特异性的核酸配对交联方法
技术领域tt
本发明涉及核酸配对交联方法。具体地，本发明涉及由酶催化的序列tt特异性的核酸配对交联方法。tt
背景技术tt
双链DNA的交联会带来一系列严重后果，它会影响DNA的复制和转tt录，严重时会产生大量DNA损伤进而关系细胞的生存，世界上许多实验tt室在合成和研究基于DNA交联的化学分子，以期望开发出治疗癌症的药tt物。目前，有一些简单可控的化学交联基团已经用于生命科学的研究中，tt比如invitrogen公司的click chemistry，NHS-NH2，Thio-Thio等交联技术。tt然而，大多数DNA交联试剂都带有一些比较活跃的化学基团，这些基团tt在发挥其交联性质的同时，也能够与许多细胞内生物分子反应，加上这些tt分子的使用浓度比较高，它们往往带来严重的生物毒性，因而，开发低毒tt的交联试剂对于临床应用具有非常重大的意义。tt
发明概述tt
本发明方法的原理如下：苯二酚作为核酸交联的活性基团，在酪氨酸tt酶作用下，苯二酚被氧化为苯二醌继而与配对的核酸碱基上的氨基或者巯tt基发生氧化迈克尔加成反应。苯二酚的反应活性并不高，其被酪氨酸酶氧tt化成活性苯二醌时需要与相应反应基团非常接近才能反应，不配对的游离tt核酸几乎不与其发生交联，因而本发明特别适用于核酸印迹，探针杂交等tt生命科学研究领域。tt
本发明中使用的苯二酚作为核心交联基团与生物体内的儿茶酚以及tt多巴胺类化合物具有相似结构，作为还原性酚类是清除体内氧自由基的有tt效物质，因而由苯二酚修饰核酸的毒性很低。tt
发明内容：tt
本发明提供了由酶催化的序列特异性的核酸配对交联方法，该方法利tt用苯二酚与巯基交联应用于高效共价连接互补配对的两条DNA和\或ttRNA片段，或可以利用苯二酚与天然碱基上的氨基反应应用于核酸探针tt检测。tt
技术原理：tt
以DNA为例，如图1所示，当苯二酚修饰DNA与巯基修饰的DNAtt或未修饰DNA发生互补配对后，酪氨酸酶催化苯二酚氧化为苯二醌，处tt于活性状态下的苯二醌容易和附近的巯基或者氨基反应，该化学反应称氧tt化迈克尔加成。发生加成反应后互补配对的DNA不可逆的共价交联在一tt起。苯二醌容易与巯基反应，其次是氨基，当苯二醌周围没有配对DNAtt时，其可能被还原为苯二酚或者与自身所在DNA碱基上氨基发生反应。tt该反应中，苯二酚修饰DNA不能与游离DNA发生交联，故该方法适用于tt序列特异性DNA检测。tt
由于该反应利用苯二酚活化后的苯二醌与巯基或氨基的反应，本领域tt的普通技术人员完全可以确信本发明可以适用于DNA与DNA之间的交tt联，DNA与RNA之间的交联，以及RNA与RNA之间的交联。tt
在一个方面，1.本发明涉及制备核酸探针的方法，其特征在于将化合tt物中苯二酚基团连接到目的核酸上。tt
2.根据上述1的实施方案中，苯二酚基团通过酰胺键连接到氨基修饰tt的目的核酸上。tt
3.根据上述1-2任一个的实施方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)tt将化合物中的苯二酚通过酰胺键连接到氨基修饰的目的核酸上，优选地，tt所述化合物选自由3，4-二羟基苯乙酸或DL-3，4-二羟基杏仁酸，3，4-二羟基tt苯甲酸，3-(3，4-二羟苯基)丙酸，3-(3，5-二羟苯基)-1-丙酸，2，4-二羟基肉桂tt酸和咖啡酸组成的组。tt
4.根据上述1-3任一个的实施方案中，所述目的核酸是DNA或RNA。tt优选地，所述目的核酸是单链DNA或单链RNA。tt
5.根据上述2-4上述任一个的实施方案中，所述氨基修饰选自ttttttNH2-(-CH2-)n，n是选自1-20的整数，优选所述氨基修饰是NH2-(-CH2-)n，ttn是选自3-20的整数，更优选3-12的整数。在具体的实施方案中，所述tt氨基修饰选自NH2-(-CH2-)3，NH2-(-CH2-)6或NH2-(-CH2-)12，优选ttNH2-(-CH2-)6。tt
6.根据上述1-5任一个的实施方案中，所述苯二酚位于目的核酸的3’tt末端或5’末端。tt
在另一个方面，7.本发明涉及交联核酸的方法，其包括(1)将苯二酚tt基团连接到目的核酸上获得苯二酚修饰核酸；(2)在酪氨酸酶存在下，与苯tt二酚修饰核酸互补的核酸或与苯二酚修饰核酸互补的巯基修饰核酸与苯tt二酚修饰核酸反应。tt
8.根据上述7的方法，其中所述目的核酸进行了氨基修饰。tt
9.根据上述8的实施方案中，苯二酚基团通过酰胺键连接到氨基修饰tt的目的核酸上。tt
10.根据上述7-9任一个的实施方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)tt将化合物中的苯二酚通过酰胺键连接到氨基修饰的目的核酸上，优选地，tt所述化合物选自由3，4-二羟基苯乙酸，DL-3，4-二羟基杏仁酸，3，4-二羟基tt苯甲酸，3-(3，4-二羟苯基)丙酸，3-(3，5-二羟苯基)-1-丙酸，2，4-二羟基肉桂tt酸和咖啡酸组成的组。tt
11.根据上述7-10任一个的实施方案中，所述目的核酸是DNA或ttRNA。优选地，所述目的核酸是单链DNA或单链RNA。tt
12.根据上述8-11任一个的实施方案中，所述氨基修饰选自ttNH2-(-CH2-)n，n是选自1-20的整数，优选所述氨基修饰是NH2-(-CH2-)n，ttn是选自3-20的整数，更优选3-12的整数。在具体的实施方案中，所述tt氨基修饰选自NH2-(-CH2-)3，NH2-(-CH2-)6或NH2-(-CH2-)12，优选ttNH2-(-CH2-)6。tt
13.根据上述7-12任一个的实施方案中，所述苯二酚位于目的核酸的tt3’末端或5’末端。tt
14.根据上述7-13任一个的实施方案中，所述巯基修饰核酸中巯基与tt核酸的间隔臂是6个-CH2-基团。tt
15.根据上述7-14任一个的实施方案中，所述巯基位于核酸的5’端或tttttt3’端。tt
16.根据上述7-15任一个的实施方案中，在与苯二酚修饰核酸互补的tt巯基修饰核酸与苯二酚修饰核酸反应的情形中，另外添加10-100倍于所述tt巯基修饰核酸使用浓度的巯基还原剂。优选地，所述巯基还原剂选自由二tt硫苏糖醇(DTT)，巯基乙醇，半胱氨酸，谷胱甘肽和苯硫酚组成的组。tt
在另一个方面，17.本发明涉及制备核酸芯片的方法，包括(1)将苯二tt酚基团连接到用作探针的目的核酸上；(2)将苯二酚修饰后的目的核酸固tt定在支持物上。tt
18.根据上述17的方法，其中所述目的核酸是被氨基修饰的。tt
19.根据上述17或18的实施方案中，苯二酚基团通过酰胺键连接到tt氨基修饰的目的核酸上。tt
20.根据上述17-19任一个的实施方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺tt(NHS)将化合物中的苯二酚通过酰胺键连接到氨基修饰的目的核酸上，优tt选地，所述化合物选自由3，4-二羟基苯乙酸，DL-3，4-二羟基杏仁酸，3，4-tt二羟基苯甲酸，3-(3，4-二羟苯基)丙酸，3-(3，5-二羟苯基)-1-丙酸，2，4-二羟tt基肉桂酸和咖啡酸组成的组。tt
21.根据上述17-20任一个的实施方案中，所述目的核酸是DNA或ttRNA。优选地，所述目的核酸是单链DNA或单链RNA。tt
22.根据上述17-21任一个的实施方案中，所述氨基修饰选自ttNH2-(-CH2-)n，n是选自1-20的整数，优选所述氨基修饰是NH2-(-CH2-)n，ttn是选自3-20的整数，更优选3-12的整数。在具体的实施方案中，所述tt氨基修饰选自NH2-(-CH2-)3，NH2-(-CH2-)6或NH2-(-CH2-)12，优选ttNH2-(-CH2-)6。tt
23.根据上述17-22任一个的实施方案中，所述苯二酚位于目的核酸tt的3’末端或5’末端。tt
在另一个方面，24.本发明涉及检测互补核酸的试剂盒，其包含连接tt苯二酚的检测核酸和酪氨酸酶。tt
25.根据上述24的实施方案中，苯二酚基团通过酰胺键连接到氨基修tt饰的检测核酸上。tt
26.根据上述24-25任一个的实施方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺tttttt(NHS)通过酰胺键将化合物中的苯二酚连接到氨基修饰的检测核酸上，优tt选地，所述化合物选自由3，4-二羟基苯乙酸，DL-3，4-二羟基杏仁酸，3，4-tt二羟基苯甲酸，3-(3，4-二羟苯基)丙酸，3-(3，5-二羟苯基)-1-丙酸，2，4-二羟tt基肉桂酸和咖啡酸组成的组。tt
27.根据上述24-26任一个的实施方案中，所述检测核酸是DNA或ttRNA。优选地，所述检测核酸是单链DNA或单链RNA。tt
28.根据上述24-27任一个的实施方案中，所述氨基修饰选自ttNH2-(-CH2-)n，n是选自1-20的整数，优选所述氨基修饰是NH2-(-CH2-)n，ttn是选自3-20的整数，更优选3-12的整数。在具体的实施方案中，所述tt氨基修饰选自NH2-(-CH2-)3，NH2-(-CH2-)6或NH2-(-CH2-)12，优选ttNH2-(-CH2-)6。tt
29.根据上述24-28任一个的实施方案中，所述苯二酚位于检测核酸tt的3’末端或5’末端。tt
30.根据上述24-29任一个的实施方案中，当所述互补核酸为巯基修tt饰的核酸时，所述试剂盒还包含巯基还原剂，所述巯基还原剂选自由二硫tt苏糖醇(DTT)，巯基乙醇，半胱氨酸，谷胱甘肽和苯硫酚组成的组，并tt且所述巯基还原剂的使用浓度是所述巯基修饰核酸使用浓度的10-100倍。tt
31.根据上述24-30任一个的实施方案中，所述巯基修饰核酸中巯基tt与核酸的间隔臂是6个-CH2-基团。tt
32.根据上述24-31任一个的实施方案中，所述巯基位于核酸的5’端tt或3’端。tt
在另一个方面，33.本发明涉及包含苯二酚的化合物在修饰核酸中的tt应用。优选地，所述核酸是DNA或RNA；更优选，单链DNA或单链RNA。tt
34.根据上述33的实施方案中，所述化合物选自所述化合物选自由tt3，4-二羟基苯乙酸，DL-3，4-二羟基杏仁酸，3，4-二羟基苯甲酸，3-(3，4-二羟tt苯基)丙酸，3-(3，5-二羟苯基)-1-丙酸，2，4-二羟基肉桂酸和咖啡酸组成的组。tt
附图说明：tt
图1.苯二酚在酪氨酸酶催化下与核酸碱基(以碱基A为例)或巯基反tt应的示意图。tt
图2.苯二酚修饰DNA(Ru)与巯基修饰互补DNA(Ru-ds)或互补ttDNA(Ru-d)的交联示意图。其中Marker-1指示的是Ru和互补DNA形tt成发夹的电泳位置，4-5道是Ru与互补巯基修饰DNA配对交联，6-7道tt是Ru与非巯基DNA配对交联，8-9道是无苯二酚修饰DNA(Ru-N)与tt巯基修饰互补DNA的交联。T-，T+分别表示不加和加酪氨酸酶，黑色箭tt头指示交联的DNA条带。tt
图3.苯二酚修饰DNA与互补DNA或巯基修饰互补DNA的交联受tt不同浓度DTT的影响。符号“C”表示交联产物位置，符号“O”表示原tt始DNA的位置。tt
图4.苯二酚修饰DNA与互补配对DNA以及不配对DNA之间的交tt联反应。黑色箭头标示交联位置，T-，T+分别表示不加和加酪氨酸酶进行tt反应。tt
图5.苯二酚修饰位点以及间隔臂长度对交联反应的影响。图(A)是tt苯二酚修饰DNA与巯基修饰互补DNA(DPH-ds)的交联，图(B)是苯tt二酚修饰DNA与未修饰DNA(DPH-d)的交联。DPH-C3，C6，C12分tt别表示苯二酚与DNA之间的间隔臂长度分别为3，6，12个-CH2-，第4-9tt道中苯二酚修饰DNA与互补DNA进行配对，T-和T+分别表示不加和加tt酪氨酸酶反应。黑色箭头标示交联条带。tt
图6.双链DNA配对区的长度对交联反应的影响。图B是荧光染料染tt色结果，图A是图B染色前FAM荧光扫描结果。Lru-ds链3’端修饰了FAMtt基团，图A的6-7道中迁移速度慢的为交联条带。图A中第6-7道为苯二tt酚修饰DNA(Ru，Lru)与巯基修饰互补DNA(Lru-ds)的交联(对应图B的tt6-7道)，图B第8-9道是苯二酚修饰DNA(Ru，Lru)与未修饰DNA(Lru-d)tt的交联。Marker-3，4分别指示未修饰交联产物长度。T+表示加酪氨酸酶，tt黑色箭头指示交联条带。tt
图7.苯二酚修饰DNA与配对RNA之间的交联。Marker-4同图6，tt其大小指示Lru与其配对RNA形成的发夹的电泳位置，由于RNA迁移速tt度比DNA慢，所以DNA-RNA交联后的条带位置比marker-4位置更高。ttT-，+分别表示不加和加酪氨酸酶，黑色箭头指示交联条带。tt
图8.苯二酚衍生物修饰DNA与互补巯基修饰DNA和互补非巯基修tttttt饰DNA之间的交联。(A)苯二酚衍生物DL-3，4-二羟基杏仁酸和3，4-二羟tt基苯乙酸的结构式。(B)苯二酚衍生物-DL-3，4-二羟基杏仁酸修饰DNAtt(DHM)与互补DNA在酪氨酸酶催化下的交联结果，其中4-5道是DHMtt与互补巯基修饰DNA交联，6-7道是DHM与互补非巯基修饰DNA交联。ttT-，T+分别表示不加和加酪氨酸酶，黑色箭头指示交联条带。tt
具体实施方式tt
使用的材料tt
3’(-CH2-)n-NH2修饰DNA(n＝3，6或12)在Takara公司合成实验中所用tt的其它核酸序列也在Takara公司合成。tt
使用试剂：3，4-二羟基苯乙酸(CAS：102-32-9)，分子量168.15；DL-3，4-tt二羟基杏仁酸(CAS：14883-87-5)，分子量184.15；EDC分子量191.7；NHStt分子量115；DMSO；1M MES缓冲液(pH 5.5)；0.1M四硼酸钠缓冲液tt(pH8.5)；0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.5)；1.5M KCl；酪氨酸酶(来源于tt蘑菇)40U/μl，购自sigma公司。tt
化学试剂购自sigma公司。tt
合成的核酸序列如下表。tt
表1：tt
注：除了DHM为台成的3’(-CH2-)n-NH2修饰核酸按照实施例1的实验步骤1与ttDL-3，4-二羟基杏仁酸反应纯化后获得以外，其它苯二酚标记的核酸都是合成的3’tt(-CH2-)n-NH2修饰核酸按照实施例1的实验步骤1与3，4-二羟基苯乙酸反应后纯化得到tt的。tt
实验步骤：tt
1.苯二酚修饰DNA：tt
a)NHS-苯二酚活化酯制备，按摩尔比EDS∶NHS∶COOH＝5∶2∶1tt取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)9.5mg，NHS(N-羟基tt琥珀酰亚胺)2.3mg，3，4二羟基苯乙酸1.68mg(实施例1-6)或者DL-3，4-tt二羟基杏仁酸1.84mg(实施例7)加入到200μl含有20mM MES(2-(N-tttttt吗啉)乙磺酸)(pH5.5)的DMSO中，混匀，冰上反应20分钟tt
b)NHS-苯二酚活化酯与合成的氨基修饰DNA(在DNA的3’末端tt添加间隔臂NH2-(CH2-)1-20基团)反应，取14μl活化酯加入11μl氨基修tt饰DNA(10ug/μl)，以及75μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)，混匀，tt常温避光反应12小时。tt
c)苯二酚修饰DNA纯化，取1ml G-25脱盐柱(GE Healthcare)，tt1000g离心1分钟去除储存液，将100μl上述反应产物加到脱盐柱上，1000gtt离心4分钟，收集离心下来的溶液中为苯二酚修饰DNA。若还有部分底tt物未去除干净，重复步骤c以得到纯化的苯二酚修饰DNA。tt
2.DNA样品准备tt
合成DNA用超纯水溶解至100μM原液，长期储存在-80度。苯二酚tt修饰的DNA以及其互补DNA以摩尔浓度1∶1稀释在20mM磷酸钠(pHtt6.5)缓冲液中，终浓度1μM。tt
3.酪氨酸酶催化的DNA-DNA配对交联tt
酪氨酸酶从sigma公司购买，酪氨酸酶反应缓冲液体系是本领域公知tt的，可以是磷酸盐，碳酸盐，二甲基砷酸盐等不含伯胺和仲胺缓冲体系，tt缓冲液中可以含有0-200nM单价阳离子或者0-20mM Mg2+等离子，不需tt要含有DTT等还原剂。反应温度在20-45度之间。反应需要有空气，适合tt在玻片表面反应。每40μl上述步骤制备的DNA样品中加入40U酪氨酸tt酶，充分混匀后37℃放置30min，样品暴露空气中，环境湿度维持接近饱tt和蒸汽压，以减少样品中水分蒸发。tt
4.交联产物检测tt
酪氨酸酶反应完成后，取5μl样品加入到15μl去离子甲酰胺中，95Ctt下加热变性5分钟，冰上骤冷。制备12％尿素丙烯酰胺变性胶，每个变tt性的DNA样品点样10μl，30V/cm电泳25分钟。尿素变性胶用荧光染tt料geneshow染色，使用荧光扫描成像系统扫描拍照。tt
实施例1tt
苯二酚修饰DNA与巯基修饰互补DNA或互补DNA之间交联tt
1.苯二酚修饰核酸与巯基修饰互补核酸的交联反应步骤：tt
(a)苯二酚修饰核酸与互补巯基修饰核酸加入到25μl磷酸钠缓冲液，tt其中包含20mM磷酸钠(pH 6.5)，150mM KCl，10-100μM DTT，加入tt40U酪氨酸酶，37度下暴露空气中反应20分钟tt
(b)交联产物检测，上述交联产物取5μl加入到15μl去离子甲酰tt胺中，95度变性5分钟，点样10μl于12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，20ttV/cm电泳20分钟，凝胶染色检测交联条带。发生交联的核酸不会被甲酰tt胺变性打开，电泳时迁移速度慢的条带即可判断是交联的DNA。tt
2.苯二酚修饰核酸与互补核酸交联反应tt
(a)苯二酚修饰核酸与互补未修饰核酸加入到25μl磷酸钠缓冲液，tt其中包含20mM磷酸钠(pH 6.5)，150mM KCl，加入40U酪氨酸酶，tt37度下暴露空气中反应20分钟tt
(b)交联产物检测，上述交联产物取5μl加入到15μl去离子甲酰tt胺中，95度变性5分钟，点样10μl于12％尿素变性丙烯酰胺凝胶，20V/cmtt电泳20分钟，凝胶染色检测交联条带。发生交联的核酸不会被甲酰胺变tt性打开，电泳时迁移速度慢的条带即可判断是交联的核酸。tt
使用图2中所示核酸进行上述反应。如图2所示，苯二酚修饰DNAtt(Ru)与其互补配对DNA(巯基修饰互补DNA(Ru-ds)和互补DNA(Ru-d))tt发生反应后(第5，7道)，互补的DNA交联在一起，在电泳图里面表现tt出和第3道marker-1一样的迁移速度。苯二酚修饰的DNA(Ru)与有巯基tt修饰的互补DNA(Ru-ds，第5道)比未修饰互补DNA(Ru-d，第7道)tt之间的交联程度要高，说明苯二酚与巯基反应能力大于其与氨基反应的能tt力。对照组第8-9道中，去掉苯二酚修饰后，互补配对DNA之间不发生tt交联，说明DNA的交联是由苯二酚主导的。tt
实施例2tt
DTT调节苯二酚修饰DNA的交联反应tt
交联反应的本质是氧化迈克尔加成反应，顾名思义，氧化反应会受溶tt液中还原剂的影响。使用DTT一方面作为还原剂可以抑制氧化反应，另tt一方面，DTT上的巯基也是能够与苯二醌反应的底物。tt
使用图3所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰核tt酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应，除了在两种互补核酸的tt交联反应中使用1-1000μM的DTT。tt
如图3所示，DTT的使用浓度在DNA浓度10倍以上时(见Ru+Ru-dtt组)，其完全抑制了苯二酚修饰DNA(Ru)与未修饰DNA(Ru-d)的交联；tt而作为竞争底物，DTT浓度需要在DNA浓度100倍以上才能竞争抑制苯tt二酚修饰DNA(Ru)与互补巯基修饰DNA(Ru-ds)发生交联(见ttRu+Ru-ds)。tt
因而，在实际应用中，DTT可以作为调节交联反应的钥匙：当需要苯tt二酚修饰DNA与未修饰DNA交联时不需要加DTT并且杜绝溶液中的还tt原剂，当需要苯二酚修饰DNA与巯基修饰DNA交联时，可以加入10-100tt倍DNA浓度的DTT防止非特异性交联而不影响巯基修饰DNA的交联。tt
实施例3tt
苯二酚修饰DNA的交联反应需要DNA之间的互补配对tt
使用图4中所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰tt核酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应。tt
在图4中，苯二酚修饰DNA(Ru)与其互补配对DNA(Ru-ds)发tt生极大程度交联(第4道)，而与25nt随机序列(N25s)之间不发生交联tt(第6道)，并且随机序列的存在不影响Ru与Ru-ds之间的交联(第8道)。tt
实施例4tt
苯二酚修饰位点以及苯二酚与核酸之间间隔臂长度对交联反应的影响tt
使用图5中所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰tt核酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应。tt
图2-4中，3’端修饰的苯二酚可以与互补的巯基修饰和未修饰DNA发tt生交联，将苯二酚修饰更换到DNA的5’端时，如图5所示，苯二酚修饰ttttttDNA依然可以发生交联。tt
苯二酚修饰DNA时，一般需要有-CH2-组成的间隔臂(其通过对核酸tt进行氨基修饰产生)，改变间隔臂长度从3个到12个时，苯二酚与巯基之tt间的交联反应影响不大(图5A第7-9道)；苯二酚与未修饰DNA之间的tt反应受间隔臂长度影响较大，图5B中显示间隔臂长度为6时更适合发生tt交联。tt
实施例5tt
双链DNA配对区的长度对交联反应的影响tt
使用图6中所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰tt核酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应。tt
图4的结果显示，苯二酚修饰DNA的交联反应发生在互补配对DNAtt之间，说明交联反应需要苯二酚基团与氨基或者巯基距离足够接近。在图tt6中，实验使用两个不同配对长度的DNA进行交联实验。由于DNA长度tt不一样，染色效率不同，此处使用的巯基修饰DNA链同时还修饰了可以tt通过荧光检测的FAM基团，如图6A所示，两个长度苯二酚修饰DNA(Ru，ttLru)与巯基修饰DNA的交联效率差别不大。图B中染色结果显色，DNAtt配对区更长时，苯二酚与未修饰DNA的交联更强。tt
实施例6tt
苯二酚修饰DNA与配对RNA的交联反应tt
使用图7中所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰tt核酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应。tt
苯二酚修饰的核酸与互补核酸之间的交联反应的本质是苯二酚基团tt在酪氨酸酶催化下与互补核酸上碱基上的氨基反应，而DNA和RNA在碱tt基上除了U和T以外是一样的，因而苯二酚修饰DNA也能够与互补配对ttRNA发生交联。如图7所示，修饰了苯二酚的DNA链(Lru)与配对的ttRNA链(Lru-RNA)在酪氨酸酶催下下发生了明显交联。tt
实施例7tt
苯二酚衍生物修饰DNA与配对DNA的交联反应tt
使用图8中所示的核酸，重复实施例1中的实验步骤进行苯二酚修饰tt核酸与巯基修饰互补核酸或互补核酸之间交联反应。tt
除了3，4-二羟基苯乙酸以外，其它一些带有苯二酚基团的化合物也可tt以修饰到核酸上，应用于本发明中酪氨酸酶催化下的核酸-核酸交联反应，tt如图8所示，按照实施例1的方法，使用DL-3，4-二羟基杏仁酸修饰核酸tt后，其在酪氨酸酶催化下也可以和互补的巯基修饰核酸发生交联。DL-3，4-tt二羟基杏仁酸相比3，4-二羟基苯乙酸差别在于其2位碳上多一个羟基，羟tt基的存在导致交联的效果降低(图8第5道，相比图2第5道)，说明侧tt链基团不同会对交联效率有影响。基于本发明中交联的原理，侧链基团中tt不含有氨基(伯胺，仲胺)，巯基等苯二酚的衍生物都可以作为修饰化合tt物。tt
