一种检测猪2型圆环病毒的基因芯片试剂盒
技术领域tt
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测猪2型圆环病毒的试剂盒。tt
背景技术tt
1997年，Clark、Harding等首次在美国养猪生产者协会年会上报告了加拿大tt西部发生了一种仔猪新病，并根据其组织病理学特征命名为断奶仔猪多系统衰竭tt综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）。自PMWS暴发tt后，病原学鉴定证明是由猪2型圆环病毒（PCV2）引起的，由此开展了对PCV2tt的深入研究。PCV2感染还可引起其他几种综合征和疾病，包括猪皮炎肾病综合tt征、繁殖障碍、猪呼吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎以及渗出性皮炎。tt该病毒持续性感染，在感染猪的分泌物和排泄物中可检测到PCV2的核酸；该病tt毒能引起猪群发生原发感染甚至死亡，严重时使机体的免疫功能受到损害，导致tt机体抵抗力下降，引起并发或寄发感染，使病情加重，造成更大的经济损失。tt
近年来PCV2感染流行广泛，造成了养猪业经济损失巨大，引起了人们高度tt重视。猪2型圆环病毒感染也是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一，且经tt常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。因此，应用现代生物技术，研制及开发tt新型诊断检测PCV2技术并将其应用于动物疫病的疫情监测、诊断、疫情预警预tt报以及疫病的净化工作极为迫切。tt
发明内容tt
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于纳米金复合探针的基因芯片试剂tt盒，该试剂盒能够用于快速检测猪2型圆环病毒（PCV2）核酸。tt
本发明的另一个目的是上述基于纳米金复合探针的基因芯片试剂盒在检测ttPCV2核酸上的应用。tt
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：tt
本发明提供一种基因芯片，该基因芯片上连接有PCV2核酸的捕获探针。tt
上述基因芯片上连接的PCV2核酸的捕获探针是：5’tttttt-H2N-GTATTGACGTCGGCTAC-3’。tt
上述基因芯片的制备方法包括以下步骤：将经过氨基修饰的捕获探针于tt100℃加热5min，迅速冰浴90s，将DNA探针浓度2.3×l0-6～2.3×l0-8M按设tt计好的阵列每点3μl点在玻片上，然后将玻片在37℃潮湿的环境下避光放置1h，tt超轻水洗3-4次去除未共价结合的探针，之后在42℃恒温水浴箱上用封闭剂封tt闭30min，再于恒温水浴箱上微震荡下PBS洗3次，然后室温晾干。tt
本发明还提供一种包含上述基因芯片的用于检测猪2型圆环病毒的试剂盒。tt
上述试剂盒还包括纳米金探针，该探针是：5’tt-GGGAGCCTAGCAGTGAC-SH-3’-纳米金颗粒。tt
上述试剂盒还包括用于PCV2核酸中保守区域扩增的引物，洗涤母液A，洗tt涤母液B，洗涤母液C和银染液。tt
其中，上述用于PCV2核酸中保守区域扩增的引物是：tt
上游引物5’-TTCTGACTGTGGTTCGCTTG-3’；tt
下游引物5’-ACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’。tt
上述试剂盒各部分的组分与配比如下：tt
洗涤母液A：超纯水；tt
洗涤母液B：PBS；tt
洗涤母液C：PBN；tt
银染液：硝酸银水溶液。tt
本发明试剂盒检测PCV2核酸，包括如下步骤：tt
1）靶基因样品的制备tt
提取感染PCV2细胞的全DNA，通过PCR反应对PCV2核酸的保守区域进tt行扩增；tt
2）芯片杂交tt
PCV2扩增产物于100℃加热5min，然后迅速冰浴2min，加入PBS中，tt在恒温杂交箱中密闭轻微摇荡下50℃杂交120min，芯片取出在40℃预温的PBStt中洗3次，将纳米金标记探针加在PBS中预温到40℃，与芯片杂交120min，tttttt取出用2×PBN室温洗2次；tt
3）芯片染色tt
将银染液加入到芯片上，置于25℃显色，然后肉眼进行观察。tt
本发明用纳米金探针代替传统的探针标记应用于基因芯片，综合了PCR扩增tt技术和Southern杂交技术的优势，研制了一种成本低、操作简单、灵敏度高，特tt异性强的PCV2基因检测技术。本发明的试剂盒用于PCV2核酸时，检测结果准确，tt可供临床参考，具有良好的市场前景和应用价值。tt
附图说明tt
图1是优化捕获探针浓度的芯片扫描图，其中，A：阳性对照，B：PCV2，ttC：阴性，从1～6分别为捕获探针的浓度从2.3×10-5M～2.3×10-10M。tt
图2是优化捕获探针浓度的信号强度学分析图，其中，横坐标中E-5至E-10tt代表捕获探针的浓度从2.3×10-5M～2.3×10-10M。tt
图3是PCV2核酸阳性保守片段PCR结果图，其中，A：PCV2，B：阴性，ttC：Marker。tt
图4是DNA-纳米金探针对检测芯片的信噪比的影响结果图。tt
图5是不同PCV2扩增的浓度在不同银染时间下的信号强度，其中横轴的tt1-6分别代表扩增片段的浓度为10000fM、5000fM、1000fM、500fM、100fMtt和50fM。tt
图6是PCV2纳米金芯片检测1～24号样品结果图。tt
图7是利用PCR方法检测1～24号样品结果图。tt
具体实施方式tt
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背tt离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的tt范畴。tt
实施例1一种检测猪2型圆环病毒的基因芯片试剂盒tt
1、探针合成：tt
根据GenBank中猪2型圆环病毒编码结构蛋白的ORF2基因，然后利用ttDNAStar软件对各个序列进行对比，找出其中高度保守序列。然后利用primer3tttttt软件设计出特异性引物。最后再在NCBI中比对，将设计出的特异性引物和猪2tt型圆环病毒序列中的ORF2基因进行对比，重合率为100%。引物均为上海英骏tt公司（Invitrogen）合成。tt
氨基修饰捕获探针：5’-H2N-GTATTGACGTCGGCTAC-3’；tt
巯基修饰检测探针：5’-GGGAGCCTAGCAGTGAC-SH-3’；tt
ORF2保守区域上游引物：5’-TTCTGACTGTGGTTCGCTTG-3’；tt
ORF2保守区域下游引物：5’-ACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3’。tt
2、纳米金探针的制备tt
1）2ml纳米金溶液，4℃，14000rpm，20min离心。tt
2）弃去上清液，H2O洗纳米金沉淀，4℃，14000rpm，20min再次离心，tt弃去上清留沉淀。tt
3）3μl100μmol巯基标记探针+47μl H2O，混匀。tt
4）加入纳米金沉淀中，轻轻混匀。4℃，12h自身组装。tt
5）自身组装的纳米金+巯基探针混合液（47μl DDW+3μl100μmol），加入tt40μl TE+5μl1mol/L NaCl。轻轻混匀。置于4℃，24h。tt
6）将上述处理的纳米金样品，直接4℃，14000rpm，20min离心。弃去上tt清，用超纯水（DDW）洗沉淀2次，分别4℃，14000rpm，20min离心。去除tt多余未结合的纳米金-DNA。4℃保存。tt
3、基因芯片的制备tt
捕获探针按照十倍的浓度递比稀释，得到一系列的浓度，从2.3×10-5M～2.3×10-10M。tt
将上述各个浓度下的捕获探针于100℃加热5min，迅速冰浴90s。将DNAtt探针浓度从2.3×10-5M～2.3×10-10M按设计好的阵列每点3μl点在玻片上，同时tt设置阳性、阴性对照。tt
然后将玻片在37℃潮湿的环境下避光放置1h，DDW洗3～4次去除未共价tt结合的探针，之后在42℃恒温水浴箱上用封闭剂封闭30min，再于恒温水浴箱tt上微震荡下PBS洗3次，然后室温晾干，备用。tt
取PCV2核酸和阳性对照的浓度均为1000fM，于100℃加热5min，然后迅tt速冰浴2min。加入1ml0.3M PBS中，将制备好的芯片恒温杂交箱中密闭轻微tt摇荡下50℃杂交120min。芯片取出后，在40℃预温的0.1M的PBS中洗3次。tt将浓度为1.2nM的纳米金标记探针加在1ml0.1M PBS中预温到40℃，与芯片tt杂交120min，取出用2×PBN室温洗2次。并晾干。tt
然后用银染色进行染色反应，置于25℃显色8min，然后肉眼进行观察，tt结果见图1和2。从图中可以看出，当捕获探针的浓度高于2.3×10-7M，PCV2tt和阳性对照检测与阴性的不能区分，当捕获探针的浓度为2.3×10-8M，检测效tt果较好，且当捕获探针的浓度为2.3×10-8M时，芯片的信号强度最强。tt
4、试剂盒内其他成分部分的配置tt
洗涤母液A是超纯水；tt
洗涤母液B是PBS，其每升中含NaCl8g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，ttNa2HPO4·12H2O2.9g；tt
洗涤母液C是PBN，其每升中含1M NaNO3300ml，0.2M Na2HPO49.5ttml，0.2M NaH2PO430.1mltt
银染液是硝酸银水溶液，其浓度是每升中含有250g硝酸银。tt
实施例2试剂盒的测定程序的建立tt
1、DNA核酸模板提取和目的核酸片断扩增与鉴定tt
1）病毒DNA模板制备tt
细胞收集tt
A、用无菌细胞刮子刮下细胞于15ml离心管中，4℃，800rpm/min，10min，tt离心；弃去上清。tt
B、在离心管中加入预冷的PBS1ml到各离心管中，将细胞沉淀轻轻吹匀，tt加入到预冷的EP管中，离心，条件同1。弃去上清。tt
C、再次加入预冷PBS1ml洗1次，离心，弃上清。tt
D、将PBS洗净，-80℃保存。tt
细胞总DNA提取:tt
将PCV2感染细胞利用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA，而tttttt后通过设计的PCV2ORF2的特异性引物扩增PCV2ORF2片段，PCR鉴定后，tt纯化片段，作为荧光定量PCR的靶片段。tt
2）利用QIAGEN DNasy Blood & Tissue Kit提取DNAtt
A、将20μl proteinase K加入到200μl的细胞悬液中（含有PBS）；tt
B、在样品中加入buffer AL200μl，颠倒混匀，并且在56℃水浴10min；tt
C、在瞬离心，在样品中加入200μl的无水乙醇，颠倒混匀，再瞬离心；tt
D、将上述混合液加入到DNeasy Mini spin column中，室温8000rpm，离tt心1min，弃液；tt
E、再在DNeasy Mini spin column中加入500μl AW1，室温8000rpm，离tt心1min，弃液；tt
F、在DNeasy Mini spin column中加入500μl AW2，室温14000rpm，离tt心1min，弃液；tt
G、在DNeasy Mini spin column柱子膜中加入水，室温孵育1min，室温8000ttrpm，离心1min；重复次步骤得到DNA，测定浓度。-20℃保存待用。tt
3）将提取total DNA PCR扩增PCV2ORF2保守片段tt
A、利用Takara PrimeSTAR HS DNA polymerase试剂盒，PCR仪Bio-Rad ttDNA engine，扩增目的片段，具体反应物质的含量见表1，执行条件见表2：tt
表1：PCR反应具体物质的量tt
表2：PCR反应的执行条件tt
B、称取琼脂糖粉1g，加1×TAE电泳缓冲液100ml，微波炉加热至沸腾；tt待冷却至50℃～60℃左右，加入Gold View（EB替代品），倒入模具中冷却至凝tt固，待用。tt
C、取扩增后产物加6×Loading Buffer，混匀后加样，120V恒压电泳，分tt子量标准使用DNA DL2000Marker。tt
D、电泳完毕后，在凝胶成像系统紫外灯光下中进行结果观察和分析，结果tt见图3，从图中可以看出，扩增结果与预期一致，在150bp左右出现了一条很亮tt的条带，而阴性对照组没有扩增产物，扩增效果较好。tt
4）基因芯片杂交-纳米金探针浓度的优化tt
取PCV2（浓度为1000fM）100μl扩增产物和1000fM阳性对照于100℃tt加热5min，然后迅速冰浴2min。加入1ml0.3M PBS中，将制备好的芯片放置tt在恒温杂交箱中密闭轻微摇荡下50℃杂交120min。芯片取出在40℃预温的在tt0.1M的PBS中洗3次。将纳米金标记探针加在1ml0.1M PBS预温到40℃，tt与芯片杂交120min，取出用2×PBN室温洗2次。并晾干。tt
用lmL0.3M PBS稀释DNA-纳米金探针的浓度为0.2nM、0.7nM、1.2nM、tt1.7nM、2.2nM、2.7nM分别与完成第一步杂交的芯片杂交120min，取出用2×ttPBN室温洗涤三次，每次l～2min。晾干。tt
置于25℃硝酸银染色4min，然后肉眼进行观察结果见图4。从图中可以看tt出，信号密度随着DNA-纳米金的浓度(0.2nM到2.2nM)增高而增高，但到了1.7ttnM之后，检测点信号强度并没有明显加强，而背景信号明显加强，导致检测点tt与背景信噪比降低。另一方面，当纳米金的浓度低于0.7nM，PCV2和阳性对照tt检测点的信号强度太弱，肉眼观察或扫描仪都很难与阴性对照明显区分开来.考tttttt虑这些因素，优化纳米金探针的浓度为1.2nM。tt
5）基因芯片染色-银染时间的建立tt
取50fM到5000fM不同浓度的PCV2扩增后的目的片段与芯片杂交，并tt在4个不同的银染时间（1min、2min、4min和8min）下观察结果，结果见图tt5。结果表明，随着PCV2的浓度增加，以及银染时间的延长2～4min，信号强度tt也加强，但当银染时间长达8min时，检测点信号并没有很大幅度的上升，而背tt景信号强度明显增大，导致信噪比减小，造成检测结果不易观察。tt
当PCV2的扩增核酸片段浓度达到100fM以上时，适当提高银染时间4mintt可以在芯片上被检测出来，当核酸片断浓度达到500fM可以在芯片上很清楚地tt被检测到。当PCV2的扩增核酸片断浓度低至50fM时，信号强度下降，即使银tt染时间达到8min，都很难将PCV2检测点与阴性对照和背景信号明显区分出来。tt因为随着银染时间的延长，PCV2检测点的信号强度增大幅度很小，而背景信号tt显著增强。tt
实施例3样本的检测tt
运用实施例2建立的可目视化的基因芯片法检测小量PCV2样品直接进行检tt测，结果见图6，从结果可以看出，一共对24个样本进行了检测，其中基因芯tt片检测出阳性结果22例，阴性结果2例。PCV2检测点及阳性对照检测点均有tt良好的显色结果，肉眼清晰可见，而阴性对照无明显显影结果，且背景清晰。利tt用PCR检测方法检测相同的24个样品，具体操作参见实施例2，检测结果见图tt7，从图中可以看出，PCR方法测出阳性结果为22例，阴性结果为2例。PCV2tt基因芯片检测与PCR方法检测阳性结果一致。tt
