一种球花含笑种子生活力的测定方法
技术领域
本发明涉及种子发芽能力的测定技术领域，具体涉及一种球花含笑种子生活力的测定方法。
背景技术
球花含笑是木兰科含笑属的一种常绿乔木，是国家二级保护植物，被列入《全国珍贵树种培育基地建设工程规划》的乡土树种。球花含笑的树姿优美，花香宜人，树叶、聚合果亦各具特色，是一种观赏价值很高的园林绿化树种。球花含笑具有生长速度快，适应性、抗旱性、抗寒性、吸尘、抗污染性强等特点，可作为重要的常绿、芳香、环保类优质绿化树种。随着球花含笑在绿化产业中的作用日益突出，人们对其利用和新品种培育日益得到重视。但球花含笑种皮坚硬，对水分的吸收和呼吸代谢有禁锢作用，是中度复杂型形态生理休眠的低度顽拗型种子，具有深度休眠的特性，种子萌发率普遍很低，且由于种子的多态性，种子休眠程度不一，萌发也存在差异，因此在播种之前对种子进行活力检测，对指导播种生产等具有重要的意义。
种子生活力是指种子能够萌发的潜在能力或胚的生命力。种子的生活力是种子质量的重要指标，在作物育种、种子生产、种子加工等工作中具有重要意义。四唑(TTC)测定是目前广泛应用的种子生活力测定的最重要的方法，但是TTC方法在实际操作中存在很多问题，首先由于具体方法选择或者某些关键环节的操作不当等原因，致使测定值远低于真实值，如在TTC方法中，如果染色时间和种子处理时间掌握不好，测定的结果比真实值低；其次，在具体的某些关键的步骤都给出一个范围，如，浸种和染色的时间3～8h，对于具体的物种可能会不一样。因此，在种子生活力的测定中，对于具体的物种，测定方法选择，关键步骤等方面都应该根据具体种子的特性，作出相应的改变，形成一套具体而有效的方法。研究发现TTC测定技术迄今为止工作比较集中于水稻、小麦、玉米等粮食作物，但现在对于球花含笑种子四唑染色方法并未有明确的操作流程及评判标准。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种球花含笑种子生活力的测定方法，本发明的测定方法对球花含笑种子生活力的检测快速、准确。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种球花含笑种子生活力的测定方法，包括以下步骤：
1)人工清理种子的红色假种皮得到纯净的种子；
2)将纯净的种子进行预湿处理得到预湿后的种子；
3)将所述预湿后的种子去除内果皮并在种子两侧各切去2～6mm胚乳，得到待染色的种子；
4)将待染色的种子置于四唑染色溶液中进行染色处理得到染色后的种子，所述染色在黑暗条件下进行，所述染色的温度为28～32℃，所述染色时间为20h～72h；
5)将染色后的种子沿胚剖开，当胚均匀染成红色且胚乳染成红色时，则表明种子有活力。
优选地，所述的四唑染色溶液质量分数为0.5％～1.2％。
优选地，所述预湿处理包括以下步骤：将所述纯净的种子置于100％相对平衡湿度的环境中，放置12h～72h，然后置于17℃～23℃、0.8～1.2％琼脂培养基上吸水8h～36h，得到预湿后的种子。
优选地，步骤1)的人工清理为人工搓揉所述种子。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种球花含笑种子生活力的测定方法，该染色方法将球花含笑种子处理后于四唑染色溶液中进行染色处理，传统萌发实验技术测定球花含笑种子生活力要大于1个月时间，且萌发实验会因种子休眠，萌发条件等原因而低估种子的真实生活力，本发明用40～180h即可完成，本发明能够快速的测定球花含笑种子生活力。本发明选用适宜的染色条件，如预湿时间、染色液浓度、染色温度、染色时间等，染色效果大幅提高，进而提高了测定球花含笑种子生活力的准确性。本发明通过对人工清理种子的红色假种皮、预湿处理、预湿后的种子处理、四唑染色溶液浓度及浸泡时间的最优化筛选，明确了球花含笑种子TTC染色方法及染色后不同情况的判断，该测定方法对有效地检测球花含笑种子生活力具有重大的指导意义。
附图说明
图1为实施例1处理后的种子，胚与胚乳染为均匀红色的照片；
图2为实施例2处理后的种子，胚均匀染为红色，胚乳染为不均匀红色的照片；
图3为对比例7处理后的种子，胚未染色，胚乳染为不均匀红色的照片；
图4为对比例5处理后的种子，胚与胚乳染为不均匀红色的照片；
图5为对比例8处理后的种子，胚呈深红色略发黑且胚乳染为红色的照片；
图6为对比例9处理后的种子，胚未染色，胚乳染为不均匀红色的照片。
具体实施方式
本发明提供了一种球花含笑种子生活力的测定方法，包括以下步骤：
1)人工清理种子的红色假种皮得到纯净的种子；
2)将纯净的种子进行预湿处理得到预湿后的种子；
3)将所述预湿后的种子去除内果皮并在种子两侧各切去2～6mm胚乳，得到待染色的种子；
4)将待染色的种子置于四唑染色溶液中进行染色处理得到染色后的种子，所述染色在黑暗条件下进行，所述染色的温度为28～32℃，所述染色时间为20h～72h；
5)将染色后的种子沿胚剖开，当胚均匀染成红色且胚乳染成红色时，则表明种子有活力。
在本发明中，人工清理种子红色假种皮。在本发明中，所述人工清理为人工搓揉所述种子，在本发明具体实施过程中，优选的将所述种子置于筛网上，用橡胶手套搓揉，然后在流水下洗去红色的假种皮，得到纯净的种子。在本发明中，所述种子优选为成熟饱满的种子。所述的筛网优选为直径21.1～21.5cm，深5.5cm，孔径2.5～3.5mm，所述的揉搓力度优选为轻柔，所述的搓揉力度通过双手挤压一张A4纸来衡量，双掌挤压纸张，纸张不能够被轻易抽走，但又不会损伤纸张的挤压力量方式来衡量。本发明去掉红色假种皮，达到了防止种子霉变死亡的目的。本发明中清理种子红色假种皮的方式既保证了种子清理地干净，又不会对种子造成伤害而降低种子活力。本发明对所述种子的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售种子即可。
在本发明中，将纯净的种子进行预湿处理时，所述预湿处理的具体步骤优选为：将所述纯净的种子置于100％相对平衡湿度的环境中，放置12h～72h，然后置于17℃～23℃、0.8～1.2％琼脂培养基上吸水8h～36h，得到预湿后的种子。所述100％相对平衡湿度的环境温度优选为20℃，所述放置的时间进一步优选为24h，所述吸水时间进一步优选为16h。本发明对纯净种子的预湿处理，促进了种子生理生化反应，加快了种子呼吸，使种子更容易与四唑溶液反应。
在本发明中，将预湿后的种子去除内果皮并在种子两侧各切去2～6mm胚乳。在本发明中，所述去除内果皮优选采用钳子挤压至种子出现裂缝，然后用刀子剥去内果皮，本发明将预湿后的种子去除内果皮并在种子两侧各切去2～6mm胚乳，使四唑染色溶液更容易渗入，缩短染色时间。
在本发明中，所述的四唑染色溶液的质量分数优选为0.5％～1.2％，更优选为1％，所述的四唑染色溶液配制方法为：称取0.5～1.2g TTC药粉，置于95～120mL的蒸馏水中溶解，所述染色的温度优选为28～32℃，进一步优选为30℃。所述的染色时间更优选为48～72h。本发明对四唑染色溶液配制方法没有限定，采用本领域技术人员所熟知的配制方法即可。本发明对四唑染色溶液的来源没有限定，采用本领域技术人员熟知的四唑染色溶液即可。
在本发明中，当胚均匀染成红色且胚乳均匀染成红色时，或者当胚均匀染为红色且胚乳染成不均匀红色时，上述两种染色情况均可视为种子有活力；当胚未染成红色、胚未均匀染成红色、胚均匀染成红色且胚乳未染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚未染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚呈深红色略发黑且胚乳染为红色时均视为种子无活力。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
采集成熟饱满带有红色假种皮的球花含笑种子，将所述的球花含笑种子置于筛网上，用橡胶手套轻轻的搓揉，在流水下洗去红色的假种皮，得到纯净的种子；将纯净的种子置于100％相对平衡湿度，20℃的环境中，放置72h，然后置于20℃，1％琼脂培养基上吸水24h，得到预湿后的种子；将预湿后的种子剥去黑色内果皮，并在种子两侧各切去2～6mm胚乳，得到待染色的种子；将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中24h，取出种子沿胚剖开，观察胚和胚乳的颜色；
当胚均匀染成红色且胚乳均匀染成红色时，或者当胚均匀染为红色且胚乳染成不均匀红色时，上述两种染色情况均可视为种子有活力；当胚未染成红色、胚未均匀染成红色、胚均匀染成红色且胚乳未染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚未染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚呈深红色略发黑且胚乳染为红色时均视为种子无活力。
本实施例中，每个试验组种子总数为25粒，观察统计染色后的种子，并计算具有种子生活力的百分率，种子生活力百分率＝有活力种子/实验种子总数×100％。
实施例2
本实施例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中48h，其他处理步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中72h，其他处理步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.5％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中72h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例1
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中24h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例2
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中48h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例3
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中72h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例4
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中96h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例5
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.5％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中24h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例6
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.5％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中48h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例7
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为0.5％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中96h，其他处理方法与实施例1相同。
对比例8
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中96h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例9
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将预湿后的种子不剥去黑色内果皮，仅在种子两侧各切去2～6mm胚乳；将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中24h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例10
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将预湿后的种子不剥去黑色内果皮，仅在种子两侧各切去2～6mm胚乳；将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中48h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例11
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将预湿后的种子不剥去黑色内果皮，仅在种子两侧各切去2～6mm胚乳；将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中72h，其他处理步骤与实施例1相同。
对比例12
本对比例的球花含笑种子生活力测定方法与实施例1的不同之处为：将预湿后的种子不剥去黑色内果皮，仅在种子两侧各切去2～6mm胚乳；将待染色的种子置于质量分数为1％四唑染色溶液中浸泡后，置于30℃黑暗培养箱中72h，其他处理步骤与实施例1相同。
实施例1～4、对比例1～12的不同种子生活力测定方法对种子生活力的影响以及种子染色情况见表1。
实施例1～4、对比例1～12的不同种子生活力测定方法及效果见表2。
表1不同测定方法的球花含笑种子生活力及染色情况结果
由表1可知，当胚均匀染成红色且胚乳均匀染成红色时，或者当胚均匀染为红色且胚乳染成不均匀红色时，上述两种染色情况均可视为种子有活力；当胚未染成红色、胚未均匀染成红色、胚均匀染成红色且胚乳未染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未均匀染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚未染成红色且胚乳均匀染成红色、胚未染成红色且胚乳染成不均匀红色、胚呈深红色略发黑且胚乳染为红色时均视为种子无活力。
表2不同测定方法的球花含笑种子生活力的结果
由表2可以看出四唑染色溶液浓度低于0.5％则不能正常染色，会降低球花含笑种子生活力的测定，不利于球花含笑种子生活力的测定；当四唑染色溶液浓度为0.5％时染色时间不少于72h，当四唑染色溶液浓度为1％时染色时间为24h～72h，则有利于球花含笑种子生活力的测定，继续延长染色时间则会降低种子生活力的测定。未剥去内果皮仅在种子两侧切去2～6mm，四唑染色溶液不能正常渗入种子进行充分染色，染色效果差，引起降低种子生活力的测定。
实施例5
将实施例2～3中采集的种子进行萌发试验，统计萌发种子总数并对最后未萌发的种子进行剪切试验，判断种子未萌发原因，实验持续2个月。每个培养皿播种20粒种子，重复3次。在本实施例中对所述的种子萌发方法没有特殊限定，采用本领域熟知的种子萌发方法即可，萌发率＝发芽种子总数/(播种总数-虫蛀种子数量-空瘪种子数量)，具体试验结果见表3:
表3球花含笑种子萌发率结果与种子平均生活力百分率的对比结果
由表3可以看出，本发明通过种子萌发试验的方法与本发明提供的方法所测得种子生活力百分比相近，说明本方法准确有效，且更加快速简便。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
