一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因及其应用。
背景技术
胰蛋白酶(Trypsin)属于丝氨酸蛋白酶家族，以酶原前体(Pre-trypsinogen)形式在动物胰脏产生，是脊椎动物消化道中一种主要的蛋白水解酶，去掉信号肽变成胰蛋白酶原，后经肠腔由肠激酶激活而生成有活性的胰蛋白酶，其功能主要是消化食物中蛋白质；激活其他酶原如(糜蛋白酶原、梭肤酶原、弹性蛋白酶原)。
昆虫胰蛋白酶由中肠肠壁细胞产生分泌进人中肠，主要在取食期的幼虫中肠中被检测到，是昆虫碱性中肠环境中主要的一种丝氨酸蛋白酶，在蛋白的消化和Bt毒素的毒性调节中起重要作用。其分泌及激活机制尚未十分明确，故多将其称为胰蛋白酶样酶(Trypsin-Like proteinase)，但具有与脊推动物胰蛋白酶相同的活性位点及特异性作用底物。一般来说，昆虫胰蛋白酶原的长度为256个氨基酸，有活性的胰蛋白酶的长度为232个氨基酸，昆虫胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族，所以它具有丝氨酸蛋白酶的保守序列：a：活性位点含有在所有丝氧酸蛋白酶中都保守的His、Asp和Ser催化三联体区域来激活其他酶原(GDSGGP和TAAHC)；b：底物结合位点Asp182(在不同昆虫中位置稍有不同)也是保守的，通过电荷作用而定底物裂解位点的或残基。c：胰蛋白酶N末端的氨基酸序列为Ile-Val-Gly-Gly。d：昆虫胰蛋白酶的二硫键为3个。随着基因克隆技术的飞速发展，胰蛋白酶的分子生物学研究进入了一个新的阶段。很多昆虫如(果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyxmori、埃及伊蚊Aedes aegypti、烟草天蛾Manduca sexta和美国牧草盲蝽Lyguslineolaris)胰蛋白酶被克隆，并对其序列进行了详尽的研究。但是目前有关于小菜蛾胰蛋白酶相关基因还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因。
本发明的第二个目的在于提供一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9蛋白。
本发明的第三个目的在于提供所述Trypsin-9基因和胰蛋白酶Trypsin-9的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明首先从小菜蛾中肠中克隆得到了一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列大小为820bp。其所编码的小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，序列长度为258aa。
本发明还提供含有Trypsin-9基因的重组表达载体。
优选地，所述重组表载体中含有去除Trypsin-9基因信号肽之后的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述重组表达载体为pET-32a-Trypsin-9，用于表达重组蛋白Trypsin-9。
本发明还提供抑制Trypsin-9表达的RNAi载体。
优选地，所述RNAi载体为L4440-Trypsin-9。
本发明还提供含有所述重组表达载体或RNAi载体的重组菌或细胞系。
优选地，含有所述重组表达载体的细菌为大肠杆菌BL21，含有RNAi载体的为HT115(DE3)菌株。
本发明研究表明，将表达的不同浓度重组蛋白Trypsin-9和BtCry1Ac原毒素添食小菜蛾后，测定BtCry1Ac原毒素的活化及小菜蛾的死亡率，发现随着添食Trypsin-9浓度的增加，BtCry1Ac原毒素的活化在增加，小菜蛾的死亡率随之升高。反之，将Trypsin-9蛋白的多克隆抗体(anti-Trypsin-9)和BtCry1Ac原毒素添食小菜蛾后，BtCry1Ac原毒素活化降低，小菜蛾的死亡率降低。说明Trypsin-9对BtCry1Ac原毒素具有活化快速使小菜蛾致死的作用，增强Bt蛋白对小菜蛾的杀虫活性。
同时，本发明还高效沉默小菜蛾Trypsin-9基因表达。将沉默Trypsin-9基因的特异性序列导入到L4440表达载体，获得L4440-Trypsin-9，转到HT115菌株中进行表达，将重组表达沉默Trypsin-9基因的特异性序列的HT115与饲料混合，饲喂小菜蛾。成功沉默Trypsin-9基因在小菜蛾中肠中的表达后，添食BtCry1Ac原毒素，发现有活性的Cry1Ac毒素降低。同时导致小菜蛾对取食营养的消化降低，降低了对食物营养的吸收，而发生畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。表明Trypsin-9蛋白在小菜蛾中肠中起着活化Cry1Ac原毒素及其它营养蛋白释放便于吸收的小肽的作用，可以作为新型生物防治的分子靶标，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。
因此，本发明提供所述Trypsin-9基因或所述蛋白酶Trypsin-9在提高Cry1Ac原毒素对十字花科蔬菜害虫毒性中的应用。
还提供所述Trypsin-9基因或所述蛋白酶Trypsin-9或其RNAi载体在降低十字花科蔬菜害虫中肠对营养蛋白的消化，降低害虫营养吸收中的应用。
还提供所述Trypsin-9基因或所述蛋白酶Trypsin-9作为十字花科蔬菜害虫防治靶点的应用。
还提供所述Trypsin-9基因或所述蛋白酶Trypsin-9在防治十字花科蔬菜害虫或制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用。
具体地，所述防治将蛋白酶Trypsin-9和Cry1Ac原毒素共同喂食十字花科蔬菜害虫，可增加BtCry1Ac原毒素的活化及活力，提高杀虫活性，增加Cry1Ac毒素对害虫的致死率。或将小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9的RNAi重组细菌喂食十字花科蔬菜害虫，当害虫吃到带有沉默Trypsin-9基因表达的dsRNA的重组细菌时，降解或者阻断小菜蛾Trypsin-9的翻译，致使害虫体内的Trypsin-9蛋白显著降低，降低对食物营养的吸收，而发生畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。
本发明还提供一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9和BtCry1Ac原毒素。
优选地，所述Trypsin-9为重组Trypsin-9蛋白，是将去除信号肽的Trypsin-9基因编码序列，连接到表达载体，获得重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统诱导表达小菜蛾Trypsin-9，用His-tag层析柱一步纯化上清表达的重组蛋白，然后使用超滤管进行去离子浓缩得到重组蛋白。
本发明还提供另外一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含抑制Trypsin-9基因表达的制剂。
优选地，所述制剂为小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9的RNAi重组细菌，将胰蛋白酶Trypsin-9的基因或者功能区域编码导入到相应的RNAi载体，如L4440中，表达出沉默Trypsin-9基因表达的dsRNA，在害虫吃到带有沉默Trypsin-9基因表达的dsRNA的HT115细菌时，降解或者阻断小菜蛾Trypsin-9的翻译，致使害虫体内的Trypsin-9蛋白显著降低，导致小菜蛾对取食蛋白的降解和消化，导致害虫缺乏营养而畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。
优选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白酶Trypsin-9的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明研究表明Trypsin-9在小菜蛾中肠对Cry1Ac原毒素的活化起着重要的作用，添食Trypsin-9可以显著提高小菜蛾中肠液Bt Cry1Ac原毒素的活化，小菜蛾死亡率显著升高；而沉默小菜蛾Trypsin-9基因在中肠中的表达后，会降低了小菜蛾中肠对食物的消化，导致化蛹畸形，表明Trypsin-9可以作为新型生物防治的分子靶标，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中Trypsin-9表达的SDS-PAGE和western blot检测。注：A:M：蛋白Marker；1.未经IPTG诱导的pET-32a-Pxtrypsin-9的重组蛋白；2.IPTG诱导的pET-32a-Pxtrypsin-9的重组蛋白；3.经IPTG诱导的pET-32a-Pxtrypsin-9的蛋白沉淀；4.经IPTG诱导诱导的pET-32a-Pxtrypsin-9的蛋白上清；5-6：500mM咪唑洗脱的纯化蛋白。B：Westernblot分析，M：蛋白Marker；1-5：不同浓度蛋白的Western blot。
图2为本发明实施例中小菜蛾中肠液水解Cry1Ac原毒素的水解分析。M：180kDa蛋白Marker；1：小菜蛾中肠液(0.3mg/mL)；2-7小菜蛾中肠液(浓度分别占原毒素浓度的0.01％、0.1％、1％、10％、100％、200％)与Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)等体积孵育；8：Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)。
图3为Cry1Ac诱导后小菜蛾中肠酶液对Cry1Ac原毒素的水解。注：B：M：Marker；1：Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)；2-4：CK组小菜蛾中肠液(浓度分别占Cry1Ac原毒素浓度0.01％、0.1％、200％)与Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)等体积孵育；5：对照组中肠液(0.3mg/mL)；6-8：Cry1Ac诱导24h后的小菜蛾中肠液(浓度占Cry1Ac原毒素浓度0.01％、0.1％、200％)的与Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)等体积孵育；9：侵染Cry1Ac原毒素24h后小菜蛾中肠液(0.3mg/mL)。
图4为RNAi后小菜蛾中肠液水解Cry1Ac原毒素的水解分析。注：M：Marker；1-3：分别为饲喂dsGFP24h后小菜蛾中肠液(浓度占Cry1Ac原毒素浓度的0.01％、0.1％、200％)与Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)等体积孵育；4：饲喂dsGFP24h中肠液；5-7：分别为饲喂dsRNA-PxTrypsin-9后小菜蛾中肠液(浓度占Cry1Ac原毒素浓度的0.1％、1％、200％)与Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)等体积孵育；8：饲喂ds RNA-PxTrypsin-9 24h中肠液；9：Cry1Ac原毒素(0.3mg/mL)。
图5为小菜蛾存活率统计结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1小菜蛾Trypsin-9基因的CDS片段的克隆
利用Trizol法提取小菜蛾中肠的总RNA，反转录合成cDNA的一条链，并以此为模板进行PCR克隆，包含全部CDS区域的目的基因的引物序列为F：5’-AGCATAATTCAAATTCAGTTACC-3’,R：5’-AACATTTCTCCTACGCGTTTGTG-3’；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，经分析其序列大小为820bp。回收得到的PCR产物连接到pMD18-T载体中，并将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，将阳性克隆菌株送去测序鉴定。将测序鉴定正确的菌株以甘油菌保存于-80℃。
实施例2小菜蛾Trypsin-9基因的原核表达及重组蛋白纯化
将上述获得cDNA为模板进行PCR克隆，根据小菜蛾Trypsin-9基因的ORF序列设计一对特异性扩增引物，并引入酶切位点EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)，Trypsin-9基因的引物序列为F：5’-CGGAATTCAGGATTGTGGGTGGATCCGC-3’(下划线表示设计的EcoRI酶切位点)；R：5’-CCAAGCTTCGCGTTTGTGCGAATCCAGT-3’(下划线表示设计的HindIII酶切位点)。以带有Trypsin-9CDS片段重组质粒为模板，进行PCR扩增，得到Trypsin-9基因表达片段。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，回收得到的PCR产物与pET-32a空载体用EcoRI和HindIII同样进行双酶切，构建表达质粒建pET-32a-Trypsin-9，感受态细胞DH5α中，抽提质粒EcoRI和HindIII双酶切鉴定，将测序正确的菌株以甘油菌的形式保存。
将表达质粒pET-32a-Trypsin-9转进表达宿主菌BL21中，利用0.6mM IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达，结果如图1。由图1可知，蛋白获得高效表达。利用Ni-NTA Sefinose Resin对融合蛋白进行一步纯化。SDS-PAGE电泳及WB检验，结果如图1所示。获得的重组蛋白Trypsin-9大小为45kDa(Trx·Tag约12kDa，2个His·Tag共约1.6kDa，S·Tag约1.7kDa，目的片段约29kDa)与结果相符。经Ni-NTASefinose Resin纯化后，得到了纯度较高的Trypsin-9重组蛋白，浓度约为1mg/mL。
实施例3不同浓度小菜蛾中肠酶液降解Cry1Ac原毒素
1、Cry1Ac原毒素的提取
本实验以Bt HD-73菌株为材料提取Cry1Ac的原毒素蛋白，具体步骤如下：
(1)从HD-73菌株菌落平板上挑取单菌落，在LB液体培养基上过夜活化(30℃，200rpm)。
(2)以1:100的比例转接至1/2LB液体培养基(LB培养基中酵母粉减半)上(30℃，200rpm，36h)震荡培养，得到晶体营养体混合物。
(3)用PBS清洗两遍，裂解液裂解，4℃，3000rpm离心30min。
(4)上清用NaNc-HAc等电点沉淀，再离心(4℃，3000rpm，30min)
(5)得到的沉淀为晶体蛋白，溶于溶解液中。提取的原毒素测定浓度为分装后置于-80℃保存备用。
2、利用BCA法测定原毒素蛋白浓度：
(1)按照样品个数，每个样品配制200mL BCA工作液，配制比例为A:B＝50:1，充分混匀。
(2)将标准品按照0、1、2、4…20μL加到96孔板中，加PBS将标准品补充到20μL。Cry1Ac原毒素蛋白液取20μL加入到96孔板中，做三个重复。
(3)每个孔加入200μL BCA工作液，37孵育30min。
(4)利用酶标仪测A595值，并根据标准品值绘制标准曲线，算出原毒素蛋白浓度。
3、将提取的原毒素浓度设定为(0.3mg/mL)，将中肠液浓度稀释为毒素Cry1Ac浓度的200％、100％、10％、1％、0.1％、0.01％，上述不同浓度中肠液分别与原毒素等体积混合、0.15M NaCl2与Cry1Ac原毒素等体积混合，以及小菜蛾的中肠液(0.3mg/mL)，37℃孵育1h。为了更直观的观察小菜蛾中肠蛋白酶对Cry1Ac原毒素的水解进程，我们将不同浓度小菜蛾中肠液与Cry原毒素进行等体积孵育，SDS-PAGE电泳检测，如图2所示，在37℃孵育1h后，随着小菜蛾中肠酶液的浓度升高，与其孵育的Cry1Ac原毒素(～130KDa)被逐渐消化为～50KDa的活化毒素。当蛋白酶酶浓度与毒素浓度比为1:1和2:1时，活化毒素条带明显变弱，说明活化毒素已发生降解。
实施例4Cry1Ac诱导后小菜蛾中肠酶液降解Cry1Ac原毒素的分析
将提取的原毒素浓度稀释为(0.3mg/mL)，将Cry1Ac处理24h和CK处理的中肠液浓度稀释为毒素Cry1Ac浓度的200％、100％、0.1％、0.01％，上述不同浓度中肠液分别与原毒素等体积混合、0.15M NaCl2与Cry1Ac原毒素等体积混合，以及Cry1Ac处理组和CK组小菜蛾的中肠液(0.3mg/mL)37℃水浴1h。结果如图3所示。
由图3可知，在相同浓度下Cry1Ac处理后的中肠液活化和消解毒素能力与对照相比，明显减弱。小菜蛾中肠液能够将Cry1Ac原毒素活化为有活性的毒素蛋白，而Cry1Ac侵染小菜蛾后，胰蛋白酶表达量呈现下降趋势，说明胰蛋白酶在Cry1Ac原毒素的活化起重要作用。
实施例5小菜蛾Trypsin-9的RNA干扰载体的构建
以含有Trypsin-9基因片段的cDNA为模板，设计一对带有酶切位点(Xho I和BglII)的特异性引物(L4440-Trypsin-9F:GGCAGATCTGGAGGATTGTGGGTGGAT和L4440-Trypsin-9R:CGACTCGAGGTCTGATGTTCTGGTAGCG)对Trypsin-9蛋白的功能区(氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)扩增同时根据GFP基因设计一对引物GFP-F：GGCAGATCTAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG，GFP-R:CGACTCGAGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTC，利用高保真酶KOD PLU在25μL体系中进行扩增。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，回收PCR产物，用Xho I和Bgl II进行双酶切，回收酶切产物，放-20℃备用。
将保存的L4440空质粒的甘油菌接种于5mL的LB液体培养基中，放置于37℃，240rpm/min的摇床中过夜培养种子菌。将过夜培养的种子菌按1:100的比例分别接种于4mL含有Amp+(100mg/L)和Tet+(100mg/mL)双抗性的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD600值为0.6左右后提取质粒，质粒用Xho I和Bgl II进行双酶切切胶纯化回收。
将Trypsin-9基因酶切回收产物与L4440酶切回收产物进行连接，反应体系如下：酶切后L4440质粒，3L；Trypsin-9表达片段，14L；T4 DNA Ligase，1L；T4DNA LigaseBuffer，2L；16℃生化培养箱中过夜连接。
将连接产物L4440-Trypsin-9转化到大肠杆菌感受态细胞DH 5α中，摇菌，抽提质粒。用Xho I和Bgl II进行双酶切鉴定，将菌体送广州艾基生物技术有限公司测序，将测序正确的菌体保存甘油菌，-80℃保存备用。
将带有L4440-Trypsin-9表达质粒的重组菌株HT115(DE3)，接种于含有Amp+(100mg/L)和Tet+(100mg/mL)双抗性的LB液体培养基中，37℃、240rpm/min摇菌6h，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h。将菌体离心12000rpm/min离心1min，收集菌体入液氮，研磨，研磨完全后，加入1000μL RNAiso Plus，以L4440空载体对照作为对照，同样进行RNA抽提，DNA凝胶电泳检测。
Trypsin-9RNA的饲喂。将带有L4440-Trypsin-9质粒转进HT115，进行培养，IPTG诱导后，收集菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：250。挑选龄期一致的健康4龄幼虫小菜蛾进行饲喂实验，每个处理100头，三个重复。饲料配制方法：将制备好的菌体，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，饲喂L4440-GFP为阴性对照，将小菜蛾幼虫人工饲料饲养24h。一部分解剖取小菜蛾的中肠液，进行检测对Cry1Ac的活化。一部分检测RNA效果。
RNAi结果。利用饲喂法对小菜蛾进行RNAi实验，实验中发现饲喂Trypsin-9基因dsRNA的小菜蛾幼虫大多数不能成功化蛹，少数即使化蛹也出现畸形，个体瘦小，营养发育不良。而饲喂L4440空载体dsRNA的小菜蛾4龄幼虫能正常发育，没有黑化，成功羽化，表明可以通过沉默小菜蛾Trypsin-9干扰其个体发育，降低存活率。
实施例6Trypsin-9RNAi后小菜蛾中肠酶液降解Cry1Ac原毒素的能力
为了进一步检测Trypsin-9在原毒素的活化过程中的作用，将提取的原毒素浓度稀释为(0.3mg/mL)。将饲喂L4440-Trypsin-9和L4440-dsGFP的小菜蛾中肠液浓度稀释为毒素Cry1Ac浓度的200％、100％、0.1％、0.01％，上述不同浓度中肠液分别与原毒素等体积混合、0.15M NaCl2与Cry1Ac原毒素等体积混合，以及L4440-Trypsin-9和L4440-dsGFP的小菜蛾中肠液(0.3mg/mL)，37℃水浴1h。结果如图4，我们发现将RNAi处理24h(饲喂L4440-Trypsin-9和L4440-dsGFP)的小菜蛾中肠液分别与Cry1Ac原毒素进行孵育后，发现在相同浓度下饲喂L4440-Trypsin-9的中肠液活化和消解毒素能力与饲喂L4440-GFP相比，明显减弱。说明Trypsin-9在Cry1Ac原毒素的活化起重要作用，参与小菜蛾中肠对于BtCry1Ac的免疫。
实施例7小菜蛾Trypsin-9蛋白对微生物杀虫剂的增效作用
将苏云金芽孢杆菌培养成对数生长期，收集菌体，PBS洗涤3次，用PBS悬浮菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：10，将制备好的菌体，保存备用。
挑取长势一致且健康3龄的小菜蛾幼虫，将人工饲料(1g)与融合蛋白Trypsin-9(10μg)混匀后饲喂小菜蛾，12h更换一次饲料。同时饲喂anti-Trypsin-9多克隆抗体(10μg)，用PBS为对照。饲喂24h小菜蛾进一步饲喂苏云金芽孢杆菌，并于饲喂后每隔12h观察一次，一致到84h，统计累积死亡率。
将带有L4440-Trypsin-9质粒转进HT115，进行培养，IPTG诱导后，收集菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：250。按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，每组处理100头小菜蛾，饲喂L4440-GFP作为无干扰RNA的对照，以健康的小菜蛾为空白对照，饲喂dsRNA后的24h小菜蛾进一步饲喂苏云金芽孢杆菌，并于饲喂后每隔12h观察一次，一致到84h，统计累积死亡率。
死亡率统计结果如图5。由图5可知，添加重组蛋白Trypsin-9可以提高小菜蛾死亡率，而添加L4440-Trypsin-9的RNAi后，降低了Trypisn-9表达后，导致Cry1Ac活化受到抑制，从而提高小菜蛾存活率，说明添加重组蛋白Trypsin-9可以增效Cry1Ac杀虫蛋白的杀虫效率。
序列表
<120> 一种小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因及其应用
<141> 2020-06-30
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 820
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 1
agcataattc aaattcagtt accagtagtc acaatgcgtt ctcttttcct gttagttttg 60
ggagcaattg cagtgtcggg ggcggctgtc cctcgcactt cgcagaggat tgtgggtgga 120
tccgccacca ccatcgaccg gtatccgttc ggtgcagtcg ttctgttcct ctcgaatgga 180
ggattcttcc gccagcattg cggagggagc atcatcaatg acaatgcagt cttgactgct 240
gcgcactgtc tgcaccgcag gagaaacgac cagttccgca tccgtgtcgg ttcaacccaa 300
gccagcagcg gcggcagcgt gcacgccgtc aaccggctaa tctcacatgc gagcttcaac 360
cacaacaccc aggacaatga cctcgccatc atgaggacca ccacccagat caacttcctc 420
cctggattgg tcgcggctgg caccttcgct gggtctaact acaacgtgcc cgacggcgcc 480
tccgtctggg ctatcggctg gggagctgga cgacccaacg gccccggatc cgagcagctg 540
cgtcacgtgg agatctggac cgtgaaccag gcggtctgca gggctcgcta ccagaacatc 600
agaatgactg ttactgacaa catgctgtgc tcgggctggc tggacgtggg cggccgcgac 660
cagtgcacgg gagactctgg tggccccctc cttcatgata atgtggtcat tggagtctca 720
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tacattgact ggattcgcac aaacgcgtag gagaaatgtt 820
<210> 2
<211> 258
<212> PRT
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 2
Met Arg Ser Leu Phe Leu Leu Val Leu Gly Ala Ile Ala Val Ser Gly
1 5 1015
Ala Ala Val Pro Arg Thr Ser Gln Arg Ile Val Gly Gly Ser Ala Thr
202530
Thr Ile Asp Arg Tyr Pro Phe Gly Ala Val Val Leu Phe Leu Ser Asn
354045
Gly Gly Phe Phe Arg Gln His Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Asn
505560
Ala Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu His Arg Arg Arg Asn Asp Gln
65707580
Phe Arg Ile Arg Val Gly Ser Thr Gln Ala Ser Ser Gly Gly Ser Val
859095
His Ala Val Asn Arg Leu Ile Ser His Ala Ser Phe Asn His Asn Thr
100 105 110
Gln Asp Asn Asp Leu Ala Ile Met Arg Thr Thr Thr Gln Ile Asn Phe
115 120 125
Leu Pro Gly Leu Val Ala Ala Gly Thr Phe Ala Gly Ser Asn Tyr Asn
130 135 140
Val Pro Asp Gly Ala Ser Val Trp Ala Ile Gly Trp Gly Ala Gly Arg
145 150 155 160
Pro Asn Gly Pro Gly Ser Glu Gln Leu Arg His Val Glu Ile Trp Thr
165 170 175
Val Asn Gln Ala Val Cys Arg Ala Arg Tyr Gln Asn Ile Arg Met Thr
180 185 190
Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ser Gly Trp Leu Asp Val Gly Gly Arg
195 200 205
Asp Gln Cys Thr Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu His Asp Asn Val
210 215 220
Val Ile Gly Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Ser Ala Glu Tyr
225 230 235 240
Pro Gly Val Asn Val Arg Val Ser Arg Tyr Ile Asp Trp Ile Arg Thr
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Asn Ala
<210> 3
<211> 702
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 3
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ttcctctcga atggaggatt cttccgccag cattgcggag ggagcatcat caatgacaat 120
gcagtcttga ctgctgcgca ctgtctgcac cgcaggagaa acgaccagtt ccgcatccgt 180
gtcggttcaa cccaagccag cagcggcggc agcgtgcacg ccgtcaaccg gctaatctca 240
catgcgagct tcaaccacaa cacccaggac aatgacctcg ccatcatgag gaccaccacc 300
cagatcaact tcctccctgg attggtcgcg gctggcacct tcgctgggtc taactacaac 360
gtgcccgacg gcgcctccgt ctgggctatc ggctggggag ctggacgacc caacggcccc 420
ggatccgagc agctgcgtca cgtggagatc tggaccgtga accaggcggt ctgcagggct 480
cgctaccaga acatcagaat gactgttact gacaacatgc tgtgctcggg ctggctggac 540
gtgggcggcc gcgaccagtg cacgggagac tctggtggcc ccctccttca tgataatgtg 600
gtcattggag tctcatcgtg gggccagggc tgtgcgtcgg ccgagtaccc tggagtcaac 660
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