一种降低红肉中N-羟乙酰神经氨酸的物理方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体来说涉及利用一种降低红肉中N-%20羟乙酰神经氨酸的物理方法。
背景技术
红肉，目前通常指未经加工的哺乳类动物的肌肉，例如猪肉、羊肉和牛肉等。红肉能够为人们提供优质的动物蛋白、许多矿物质及B组维生素等。然而，2015年10月，国际癌症研究机构将红肉及加工肉制品分别列为较可能致癌物和致癌物，引起了社会的广泛关注。许多流行病学调查研究表明，红肉的摄入与一些疾病的发生息息相关，如结/直肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等。普遍认为红肉中存在的风险物质有饱和脂肪酸、N-亚硝基化合物、杂环胺、多环芳烃、血铁红素等，但这些物质并不是红肉中所特有的。因此，Varki教授团队提出的非人源的唾液酸-N-羟乙酰神经氨酸成为红肉致癌的标志性风险物质。
N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是唾液酸的一种，是一种专属于哺乳动物、在红肉中呈酸性、共含有11个碳原子的9碳单糖的衍生物,普遍存在于大多数后口动物的非神经组织和体液中,包括棘皮动物和脊椎动物,是动物细胞膜或分泌液糖蛋白、糖脂质或细菌荚膜物质等的组成糖。Neu5Gc%20是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)通过CMP-Neu5Ac羟化酶生物合成，但是约2～3%20百万年前,人类编码CMP-Neu5Ac羟化酶的基因发生了突变,因此人类体内不能再合成Neu5Gc,由此说明Neu5Gc是一种非人源唾液酸。目前人体中的Neu5Gc主要来源于动物性食品的摄入，人体内主要的唾液酸形式是%20Neu5Ac,Neu5Gc的分子式为:C11H19NO10,分子量为:325.27，其结构如下式所示。
许多研究人员采用不同的免疫化学技术纷纷从肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织等不同内脏癌变组织中检测到Neu5Gc。Neu5Gc的摄入使机体内产生识别Neu5Gc的抗体,会促进慢性炎症的发生,从而刺激肿瘤的生长。因此,Neu5Gc附在肿瘤细胞表面,实际上是间接地促进了癌症的生长。这造成消费者在购买食用红肉类产品时多有疑虑，担心会对自身健康产生危害，因此能够利用有效的手段来降低红肉中的风险物质是非常必要的。
A·瓦基等申请的专利(美国，PCT/US06/22282)中提到,非人源唾液酸Neu5Gc通过代谢的方式被分别掺入培养的细胞和人组织中而污染生物治疗产品和人体。在第一种情况中,污染来自培养基中源于动物组分和所使用的动物细胞系；而第二种情况中,污染来自从食物(例如红肉)中的膳食摄取。向包含Neu5Gc酶促途径的动物施以有效的Neu5Ac、衍生物、类似物或前体,可有效减少或去除Neu5Gc。蒋芸等开展了降低红肉中Neu5Gc含量的研究,其目的是在烹饪前通过预处理把部分Neu5Gc解离出去,即采用水煮、微波炉加热、有机酸腌制和半乳糖苷酶水解处理猪肉和牛肉,探寻了非人类唾液酸解离方式,结果显示这些红肉烹饪前的预处理方式对降低产品中Neu5Gc含量有着不同程度的效果。梁美莲等探究利用油炸及蒸煮等方式降低红肉中Neu5Gc的含量，但油炸温度达到150℃时，Neu5Gc含量降低；随着蒸煮时间的延长，肉汤中Neu5Gc含量显著升高，牛肉中Neu5Gc 游离出来，说明蒸煮能够有效降低肉本身Neu5Gc的含量。但目前所采用的这些方法都不能达到在保持红肉原本品质的基础上，快速无损的降低红肉中Neu5Gc含量的效果，对于工业生产来说可实施性不强。
电刺激是一种有效防止冷收缩变硬的技术，电刺激能够加快糖酵解和降低pH来防止冷收缩，破坏肌原纤维结构，进而改善肉的嫩度；电刺激显著加快肌钙蛋白-T的降解，缩短宰后牛肉成熟时间，目前在牛、羊等动物胴体进行电刺激主要用于改善肉的嫩度。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种安全高效降低Neu5Gc 含量的同时改善红肉嫩度的降低红肉中N-羟乙酰神经氨酸的物理方法。
本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明的一种降低红肉中N-羟乙酰神经氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)电刺激牛肉糜：取牛肉搅碎，称取1份肉糜于匀浆瓶中，加入10 份纯净水，研磨均匀，将电极直接置于牛肉糜中，用30-120V的直流稳压电源电刺激10-50s；
(2)电刺激牛肉块：取牛肉块，用100-300V直流稳压电源，将电极直接接触肉块两侧，在保证牛肉块不会焦糊的前提下，间歇电刺激60s，每次电刺激时间为1-5s。
本发明同现有技术相比，具有明显的有益效果，由以上技术方案可知，本发明选用牛肉是因为与其他种类的红肉相比，牛肉中Nue5Gc的含量较高，利于观察处理前后Neu5Gc的变化情况。通过对电刺激参数的反复筛选，得到本发明的电压与时间的搭配，在此条件下对糜状及块状牛肉进行电刺激后。采用高效液相色谱荧光检测器对电刺激前后的牛肉中Neu5Gc的含量进行检测，证实牛肉经本发明的的方法电刺激后可降低红肉中Neu5Gc的含量，同时牛肉的嫩度也得到了改善。
具体实施方式
实施例1
一种降低牛肉糜中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取牛肉利用搅碎机搅碎，称取1g肉糜于匀浆瓶中，加入10ml纯净水，研磨均匀，电极直接置于牛肉糜中，用90V直流稳压电源电刺激10s。
实施例2
一种降低牛肉糜中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取牛肉利用搅碎机搅碎，称取1g肉糜于匀浆瓶中，加入10ml纯净水，研磨均匀，电极直接置于牛肉糜中，用90V直流稳压电源电刺激30s。
实施例3
一种降低牛肉糜中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取牛肉利用搅碎机搅碎，称取1g肉糜于匀浆瓶中，加入10ml纯净水，研磨均匀，电极直接置于牛肉糜中，用30V直流稳压电源电刺激50s。
实施例4
一种降低牛肉糜中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取牛肉利用搅碎机搅碎，称取1g肉糜于匀浆瓶中，加入10ml纯净水，研磨均匀，电极直接置于牛肉糜中，用120V直流稳压电源电刺激50s。
实施例5
一种降低牛肉块中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取重400g、长宽高分别为120cm、75cm和48cm的牛肉块，将电极直接接触肉块两侧，利用100V直流稳压电源间歇电刺激60s，每次电刺激时间为5s。
实施例6
一种降低牛肉块中N-羟乙酰神经氨酸含量的物理方法，包括以下步骤：
取重400g、长宽高分别为120cm、75cm和48cm的牛肉块，将电极直接接触肉块两侧，利用300V直流稳压电源间歇电刺激60s，每次电刺激时间为1s。
试验例：
取实施例1-4处理后的牛肉糜，冷冻干燥48h后，加入10ml 30％饱和硫酸铵溶液，室温下放置1h后冷冻；
取实施例5-6处理后牛肉用搅碎机搅碎，称取1g牛肉糜，加入10ml 30％饱和硫酸铵溶液研磨均匀，室温下放置1h后冷冻；
将经上述条件处理后的牛肉糜冷冻干燥48h后得冻干粉，向冻干粉中加入10mL2mol/L的醋酸于80℃的水浴锅中酸解3h，离心过滤后再次冷冻干燥48h，向冻干粉中加入1ml水、0.2ml 0.1mol/L NaOH，于37℃水浴中30min进行去乙酰化，经0.45μm滤头过滤后得滤液A，将滤液A按照下述衍生方法进行衍生后检测。
空白组不进行电刺激处理，其余步骤均与实验组一致。
高效液相色谱条件：
色谱柱为德国默克Li Chrosorb RP-18柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，荧光检测器激发波长373nm、发射波长448nm，流动相为超纯水-乙腈-甲醇(85∶8∶7，V/V)，流速为0.9mL/min，进样体积为10μL。
衍生液的配制及衍生条件：
DMB衍生液配制：8mmol/L DMB、1.5mol/L冰醋酸、0.25mol/L硫代硫酸钠、0.25mol/L亚硫酸钠、0.8mmol/L 2-巯基乙醇。
衍生条件:
精确吸取900μL经过前处理后得到的滤液，分别加入100μL DMB衍生液，50℃避光衍生150min，冷却至室温后检测，结果见表1、表2。
表1.电刺激处理前后牛肉糜中Nue5Gc含量的变化
由表1可知，用实施例1-4中条件处理后，牛肉糜中Neu5Gc的含量发生了不同程度的改变，但并不是每一个处理组均能有效降低牛肉糜中 Neu5Gc的含量。其中效果最好的为实施例4，能降低牛肉糜中百分之七十多的Neu5Gc。说明适宜的电刺激条件能有效降低牛肉糜中Neu5Gc的含量。
表2.电刺激处理前后牛肉块中Nue5Gc含量的变化
由表2可知：分别用100V和300V的电压电刺激牛肉块60s，100V电压电刺激时，牛肉块中Neu5Gc含量未发生明显变化；300V电压电刺激时，400g牛肉中Neu5Gc含量降低，与对照组相比降低21.02％(表2)。表明合适的电刺激条件能降低牛肉块中Nue5Gc的含量。
与电刺激牛肉糜相比，电刺激牛肉块时，Neu5Gc含量的降低幅度变小。原因有以下几点：1.虽然电压增大，但因肉样质量增大，体积变大，导致降低效果没有牛肉糜显著。2.肉样扩大，电刺激处理时导致相对接触面积变小。 3.电刺激大块肉样导致电压不稳定，需间歇电刺激，不能持续电刺激。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
