液、膏药(例如，TTS)、凝胶、糊状物、散剂、片剂、颗粒、丸粒、胶囊、可注射物以及糖果和食品。根据本发明的化合物和组合物可通过任何途径(诸如，经口、不经肠、静脉内或经皮)投与。如所属领域技术人员所了解，供投药的适当途径将随病例的不同而变化。
本发明的组合物可包括通常用于人类和兽用药物调配物中的其它成分，其中例外为在制剂中引起或导致催化氧化反应的物质，诸如基于金属的颜料或染料。举例来说，香料和调味剂，诸如焦糖、胡萝卜、苹果、肉桂、香草等;着色剂，诸如批准的F&C染料、天然着色剂(诸如，β胡萝卜素和天然植物油着色成分)。(应注意，不应使用基于金属的颜料或染料，其可能会在制剂中引起催化氧化反应)。可加入天然甜味剂，诸如糖、固体糖蜜;人工甜味剂，诸如糖精、环己磺酸盐;REDOX缓冲剂，诸如抗坏血酸盐;pH值缓冲剂;防腐剂，诸如对羟基苯甲酸酯;抗氧化剂，诸如BHT、BHA;粘度剂和流变剂，诸如天然或合成蜡;以及医药学上可接受的稀释剂。
医药学上可接受的稀释剂的实例为去矿物水或蒸馏水;生理盐水;基于植物的油，诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachis oil)或椰子油;硅油，包括聚硅氧烷，诸如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷(polysolpoxane);挥发性聚硅氧;矿物油，诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷;纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素钠;低碳烷醇，例如乙醇或异丙醇;低碳芳烷醇;低级聚烷二醇或低级烷二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油;脂肪酸酯，诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯;聚乙烯吡咯烷酮;琼脂;角叉菜胶;黄芪胶或阿拉伯胶;和石油膏。通常，载剂将形成1重量%到99.9重量%组合物。
适于经口投与的调配物可以离散单元的形式提供，诸如各自含有预定量的活性化合物的胶囊、小袋、糖锭或片剂;散剂或颗粒剂;水性或非水性液体中的溶液或悬浮液;或者水包油或油包水乳液。所述调配物可通过任何适当的制药方法制备，所述方法包括使活性化合物与适当载剂(其可含有一种或一种以上如上文所述的副成分)缔合在一起的步骤。一般来说，可通过均匀且紧密地混合活性化合物与液体或细粉状固体载剂或者二者，且随后视需要使所得混合物成形(诸如)形成单位剂量来制备本发明的调配物。举例来说，可通过压缩或模制含有活性化合物和视情况一种或一种以上副组分的粉末或颗粒来制备片剂。可通过在适当机器中压缩自由流动的化合物(诸如视情况与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合的粉末或颗粒)来制备压缩片剂。可通过在适当机器中模制由惰性液体粘合剂所润湿的粉末状化合物来制得模制片剂。
经口投与的液体形式除上述试剂外还可含有液体载剂。适当的液体载剂包括水、油(诸如橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、红花油、花生油、椰子油)、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
适于经口腔(舌下)投与的调配物包括糖锭，其包含存于有利基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性化合物;和锭剂，其包含存于惰性基质(诸如，明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的化合物。
适于不经肠投与的本发明的组合物通常便利地包含活性化合物的无菌水性制剂，所述制剂可与预定接受者的血液等张。这些制剂通常是经静脉内投与，但投药也可借助皮下、肌肉内或真皮下注射实现。所述制剂可便利地通过将化合物与水或甘氨酸缓冲液混合并且使所得溶液无菌并与血液等张来制备。根据本发明的可注射调配物通常含有0.1%到60%(w/v)活性化合物并且以0.1毫升/分钟/公斤或适当的速率投与。不经肠投药为本发明化合物的优选投药途径。
适于直肠投与的调配物通常是以单位剂量栓剂的形式提供。这些调配物可通过将活性化合物与一种或一种以上常规固体载剂(例如，可可油)混合且随后使所得混合物成形来制备。
本发明的组合物还可包含一种或一种以上其它药理学活性成分。实例包括：镇定剂(例如苯并二氮呯类，例如地西泮(diazepam))、肌肉松弛药物(例如，比坦维林(bletamiverine)或卡米罗芬(camylofine))、抗胆碱能药物(例如，羟苄利明(oxyphencyclimine)或芬卡米特(phencarbamide))、局部麻醉药(例如丁卡因(tetracaine)或普鲁卡因(procaine))，视情况以及酶、维生素或氨基酸。举例来说，可将式I化合物与其它医药化合物组合使用，所述医药化合物可缓冲或中和胃酸或者抑制酸分泌，例如抗酸剂(诸如，氢氧化镁铝)、H2受体阻断剂(例如，西咪替丁(cimetidine)、雷尼替丁(ranitidine))、P-CAB抑制剂或胃泌素拮抗剂。适当的其它化合物在加合性或超加合性意义上说可增强式I化合物的主要作用，消除或减少副作用和/或获得更为迅速的起始作用时间。还可能与NSAID(诸如，阿司匹林(aspirin)、依托芬那酯(etofenamate)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、布洛芬(ibuprofen)或吡罗昔康(piroxicam))组合以防止由NSAID引起的胃肠损伤;或与抗菌物质(诸如，头孢菌素(cephalosporin)、四环素(tetracyclin)、盘尼西林(penicillin)、大环内酯(macrolide)、硝基咪唑(nitroimidazole)或其它铋盐)组合以控制幽门螺杆菌。本发明化合物的抗菌组合搭配物包括(例如)美洛西林(meziocillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、头孢噻吩(cefalothin)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢氨噻肟(cefotaxim)、伊米配能(imipenem)、庆大霉素(gentamycin)、阿米卡星(amicacin)、红霉素(erythromycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、甲硝唑(metronidazole)、克拉霉素(clarithromycin)、阿奇霉素(azithromycin)和其组合(例如，克拉霉素+甲硝唑，和阿莫西林+克拉霉素)。
除非文中需要另作说明，否则本说明书通篇和以下权利要求书中，词语“包含”和其变化形式应理解为暗含包括规定整数或步骤或者整数或步骤组在内，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤组。
本说明书中对于任何现有公开案(或源于其的信息)或任何已知物质的提及不能并且不应视作承认或许可或者任何形式提议所述现有公开案(或源于其的信息)或已知物质形式为本说明书所涉及的领域的一般常见知识的部分。
所属领域技术人员将了解，本文所述的本发明易经历与本文确切描述的内容不同的变更和修改。应了解，本发明包括所有所述变更和修改。本发明还包括本说明书个别或统一提及或描述的步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或两个以上所述步骤或特征的任何和所有组合。
现将参考以下非限制性实例描述本发明。
实例1
根据以下化学方程，具有-S=O亚磺酰基(氧化基)的质子泵抑制剂可与(例如)N-乙酰基半胱氨酸的巯基(还原基)反应：
其中PAC-S=O为PPI并且SH-C为N-乙酰基半胱氨酸分子或者氨基酸、肽或蛋白质上的半胱氨酸残基。PAC-S-S-C二硫化物共价键结产物在存在酸的情况下比初始PPI更为稳定。PPI通常对酸不稳定，产生活性较弱或者无活性的PPI代谢物。
这些化合物因二硫化物共价键的形成和脱离而处于动态平衡状态。
共价键结的PPI能够从一个配位位点转移到另一位点。因此复合物中一部分结合PPI将转移到其它细胞位点、血浆等，且一部分到达壁细胞膜，其在此与细胞质子泵半胱氨酸残基结合形成二硫键。
实例2
二硫化物互换可通过以下化学方程描述：
其中G-S-S-G为典型的谷胱甘肽二硫化物产物，其可与PAC-S-S-C二硫化物共价键结产物经历动态互换。
PAC可衍生自具有残基亚磺酰基的任何化合物，诸如PPI。
实例3
奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物复合物的活体外制备
奥美拉唑与N-乙酰基半胱氨酸的摩尔比通常应为最小1∶2但更通常为1∶2.5或更高。
20℃下，将140g N-乙酰基半胱氨酸和100g奥美拉唑加到260g水中，并且搅拌1小时，直到获得澄清溶液。反应略微放热。所述反应通常使温度升高到约40℃。较大的批量可能需要冷却以保持批料温度低于40℃。将奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物溶液存储于10℃以下。
当通过HPLC分析时，实例3中的二硫化物溶液样品展现，二硫化物化合物呈现比奥美拉唑更早的峰以及更短的保留时间。HPLC分析中所使用的参数如下：
仪器参数：
仪器：Waters HPLC
柱：Zorbax Eclipse C18，4.6×150mm
保护柱：C18
UV检测器波长：300nm
流动相组成：30份乙腈与70份磷酸盐缓冲液(pH 7.5)
流速：每分钟1毫升
运行时间：20分钟
注射体积：10微升
HPLC数据呈现于图1中并且相关保留时间数据展示于下表2中：
表2根据实例3制备的奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物溶液的HPLC数据
名称 RT 反应 面积 高度 量 单位 1 奥美拉唑/乙酰基半胱氨酸 复合物 1.5530 1.638e+007 16384742.4788 2254488.0040 2 奥美拉唑/乙酰基半胱氨酸 复合物 1.5534 1.639e+007 16386541.8949 2255204.7074 平均值 1.6 16385642.2 2254846.4
本文提及的其它质子泵抑制剂或PAC可用类似的方式制得。
这些实例中的二硫化物化合物可再结晶，或者通过HPLC或其它确立的技术回收，且随后调配成片剂、散剂、糊状物、胶囊、可注射物或其它剂型。
实例4
活体内形成奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物复合物的人类或兽用散剂调配物
奥美拉唑或奥美拉唑盐与N-乙酰基半胱氨酸的摩尔比通常应为最小1∶2但更通常为1∶2.5或更高。
将以下粉末状成分以所示比例混合在一起：
所有成分优选小于100目(粒径)
奥美拉唑 30g
(或其医药学上可接受的盐)
N-乙酰基半胱氨酸 30g
轻质氧化镁 40g
总计 100g
可在摄氏5度到摄氏15度下将干粉掺合物存储于密封容器中待用。
12个月后，当通过HPLC分析时，实例4的干粉掺合物的存储样品展现未反应的奥拉美唑峰以及未反应的N-乙酰基半胱氨酸峰，表明奥美拉唑未与N-乙酰基半胱氨酸反应。HPLC分析中所使用的参数如下：
仪器参数：
仪器：Waters HPLC
柱：Zorbax Eclipse C18，4.6×150mm
保护柱：C18
UV检测器波长：300nm
流动相组成：30份乙腈与70份磷酸盐缓冲液(pH 7.5)
流速：每分钟1毫升
运行时间：20分钟
注射体积：10微升
HPLC数据呈现于图2中并且相关保留时间数据展示于下表3中：
表3根据实例4制备的奥美拉唑、N-乙酰基半胱氨酸和轻质氧化镁的干粉掺合物的HPLC数据
名称 RT 反应 面积 高度 量 单位 1 N-乙酰基半胱 氨酸 1.4018 6.251e+006 6250647.0001 990517.4728 2 奥美拉唑 6.5976 4.008e+007 40077098.8191 2190088.453 5 平均值 4.0 23163872.9 1590303.0
如可从表3中看出，N-乙酰基半胱氨酸的典型保留时间为约1.40分钟。奥美拉唑的典型保留时间为约6.59分钟。如可从实例3表2中看出，奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物的典型保留时间为约1.56分钟。
可将干粉掺合物直接加到食物中，或者在使用前立即与水混合以制得稳定悬浮液以供经口或鼻管对人类或动物投药。
实例5
用于活体内形成二硫化物复合物的奥美拉唑加N-乙酰基半胱氨酸人类应用片剂的制备
将以下成分以所示比例混合在一起：
所有成分优选小于200目(粒径)
奥美拉唑 20mg
N-乙酰基半胱氨酸 40mg
轻质氧化镁 100mg
交联羧甲基纤维素钠 7.0mg
硬脂酸镁 3.0mg
和佐剂/赋形剂补足到 350mg.
将混合物压缩成每粒片剂350毫克重量的片剂，从而使各片剂含有标签指示的20毫克奥美拉唑。片剂无需肠包衣。
奥美拉唑转换为酸稳定奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物化合物是在活体内发生并且调配物无需肠包衣。
本文提及的其它质子泵抑制剂或PAC可以类似方式调配且随后调配成散剂、片剂、胶囊、糊状物、丸剂、颗粒剂、可注射物或其它剂型。
实例6
奥美拉唑加N-乙酰基半胱氨酸人类可注射物的制备
将以下成分以一定比例混合在一起以制成澄清溶液：
奥美拉唑 20mg
N-乙酰基半胱氨酸 70mg
注射用水 5ml
在摄氏0-5度下存储于棕色定量瓶(amber vial)中。
实例7
奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸马用糊状物的制备
将100克如实例3中制备的奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物溶液与2克黄原胶混合以制得糊状物。
生物实例
用马测试实例4、6和7中制备的样品。
所用方案是用马的晚餐将样品投与马，随后在接下来的20小时里使其不得饮用水。在15到19小时的过程中，取出胃液中的较小样品以测量pH值。
对照样品是以基于市售奥美拉唑油的产品和肠包衣产品执行。所有都是以每公斤马体重4毫克奥美拉唑的等效量给药。
基于奥美拉唑的 产品 15小时后胃液 的pH值 19小时后胃液 的pH值 Nil产品对照 5.2 2.8 基于市售油的糊 状物 5.1 4.9 市售肠包衣的糊 状物 4.8 4.7 实例4散剂 5.0 4.9 实例6可注射物 5.1 4.9 实例7糊状物 5.0 4.8
如对上述样品的测试所示，与市售油和肠包衣型产品相比，实例4的活体内类型的散剂调配物、实例6的活体外可注射物或者实例7的活体外调配物都展现充分的奥美拉唑-N-乙酰基半胱氨酸二硫化物的酸抑制活性。
新活性化合物 篇4：
高活性酚类化合物改性可发性酚醛树脂及其制备方法
第一、技术领域
本发明涉及高活性酚醛树脂的制备领域，具体涉及高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂的制备方法。
第二、背景技术
热固性酚醛树脂是由酚类化合物和醛类化合物在碱性催化剂的催化下通过缩合聚合反应制备的高聚物。热固性酚醛树脂、表面活性剂、发泡剂和固化剂等助剂混合均匀后在一定温度下经过熟化可以制得泡沫材料，该泡沫材料具有保温、阻燃性能、耐高温性能及隔音等优点，被广泛应用于建筑、汽车、船舶、航空器材、石油管道等领域。目前在酚醛泡沫在酚醛泡沫材料方面的研究较多。CN 103897125 A提供了一种腰果酚改性的含氮酚醛树脂，该技术生产的酚醛树脂结构中既包括腰果酚侧基，又含有N元素，克服了酚醛树脂的脆性，提高了酚醛树脂的耐高温性能、柔性及抗冲击性能。CN 102936325A提供了一种高固含可发性尿素改性酚醛树脂及其制备方法，该技术采用尿素改性酚醛树脂，降低了游离甲醛含量，同时尿素的加入代替了部分苯酚，降低树脂生产成本及树脂中的游离苯酚含量。CN 103214642 A提供了一种制备常温发泡酚醛树脂技术，该技术用胺类化合物(尿素或脲)改性酚醛树脂，制得低粘度、高活性的酚醛树脂，该改性的酚醛树脂与表面活性剂、发泡剂、醇类改性剂、胶粉、聚苯乙烯泡沫颗粒、固化剂常温环境中固化8-10分钟制得高性能防火保温板。
然而，目前生产的大部分酚醛树脂活性较低，固化成型时需要的酸性固化剂多且固化温度高，固化时间长。提高酚醛树脂的活性将是研究的重点。高活性酚类化合物改性酚醛树脂是在酚醛树脂分子中引入高活性酚类化合物。CN 102633968 A和CN 103146015 A都提高了一种高活性酚类单体改性酚醛泡沫的制备工艺，该工艺将酚醛树脂、高活性酚类(间苯二酚、间苯三酚和对苯二酚等)及发泡助剂共混均匀后发泡成型，该方法制备得到低密度、高闭孔、低酸性的酚醛泡沫，但是由于使用的高活性酚常温是固体，直接与树脂共混，均匀性差。
本发明将高活性酚类化合物在缩聚反应后期加入，碱性条件下与前期生成的羟甲基发生反应，同时也可以与残余的醛反应。高活性酚类化合物的引入，不但可以提高酚醛树脂的活性，而且树脂中的游离甲醛含量显著下降。制得的高活性酚醛树脂在低酸固化剂、低温下经固化反应制备酚醛泡沫保温材料，减少酚醛泡沫材料酸性固化剂在使用过程中对建筑墙体、石油管道等的腐蚀，并节约能源。
第三、发明内容
解决的技术问题为了解决现有技术中存在的酚醛树脂活性低，固化成型时需要的酸性固化剂多，固化温度高等问题，本发明利用高活性酚类化合物替代部分苯酚制备酚醛树脂，提高了酚醛树脂的活性，同时降低了固化剂用量、固化温度及固化时间，减少酚醛泡沫材料酸性固化剂对建筑墙体、石油管道等的腐蚀，并节约能源。
技术方案高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，树脂原料配方以质量份计，组成为：苯酚35～55份，高活性酚类化合物0.5～10份，醛类化合物15～40份，碱性催化剂0.5～5份，水10～30份。
所述高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，其特征在于所述高活性酚类化合物为间甲酚、对甲酚、邻甲酚、3，5-二甲酚或间苯二酚中的任意一种。
所述高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，其特征在于所述醛类化合物为多聚甲醛、乙醛、糠醛或水杨醛中的任意一种。
所述高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，其特征在于所述碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钠、碳酸钾或氧化钙中的任意一种。
所述高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，步骤为：
(1)将35～55份苯酚、0.5～5份碱性催化剂、10～30份水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至70～90℃，加入4～10份醛类化合物反应10～30分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入剩余的醛类化合物，分3～4次加入，控制反应温度70～90℃，反应30～60分钟;
(3)降温至55～75℃，加入0.5～10份高活性酚类化合物继续反应20～60分钟，冷却至40℃出料，制备出高活性类化合物改性的可发性酚醛树脂。
所述高活性酚类化合物改性可发性高固含酚醛树脂，其特征在于，制备的高活性酚醛树脂的固体含量为70%～85%。
有益效果
1.本发明用高活性酚类化合物替代部分苯酚，制备的酚醛树脂羟甲基含量增加，树脂活性得到提高;
2.本发明制备的酚醛树脂固化剂用量减少，固化温度降低，固化时间缩短;
3.本发明制备酚醛树脂过程树脂制备过程中无废水产生，避免了环境污染及能源浪费。
第四、具体实施方式
本发明实施例中的碱性催化剂氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡均为质量浓度为30wt%的水溶液。
下面结合具体事例，进一步阐明本发明的方案和效果，下述实施例中所述的份数均为质量份数。
实施例1
(1)将35g苯酚、0.5g氧化钙、10g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至70℃反应，加入4g多聚甲醛反应10分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入多聚甲醛11g，分3次加入，控制反应温度70℃，共缩聚反应30分钟;
(3)降温至55℃，加入0.5g间甲酚继续反应20分钟，冷却至40℃出料，制备出间甲酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
实施例2
(1)将55g苯酚、16.5g 30%(wt)Ba(OH)2溶液、20g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至90℃，加入10g糠醛反应30分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入糠醛30g，分3次加入，控制反应温度90℃，共缩聚反应60分钟;
(3)降温至75℃，加入10g对甲酚继续反应60分钟，冷却至40℃出料，制备出对加酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
实施例3
(1)将45g苯酚、7.5g 30%(wt)NaOH溶液、10g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至85℃，加入6g多聚甲醛反应20分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入多聚甲醛24g，分4次加入，控制反应温度85℃，共缩聚反应40分钟;
(3)降温至65℃，加入5g间苯二酚继续反应35分钟，冷却至40℃出料，制备出间苯二酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
实施例4
(1)将50g苯酚、3g碳酸钠、15g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至75℃，加入8g乙醛反应15分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入乙醛30g，分4次加入，控制反应温度80℃，共缩聚反应50分钟;
(3)降温至60℃，加入8g邻甲酚继续反应40分钟，冷却至40℃出料，制备出邻甲酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
实施例5
(1)将40g苯酚、4g碳酸钾、25g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至82℃，加入7g水杨醛反应25分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入15g糠醛，分3次加入，控制反应温度90℃，共缩聚反应55分钟;
(3)降温至62℃，加入2g 3，5-二甲酚继续反应25分钟，冷却至40℃出料，制备出3，5-二甲酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
实施例6
(1)将38g苯酚、6g 30%(wt)KOH溶液、13g水加入到带有冷凝管的四口烧瓶中，升温至87℃，加入5g多聚甲醛反应17分钟;
(2)向(1)反应的混合液中加入多聚甲醛20g，分4次加入，控制反应温度78℃，共缩聚反应45分钟;
(3)降温至72℃，加入3.5g间苯二酚继续反应45分钟，冷却至40℃出料，制备出间苯二酚改性的可发性酚醛树脂。
树脂基本性能及固化工艺条件见附表1。
附表1不同配方的高活性可发性酚醛树脂及固化工艺条件
上述酚醛树脂及其泡沫材料的检测：羟甲基含量按GB/T14074-2006的规定检测;固体含量按GB/T14074-2006的规定检测;压缩强度按GB 8813-2008规定测试;弯曲强度按GB 8812-2007规定测试。
