一对特异识别猪NFкBp65基因的多肽及其编码基因和应用
技术领域t
本发明属于基因工程技术领域，涉及一对特异识别猪NFκB p65基因的多肽及其编码基因和应用。 t
背景技术t
p65是NFκB转录因子最重要的一个亚基。猪NFκB p65与仔猪蓝耳病毒、猪瘟病毒及伪狂犬病毒抗体水平有显著关联(Li et al.，2011)，其单个氨基酸的改变可引起家猪对非洲猪瘟病毒(ASFV)感染能力的显著变化(Palgrave et al.，2011)。由此可见，猪NFκB p65基因可作为猪抗病育种的一个重要候选基因。 t
p65作为NFκB转录因子一个主要的亚基，在哺乳动物免疫反应中扮演着重要的角色。在含有TAD的三个亚基中，p65是唯一一个全身性表达的(Doleschall et al.，2007)。p65亚基的缺失导致因肝变性所致胚胎死亡(Beg et al.，1995)；相应的，缺失其它四个亚基中任何一个都仅仅导致免疫缺陷，并未表现出任何发育障碍(Gerondakis et al.，1999；Li and Verma，2002)。与p65在不同细胞中发挥着抗凋亡作用相一致，p65双敲除的成纤维细胞和巨噬细胞也表现出对TNFα诱导凋亡的敏感度增加(Beg and Baltimore，1996；Gerondakis et al.，1999)。p65双敲除的小鼠成纤维细胞永生化速度大大超过正常未敲除细胞(Wang et al.，2009)。p65也对正常淋巴细胞的功能起着重要的作用(Gerondakis et al.，1999)。NF-κB p65亚基特异性调节cyclin D1蛋白的稳定性(Dahlman et al.，2009)。p65对IκBβ蛋白的紧密控制在维持细胞动态平衡中是必需的。p65的激活对于细胞死亡和肠上皮的分裂的动态平衡是必需的，同样在防止重度急性肠炎的发生上也是必要的(Steinbrecher et al.，2008)。在肿瘤抑制因子p53存在或缺失的情况下，p65的删除均可减少K-Ras诱导的肺部肿瘤数量(Basseres et al.，2010)。 t
另外，猪被认为是异种移植最重要的器官供体。NFκB介导的转录激活是引起猪-人异种移植排斥反应的重要原因(Altintas et al.，2011；Auchincloss and Sachs，1998)，而p65作为NFκB转录因子的主要亚基，必然会在这一免疫反应中发挥重要的作用。 t
综上所述，在细胞或个体水平上对猪NFκB p65基因进行敲除或修饰，可解析猪NFκBp65基因的功能、减缓猪-人异种移植排斥反应或获得相关疾病模型，为猪抗病育种、异种器官移植及新药研发服务。 t
传统的基因敲除技术效率很低，因此寻找一种能定点切割猪NFκB p65基因的技术相当重要。近年来发展的主要方法为依托序列特异的核酸酶进行基因的精确修饰。序列特异的核酸酶主要由一个DNA识别域与一个能非特异性切割DNA的内切酶结构域连接而成。其主要原理为先由DNA识别域识别并结合到需要改造的DNA片段上，然后由与DNA相连的非特异性内切酶结构域对DNA进行切割，造成DNA的双链断裂(Double-strand break，DSB)，DSB会激活DNA的自我修复而引起基因的突变从而促进该位点的同源重组。 t
转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)是继锌指核酸酶技术以来的另一种能够对基因组进行高效定点修饰的新技术。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALEN，从而可以实现对基因组DNA双链在特定位点进行修饰。 t
在TALE的中央存在着一个重复区域，这个区域通常是由33-35个氨基酸的数量可变的重复单元构成。重复序列结构域(Repeat Domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基(Repeat-Variable Diresidues，RVD)。TALE识别DNA的机制在于一个重复序列上的RVD能够识别DNA靶点上的一个核苷酸，再融合FokI核酸内切酶，组合成TALEN。TALEN是一种异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。该酶效率高、毒性低、制备周期短，成本低，优势日益明显。 t
发明内容t
本发明的目的是提供一对特异识别猪NFκB p65基因的多肽及其编码基因和应用。本发明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别猪NFκB p65基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，能够对猪NFκB p65基因进行准确、高效地靶向修饰。 t
具体地，本发明的目的是这样实现的： t
一对特异识别猪NFκB p65基因的多肽(命名为特异多肽对)，由多肽甲和多肽乙组成；所述多肽甲由17个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个 双连氨基酸；所述多肽乙由17个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个双连氨基酸； t
所述多肽甲中的17个双连氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基和第546-547位氨基酸残基。 t
所述多肽乙中的17个双连氨基酸依次如下：序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基和第546-547位氨基酸残基。 t
所述多肽甲具体可如序列表的序列3所示。 t
所述多肽乙具体可如序列表的序列5所示。 t
本发明还保护一对DNA分子(命名为特异DNA分子对)，由编码所述多肽甲的DNA分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。 t
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的17个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。 t
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的17个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029 位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。 t
所述DNA分子甲具体可如序列表的序列2所示。 t
所述DNA分子乙具体可如序列表的序列4所示。 t
本发明还保护一对质粒(命名为特异质粒对)，由具有所述DNA分子甲的质粒甲和具有所述DNA分子乙的质粒乙组成。 t
所述质粒甲具体可为在pCS2-Fok I载体(PEAS型)的多克隆位点插入所述DNA分子甲得到的重组质粒。 t
所述质粒乙具体可为在pCS2-Fok I载体(PERR型)的多克隆位点插入所述DNA分子乙得到的重组质粒。 t
本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰猪NFκB p65基因中的应用。所述猪NFκB p65基因，具体可如序列表的序列1所示。 t
本发明还保护所述特异质粒对在特异切割猪NFκB p65基因中的应用。所述猪NFκBp65基因，具体可如序列表的序列1所示。 t
本发明还保护所述特异质粒对在构建猪NFκB p65基因突变库中的应用。所述猪NFκBp65基因，具体可如序列表的序列1所示。 t
与现有技术相比，本发明提供了特异识别猪NFκB p65基因的多肽对，并提供了该多肽对的编码基因。本发明同时提供了用于基因工程的质粒对，该质粒对由两个质粒组成，其中一个质粒表达一条多肽和PEAS型Fok I核酸内切酶的融合蛋白，另一个质粒表达另一条多肽和Fok I核酸内切酶(PERR型)的融合蛋白。将所述质粒对导入含有目的基因的细胞，可以使细胞中的目的基因被特异切割，在细胞自身修复系统的作用下，可以得到目的基因的突变库。本发明的目的在于，在细胞或个体水平上对猪NFκB p65基因进行敲除或修饰，以解析猪NFκB p65基因的功能、构建猪NFκB p65基因突变库或获得相关疾病模型，为猪抗病育种及新药研发服务。 t
附图说明t
图1为四种质粒的结构示意图和工作原理示意图。 t
图2为重组质粒TALE-L具有的串联模块及其构建过程的示意图。 t
图3为重组质粒TALE-R具有的串联模块及其构建过程的示意图。 t
图4为重组质粒pcs2-TALE-peas-L和重组质粒pcs2-TALE-peas-R的构建流程示意 图。 t
图5为重组质粒pGL4-SSA-p65的工作原理示意图。 t
图6为TALEN质粒对pcs2-TALE-peas-L和pcs2-TALE-perr-R转染猪PEF细胞60h后提取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)。 t
图7为TALEN质粒对pcs2-TALE-peas-L和pcs2-TALE-perr-R的工作原理示意图。 t
具体实施方式t
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。 t
pTALE-A：CWBIO，Cat No.CW2238。pTALE-G：CWBIO，Cat No.CW2239。pTALE-C：CWBIO，Cat No.CW2240。pTALE-T：CWBIO，Cat No.CW2241。293T细胞系：CWBIO，Cat No.CW2095。 t
pGL4-SSA载体：Addgene，Cat No.42962。pRL-TK载体：Promega，Cat No.E2241。 t
实施例1、TALE靶点识别模块的构建 t
一、四种模块以及将模块进行组合的机理描述 t
TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸(即相邻的两个氨基酸)。双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A、NG识别T、HD识别C、NN识别G。pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒为单模块载体，为分别具有上述四种TAL的核酸识别单元的编码DNA的质粒，且在编码DNA的5’末端具有Spe I酶切识别序列、3’末端具有连续的Nhe I酶切识别序列和Hind III识别序列。通过单模块载体上的Spe I、Nhe I和Hind III酶切位点按照靶点序列相对应的TAL单元即可串联克隆，其中右侧靶点序列需反向构建模块。四种质粒的结构示意图和工作原理示意图见图1。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因，因为Fok I需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻(间隔14 18碱基)的靶序列(一般十几个碱基)分别进行TAL识别模块构建。 t
二、靶点的选择 t
NFκB p65基因的部分序列见序列表的序列1，其中自5’末端第196至270位核苷酸 为第十外显子。首先通过大量序列分析和筛选工作将第十外显子作为初步选定的靶点，然后通过进一步筛选，将序列表的序列1自5’末端第216至269位核苷酸作为进一步选定的靶点，通过再次的筛选，将序列表的序列1自5’末端第217-233位核苷酸和第252-268位核苷酸作为最终的靶点。 t
三、重组质粒TALE-L(左侧TALE模块)和重组质粒TALE-R(右侧TALE模块)的构建 t
根据选定的靶点，用pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒构建重组质粒TALE-L(具有图2所示的串联模块)，构建过程见图2。根据选定的靶点，用pTALE-A质粒、pTALE-G质粒、pTALE-C质粒和pTALE-T质粒构建重组质粒TALE-R(具有图3所示的串联模块)，构建过程见图3。重组质粒TALE-L识别17个核苷酸(GCAACCCGGCGCATTGC)，重组质粒TALE-R识别17个核苷酸（GGCTTGGGGACGGAAGC)。 t
重组质粒TALE-L和重组质粒TALE-R经Spe I和Nhe I双酶切，均产生1.7kb左右预期条 。重组质粒TALE-L和重组质粒TALE-R统称重组质粒TALE。 t
四、重组质粒pcs2-TALE-peas-L和重组质粒pcs2-TALE-perr-R的构建 t
pCS2-Fok I载体：CWBIO，Cat No.CW2273；包括一对结构基本相同的质粒，pCS2-Fok I载体(PEAS型)和pCS2-Fok I载体(PERR型)，pCS2-Fok I载体(PEAS型)又称PEAS型pCS2-Fok I载体，pCS2-Fok I载体(PERR型)又称PERR型pCS2-Fok I载体，pCS2-Fok I载体(PEAS型）和pCS2-Fok I载体(PERR型)的差异仅在于pCS2-Fok I载体(PEAS型)具有编码Fok I核酸内切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2-Fok I载体(PERR型)具有编码Fok I核酸内切酶(PERR型)的DNA序列；质粒的结构为：具有由sCMV启动了控制的、除目标基因靶点识别域外的TALEN必需元件、编码Fok I核酸内切酶(PEAS型或PERR型)的DNA序列，在编码TALE0.5单元模块(RVD NG，识别T碱基)的DNA序列的5’端嵌有限制性内切酶Nhe I DNA的识别序列。Fok I核酸内切酶(PEAS型)和Fok I核酸内切酶（PERR型)形成二聚体后发挥内切酶的功能。 t
重组质粒pcs2-TALE-peas-L和重组质粒pcs2-TALE-perr-R统称pcs2-TALEN，构建流程示意图见图4。 t
1、用限制性内切酶Spe I和Nhe I双酶切重组质粒TALE-L，回收约1.7kb的DNA片段。 t
2、用限制性内切酶Nhe I酶切pCS2-Fok I载体(PEAS型)，回收约5.4kb的载体骨 架。 t
3、将步骤1得到的DNA片段和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcs2-TALE-peas-L(左侧表达质粒)。根据测序结果，对重组质粒pcs2-TALE-peas-L进行结构描述如下：在pCS2-Fok I载体(PEAS型)的NheI酶切位点插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子(序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质；序列3中的双连氨基酸分别为：第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基、第546-547位氨基酸残基)；重组质粒pcs2-TALE-peas-L中，在CMV启动子的作用下，表达序列3所示蛋白质与Fok I内切酶单体的融合蛋白(命名为融合蛋白-L)，该融合蛋白中，序列3所示蛋白质位于N末端。 t
4、用限制性内切酶Spe I和NheI双酶切重组质粒TALE-R，回收约1.7kb的DNA片段。 t
5、用限制性内切酶NheI酶切pCS2-Fok I载体(PERR型)，回收约5.5kb的载体骨架。 t
6、将步骤4得到的DNA片段和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pcs2-TALE-perr-R(右侧表达质粒)。根据测序结果，对重组质粒pcs2-TALE-perr-R进行结构描述如下：在pCS2-Fok I载体(PERR型)的NheI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA分子(序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列5所示的蛋白质；序列5中的双连氨基酸分别为：第2-3位氨基酸残基、第36-37位氨基酸残基、第70-71位氨基酸残基、第104-105位氨基酸残基、第138-139位氨基酸残基、第172-173位氨基酸残基、第206-207位氨基酸残基、第240-241位氨基酸残基、第274-275位氨基酸残基、第308-309位氨基酸残基、第342-343位氨基酸残基、第376-377位氨基酸残基、第410-411位氨基酸残基、第444-445位氨基酸残基、第478-479位氨基酸残基、第512-513位氨基酸残基、第546-547位氨基酸残基)；重组质粒pcs2-TALE-peas-R中，在CMV启动子的作用下，表达序列5所示蛋白质与Fok I内切酶单体的融合蛋白(命名为融合蛋白-R)，该融合蛋白中，序列5所示蛋白质位于N末端。 t
实施例2、报告质粒的构建 t
1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子(靶点片段)。 t
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用NFκB p65F和NFκB p65R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 t
NFκB p65F：5’-ACTTATGTTACCCGGGCGGATTGAGGAGAAACGCAAAAGG-3’； t
NFκB p65R：5’-ATACATGTATCCCGGGAGAAACAGGAGCCCAACAGAGGG-3’。 t
3、用限制性内切酶XmaI酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。 t
4、用限制性内切酶XmaI酶切pGL4-SSA载体，回收约5.7kb的载体骨架。 t
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pGL4-SSA-p65(报告质粒)。根据测序结果，对重组质粒pGL4-SSA-p65进行结构描述如下：在p GL4-SSA载体的XmaI酶切位点插入了序列表的序列6所示的DNA分子(NFκB p65片段)。由CMV启动子控制的SSA报告基因(即Firefly Luciferase基因，中文名称为萤火虫荧光素酶基因)被终止密码子和靶点片段分割为两段(自上游至下游依次命名为片段甲和片段乙，片段甲的下游和片段乙的上游为同源臂)。将重组质粒pGL4-SSA-p65导入细胞后，因为片段甲和片段乙之间具有终止密码子和靶点片段组成的间隔区，只能表现出很弱的萤火虫荧光素酶活性。将重组质粒pGL4-SSA-p65导入细胞后，如果间隔区的DNA片段被切割，片段甲和片段乙可以借助同源臂发生同源重组并形成有活性的萤火虫荧光素酶基因，使得萤火虫荧光素酶活性显著增强，工作原理示意图见图5。 t
实施例3、通过荧光素酶报告基因法验证实施例1构建的质粒的TALEN活性 t
分别进行如下2组实验处理(每个实验处理进行三次重复实验，每次重复实验设置3个重复处理，结果取三个重复处理的平均值；转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂，CWBIO，Cat No.CW0860，每个处理中转染试剂的加入量为6μl，并按照说明书进行操作)： t
第1组：将0.4μg pRL-TK质粒(参考对照质粒)、2.0μg重组质粒pGL4-SSA-p65、4.0μg质粒载体pCS2-Fok I(PEAS型)和4.0μg质粒载体pCS2-Fok I(PERR型)共转染1×106的293T细胞； t
第2组：将0.4μg pRL-TK质粒(参考对照质粒)、2.0μg重组质粒pGL4-SSA-p65、4.0μg重组质粒pcs2-TALE-peas-L和4.0μg重组质粒pcs2-TALE-perr-R共转染1×106的293T细胞； t
转染24小时后取各组的细胞进行裂解并检测荧光素酶的荧光信号(仪器为：Luminometer，DLReady，型号是TD-20／20)，结果见表1。荧光素酶检测按照试剂盒Dual luciferase assay kit(Promega，货号#E1910)说明书进行。 t
表1各组处理的荧光强度数据 t
TALENs敲除效率=(第二组的F／R)：(第一组的F／R)=3.550(P<0.01)，即重组质粒pcs2-TALE-peas-L和重组质粒pcs2-TALE-peas-R对靶点片段的敲除活性为3.550。 t
实施例4、通过测序验证实施例1构建的质粒的TALEN活性 t
PEF细胞(猪胎儿成纤维细胞)：从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞(分离方法参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征；湖南农业大学学报(自然科学版)；第36卷第6期；2010年12月；678-682)。 t
1、将4μg重组质粒pcs2-TALE-peas-L和4μg重组质粒pcs2-TALE-perr-R通过电转化的方式共转染1×106PEF细胞，得到重组细胞。 t
2、将步骤1得到的重组细胞30℃培养60小时，然后收集细胞。 t
3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组成的引物对进行PCR扩增，回收376bp的PCR扩增产物。 t
PCRF：5’-CGGATTGAGGAGAAACGCAAAAGG-3’： t
PCRR：5’-AGAAACAGGAGCCCAACAGAGGG-3’。 t
4、将步骤3得到的PCR扩增产物与pMD18-T载体(宝生物，货号：D101A)连接，得到连接产物。 t
5、将步骤4得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物，D9057S)，然后涂布于含500mg／ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取100个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对TALEN质粒的效率。结果发现5个克隆在预期切割位点附近出现突变(详见图6)，即重组质粒pcs2-TALE-peas-L和pcs2-TALE-perr-R组成的TALEN质粒对在PEF细胞基因组中的切割效率达5％。 t
重组质粒pcs2-TALE-peas-L和重组质粒pcs2-TALE-perr-R的工作原理见图7，两种带有Fok I功能域的靶向TALE核酸酶分别在CMV启动子控制下高效表达，并进入细胞核内，与相应的靶点DNA发生特异性结合。Fok I核酸内切酶成二聚体行使DNA切割活性，切断目标基因DNA双链。 t
