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一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用

2021-02-04 00:55:45

一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用

  技术领域t

  本发明属于基因工程技术领域,具体涉及两条特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用。t

  背景技术t

  2010年,斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点,命名为hipp11位点,简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙,与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻,大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间,因此安全性较高,无基因沉默效应,具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Ros26位点,但是该位点为一个基因,其启动子为全身性广谱表达,难以做到组织特异性表达,然而H11位点则不存在类似的困难,由于其位于两基因之间,并且不存在启动子,所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达,更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点,将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。t

  ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术,但是这两种技术构建程序较为繁琐,每一个位点需要构建一对相应的核酸酶,而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导,CRISPR区可以有一系列的crRNA组成,每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基,整个载体较小,相对于ZFN和TALEN载体,更加容易构建。t

  (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中,进行有效的靶向酶切,非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25%之间,与TALEN酶切效果相当。他们还证明,多个靶点可以同时进行靶向酶切。 但是,随后的研究表明,Cas9存在较为明显的脱靶效应,麻省理工学院Feng Zhang团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity.Cell.Ran et al,2013),维护了Cas9在基因打靶技术领域的地位。借助于这一技术,动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。t

  发明内容t

  本发明针对猪的H11位点设计了一对特异性识别猪H11位点的sgRNA,本发明还提供了其相应的编码DNA和应用。本发明是利用编码这对sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体,该表达载体能够表达出这对sgRNA,这对sgRNA能够特异性地识别猪H11位点。本发明还利用这对sgRNA引导Cas9n核酸酶(即Cas9切刻酶)对猪H11位点进行准确、高效地靶向修饰。t

  为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:t

  一对特异识别猪H11位点基因的sgRNA,由sgRNA-L和sgRNA-R组成;sgRNA-L和sgRNA-R分别由101个核苷酸组成,其中5’末端20nt的RNA片段(分别命名为sgRNA-L20和sgRNA-R20)可以识别染色体上特定的DNA序列,其余81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成发夹结构,与Cas9n核酸酶结合,从而引导Cas9n核酸酶切割靶标DNA单链,两个单链切口导致双链断裂(DSB),细胞利用自身修复功能,使得靶标位点附近的序列发生变化;另外,这对sgRNA识别的DNA靶序列呈“头对头”的排布方式(即二者的5’末端相互靠近),二者相距4bp,即有4bp的间隔。t

  sgRNA-L的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2):t

  1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列;t

  2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列;t

  sgRNA-R的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下3)或4):t

  3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列;t

  4)将所述3)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加 且具有与3)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列;t

  本发明还提供了编码上述特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。t

  上述的DNA分子由编码sgRNA-L的DNA分子和编码sgRNA-R的DNA分子组成。t

  进一步的,上述的DNA分子由编码sgRNA-L的DNA分子甲和编码sgRNA-R的DNA分子乙组成。t

  其中,上述DNA分子甲的核苷酸序列由序列表中的序列3所示。t

  其中,上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。t

  本发明的另一个目的是提供该对sgRNA在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。所述的猪H11基因,其核苷酸序列是如序列表中的序列5所示。t

  本发明的再一个目的是该对特异sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。所述的猪H11基因,其核苷酸序列如序列表中的序列5所示。t

  本发明提供的一对特异识别猪H11基因的sgRNA,特异性强,能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象,能大大增加外源基因定点插入的效率,进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的突变带来的影响。且本发明提供的一对该sgRNA的编码DNA片段,能通过Cas9系统在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰,以解析猪H111基因的功能、构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持,为转基因猪的制备提供了稳定的平台。t

  附图说明t

  图1为凝胶电泳检测分析酶切载体结果图。t

  具体实施方式t

  以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下,对本发明所作的修饰或者替换,均属于本发明的范畴。t

  实施例1 sgRNA表达质粒对的构建t

  1、sgRNA靶点设计t

  根据小鼠的H11位点,找到猪的Eif4与Drg基因(小鼠的位点位于该两基因中间),在NCBI中调出中间区域找出猪H11位点,其核苷酸序列如序列表中的序列5所示,t

  根据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点,PAM序列为NGG:t

  sgRNA-L靶位点位置1(命名为H11-sgL2):t

  AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGGt

  相对应的sgRNA-L序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中的序列1所示;编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列3所示。t

  sgRNA-R靶位点位置2(命名为H11-sgR1):TTCCAGGAACATAAGAAAGTAGG,相对应的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列如序列表中序列2所示;编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列4所示。两个靶序列呈“头对头”的排布方式,二者相距4bp,即有4bp的间隔。t

  2、sgRNA表达质粒对的构建t

  首先根据靶序列设计引物序列,后送至北京天一辉远生物科技有限公司合成单链寡核苷酸,具体序列如下:t

  (1)H11-sgL2:t

  H11-sgL2-F:CACCGAGATCAGGGTGGGCAGCTCTt

  H11-sgL2-R:AAACAGAGCTGCCCACCCTGATCTCt

  (2)H11-sgR1:t

  H11-sgR1-F:CACCGTTCCAGGAACATAAGAAAGTt

  H11-sgR1-R:AAACACTTTCTTATGTTCCTGGAACt

  其中H11-sgL2-F与H11-sgL2-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段H11-sgL2,将pX335(addgene,Plasmid 42335)载体(其核苷酸序列如序列表中的序列6所示)经BbsⅠ酶切回收片段,将gL2连入该片段中,获得pX335-sgRNA-H11-L载体;H11-sgR1-F与H11-sgR1-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段H11-gR1,将pX335载体经BbsⅠ酶切回收片段,将gR1连入该片段中,获得pX335-sgRNA-H11-R载体。两个质粒均送北京天一辉远生物科技有 限公司测序验证,测序引物bbsR的序列为:5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3',测序结果分别如序列表中的序列7和序列8所示。该结果表明,通过上述操作能顺利将sgRNA的靶位点1和靶位点2的序列插入到pX335载体骨架中。t

  实施例2 sgRNA表达质粒对的效率验证t

  1、分离猪胎儿成纤维细胞。t

  从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞,具体操作参见文献:李红,魏红江,许成盛,汪霞,卿玉波,曾养志;版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征。t

  2、核转染t

  将重组质粒pX335-sgRNA-H11-L与pX335-sgRNA-H11-R各2μg通过电转化的方式共同转染PEF细胞,得到重组细胞。转染的具体步骤是:使用核转仪(Amaxa,型号:AAD-1001S)及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒(Amaxa,货号:VPI-1002)进行转染。首先使用0.1%胰蛋白酶(Gibco,货号:610-5300AG)消化贴壁细胞,用胎牛血清(Gibco,货号:16000-044)终止消化,磷酸盐缓冲液(Gibco,货号:10010-023)洗涤细胞两次,添加转染试剂,使用程序T-016转染细胞。t

  3、DNA的提取t

  将步骤2得到的重组细胞37℃培养48小时,然后收集细胞。具体步骤是:首先使用0.1%胰蛋白酶(Gibco,货号:610-5300AG)消化贴壁细胞,用胎牛血清(Gibco,货号:16000-044)终止消化,磷酸盐缓冲液(Gibco,货号:10010-023)洗涤细胞两次,添加200微升细胞裂解液GA(TIANGEN公司DNA提取试剂盒DP304中的组分)。参考试剂盒说明书步骤提取该重组细胞的总DNA。t

  4、PCR酶切效率验证t

  (1)利用引物t

  H11-F:5'-GCGAGAATTCTAAACTGGAG-3';t

  H11-R:5'-GATCTGAGGTGACAGTCTCAA-3't

  分别以步骤3中的细胞DNA为模板,进行PCR扩增,回收387bp片段。利用唯尚力德公司T7核酸内切酶I(T7endonuclease I,T7E1)(货号:#E001L)进行酶切鉴定。具体步骤为:t

  (2)突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按如下体系进行混合,进行加热变性、退火复性处理(95℃5min,自然冷却至室温)。t

  (3)上述反应体系分别加入0.5ul T7E1酶,37℃反应30min后,跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果,靶点的酶切结果见图1:如果sgRNA有效果,靶位置1将切出160bp+230bp条带,靶位置2将切出170bp+220bp条带,从图中1可以看到模糊的酶切片段,因此该对gRNA均有一定活性。该对特异性的sgRNA在切割H11靶位点时特异性非常强,能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象,能大大增加外源基因定点插入的效率,进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的突变带来的影响。t

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