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一种基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组建库方法

2021-03-24 04:49:35

一种基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组建库方法

　　技术领域tt

　　本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于ⅡB型限制性内切tt酶酶切的简化基因组建库方法。tt

　　背景技术tt

　　简化基因组测序是一种对部分基因组进行序列测定的高通量测序方法。tt具体来说，它是指利用生物信息学方法，设计标记开发方案，富集特异性长tt度片段，然后应用高通量测序技术获得海量标签序列来代表目标物种全基因tt组信息的测序方法。tt

　　简化基因组测序常用的测序文库类型可以归纳为3个大类，①简化测序，tt包括简化文库和简化多态序列复杂性；②限制性酶切位点关联DNA测序；③tt低覆盖基因分型文库，包括多元鸟枪法基因分型和基于测序的基因分型。tt

　　基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组测序，即2b-RAD，这个方法tt属于简化基因组测序方法中的限制性酶切位点关联DNA测序这一类。相比于tt其他类的简化基因组测序方法，2b-RAD在建库方法上有了新的改进，且成本tt更加便宜。该方法能涵盖基因组中的几乎全部限制酶切位点，不同于RRLs、ttCroPS和GBS等方法，仅仅能覆盖一个有限的区域，一般不超过500bp，所以tt可以更有效的进行PCR和测序。2b-RAD的操作方法比较简单，因此更适合于tt大批样本的同时分型。但是现有文献中记载的2b-RAD方法大多存在酶切不均tt匀导致标签数少，接头连接效率低和文库浓度低等不足之处。tt

　　发明内容tt

　　本发明的一个目的在于提供一种基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基tt因组建库方法，该方法建库流程简便快捷，且建得文库的准确性高。tt

　　为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种基于ⅡB型限制性tt内切酶酶切的简化基因组建库方法，包含下述步骤：(1)利用ⅡB型限制性tt内切酶对基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；(2)对酶切产物连接接头tt一和接头二，得到连接产物；(3)对连接产物进行纯化，得到纯化后的连接tt产物；(4)将纯化后的连接产物进行PCR扩增，得到PCR产物；(5)对ttPCR产物进行纯化，得到测序文库。其中，步骤(1)中所述的ⅡB型限制性tt内切酶为BsaXI酶；步骤(2)中所述的接头一由序列如SEQ ID NO：1和ttSEQ ID NO：2所示的两个核苷酸片段杂交合成、所述的接头二由序列如SEQ ttID NO：3和SEQ ID NO：2所示的两个核苷酸片段杂交合成。tt

　　本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组tt建库方法，采用BsaXI酶对基因组DNA进行酶切，在基因组DNA的靶标位点tt上游和下游位点切断DNA,获得长度一致的酶切产物DNA片段。然后，在酶切tt产物DNA片段的两端再连接特异性接头一和接头二，其中接头一由序列如ttSEQ ID NO：1(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷tt酸片段杂交合成、接头二由序列如SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)和SEQ ID NO：tt2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段杂交合成(在下述碱基序列中，N代表tt一个任意碱基，*N代表该碱基N硫代修饰)：tt

　　SEQ ID NO：1：5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNN*N-3'tt

　　SEQ ID NO：2：5'-/5Phos/AGATCGGAAGAGC/3InvdT/-3'tt

　　SEQ ID NO：3：5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNN*N-3'tt

　　如上所示，在杂交合成接头一或接头二的核苷酸片段中，SEQ ID NO：1tt(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)在3’末端都有硫代修饰；而ttSEQ ID NO：2(anti-ILL)的3’末端的羟基去除，这样可起到封闭作用，tt其目的是防止酶切后3’末端连续地加上多个接头。在对酶切产物进行了接tt头连接之后，本发明的实施方式增加了对连接产物进行纯化的步骤(4)，以tt去除连接产物中的蛋白等杂质，防止这些杂质对后续PCR反应的影响。然后，tt本发明的实施方式对纯化后的连接产物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯tt化，进而得到用于测序的文库，该建得的测序文库涵盖基因组中的几乎全部tt限制酶切位点，可以更有效地进行上机测序，且整个建库过程的操作简便快tt捷，建库成本较低。tt

　　优选地，本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简tt化基因组建库方法中，步骤(1)中采用BsaXI酶对基因组DNA进行酶切时，ttBsaXI酶的用量为：每500ng基因组DNA使用1.25μL BsaXI酶；且该酶切tt操作在PCR仪中进行，PCR程序为：37℃，4小时。本发明的实施方式所提tt供的ⅡB型限制性内切酶酶切的简化基因组建库方法中，在利用BsaXI酶对tt基因组DNA进行酶切时，提供了上述BsaXI酶的最佳用量和最佳酶切时间，tt具体来说：首先，对每500ng基因组DNA使用1.25μL BsaXI酶进行酶切，tt使酶切效果更明显，但又不会反过来抑制酶切效果；其次，本发明发现在利tt用BsaXI酶进行酶切1小时后，基因组DNA降解不明显；酶切4小时后，降tt解较明显；而如果酶切时间大于4h，并不会加强酶切效果，因此酶切时间设tt为4小时为最佳方案。相对于现有技术，本发明的实施方式在确保最终获得tt较好建库结果的前提下，实现了对建库时间和成本的有效控制。tt

　　优选地，本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简tt化基因组建库方法中，步骤(2)中，杂交合成接头一或接头二的PCR程序为：tt95℃，5分钟，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃。该PCR程序的设定可保证tt序列如SEQ ID NO：1(5ILL-NNN)和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两tttttt个核苷酸片段成功杂交合成接头一、同时序列如SEQ ID NO：3(3ILL-NNN)tt和SEQ ID NO：2(anti-ILL)所示的两个核苷酸片段成功杂交合成接头二，tt确保了后续实验的顺利进行。tt

　　优选地，本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简tt化基因组建库方法中，步骤(2)中对酶切产物连接接头一和接头二所采用的tt反应体系如下所示：酶切产物60μL，10×T4连接酶缓冲液10μL，10μM接tt头一2μL，10μM接头二2μL，T4DNA连接酶2μL，ddH2O 24μL，总100μL。tt上述对酶切产物进行接头连接的反应体系为针对本发明的酶切产物和连接头tt所专门设定的，该连接反应于4℃过夜进行，保证了接头一、接头二与酶切tt产物两端之间的特异性连接。tt

　　优选地，本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简tt化基因组建库方法中，步骤(3)中采用磁珠法对连接产物进行纯化。相比于tt其他的纯化方法，采用磁珠法对连接产物进行纯化，可减少纯化过程中化学、tt物理因素对核酸的破坏降解，且减少纯化过程中引入误差和污染的可能性，tt进一步提高最终建得文库的准确性。tt

　　优选地，本发明的实施方式所提供的基于ⅡB型限制性内切酶酶切的简tt化基因组建库方法中，步骤(4)中对纯化后的连接产物进行PCR扩增的反tt应体系如下所示：高保真DNA聚合酶1μL，5×HF Buffer 10μL，2.5mM dNTPtt6μL，10μM SEQ ID NO：4(IC1-P5)所示的P5接头引物1μL，10μM SEQ ID ttNO：5(IC2-P7)所示的P7接头引物1μL，10μM SEQ ID NO：6(ILL-Mpx)tt所示的R2引物1μL，10μM带条形码序列的R1引物1μL，纯化后的连接tt产物20μL，ddH2O 9μL，总50μL。其中(下述碱基序列中，*A和*T分别tt代表硫代修饰的A碱基和硫代修饰的T碱基)：tt

　　SEQ ID NO：4：5'-AATGATACGGCGACCACCG*A-3'tt

　　SEQ ID NO：5：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG*A-3'tt

　　SEQ ID NO：6：tt

　　5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA ttCGCTCTTCCGATC*T-3'tt

　　此外，在上述扩增体系中，带条形码序列的R1引物的序列如SEQ ID NO：tt7(ILL-RAD-bc13)、SEQ ID NO：8(ILL-RAD-bc14)、SEQ ID NO：9tt(ILL-RAD-bc15)或SEQ ID NO：10(ILL-RAD-bc16)所示(下述碱基序tt列中，*T代表硫代修饰的T碱基)：tt

　　SEQ ID NO：7：tt

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTC ttAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'tt

　　SEQ ID NO：8：tt

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTC ttAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'tt

　　SEQ ID NO：9：tt

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTC ttAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'tt

　　SEQ ID NO：10：tt

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTC ttAGACGTGTGCTCTTCCGATC*T-3'tt

　　进一步，利用上述PCR反应体系对连接产物进行扩增的反应程序如下所tt示：98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行tt12个循环；然后72℃5分钟；最后4℃保存。本发明的实施方式所提供的ttPCR反应体系及反应程序，能保证对纯化后的连接产物完成扩增，扩增完成tt之后，采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行纯化和胶回收，制备得到用于tt上机测序的文库。tt

　　附图说明tt

　　图1是实施例1中甜瓜基因组DNA检测电泳图，其中从左至右各泳道tt依次代表：Marker、1号甜瓜基因组DNA、2号甜瓜基因组DNA、3号甜瓜tt基因组DNA、4号甜瓜基因组DNA；tt

　　图2是实施例1中的酶切预实验电泳图，其中从左至右各泳道分别代表tt酶切时间为1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时和16小时的酶tt切结果；tt

　　图3是实施例1中的PCR产物检测电泳图，其中从左至右各泳道依次代tt表Marker、1号甜瓜基因组文库、1号甜瓜基因组文库、2号甜瓜基因组文库、tt2号甜瓜基因组文库、3号甜瓜基因组文库、3号甜瓜基因组文库、4号甜瓜tt基因组文库、4号甜瓜基因组文库、Marker；tt

　　图4是实施例1中的文库2100检测图。tt

　　具体实施方式tt

　　为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发tt明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，tt在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细tt节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，tt也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。tt

　　实施例1tt

　　1、设计并合成下表中的接头与引物序列，以备在本实施例的建库过程中使用：tt

　　2、待测基因组DNA提取tt

　　分别提取来自不同个体甜瓜叶片的基因组NDA(分别为1号甜瓜基因组ttDNA、2号甜瓜基因组DNA、3号甜瓜基因组DNA、4号甜瓜基因组DNA)，tt作为本实施例的建库对象。提取操作简述如下：tt

　　2.1取100mg新鲜叶片组织，加入液氮充分研磨。tt

　　2.2利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取。tt

　　2.3提取好的DNA进行质检。此处对其进行琼脂糖凝胶电泳检测，如附tt图1所示。tt

　　3、酶切tt

　　3.1预实验(取1号甜瓜基因组DNA)tt

　　取7份500ng甜瓜基因组DNA进行酶切预实验。体系如下：tt

　　酶切时间分别1h，2h，3h，4h，6h，8h和16h，酶切产物用琼脂糖凝胶tt电泳进行检测。电泳图如附图2。tt

　　3.2正式酶切tt