用于TORCH检测的探针、基因芯片和试剂盒
技术领域t
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一组用于TORCH检测的探针、基因芯片和试剂盒t
背景技术t
TORCH指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它是一组病原微生物的英文名称缩写，其中T(Toxopasma)是弓形虫，R(Rubella.Virus)是风疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨细胞，H(Herpes.Virus)即是单纯疱疹I/II型。t
这组微生物感染有着共同的特征，即可造成母婴感染。孕妇由于内分泌改变和免疫力下降易发生原发感染，既往感染的孕妇体内潜在的病毒也容易被激活而发生复发感染。孕妇发生病毒血症时，病毒可通过胎盘或产道传播感染胎儿，引起早产、流产、死胎或畸胎等，以及引起新生儿多个系统、多个器官的损害，造成不同程度的智力障碍等症状。特别在怀孕初的三个月胚胎处于器官形成期，此时受病毒感染，可破坏细胞或抑制细胞的分裂和增殖。器官形成期以后感染病毒，可破坏组织和器官结构，并可形成持续感染，出生后继续排毒，能引起相应的病变。TORCH的感染影响者人口素质，与优生优育有重要关系，其中：t
弓形虫(TOX):t
孕早期弓形虫感染引起的胎儿畸形主要包括：脑积水、小脑畸形、脉络膜视网膜炎及脑钙风疹病毒(RV)：t
化。血行感染可引起胎儿多器官坏死性损害，如肝脾肿大、心肌炎及血小板减少症等。t
RV主要通过呼吸道传播，孕妇感染后能使胎儿致畸，病毒通过胎盘感染胎儿形成先天性感染，称为先天性风疹综合症(CRS)，主要是先天性白内障、先天性心脏病和神经性耳聋，20周后感染者几乎无影响。风疹感染发生在孕期越早，胎儿的致畸也越严重。t
巨细胞病毒(CMV):t
感染后能引起宫内胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，新生儿死亡率较高，围产期母乳排毒所致的CMV感染率为63％。t
单纯疱疹病毒(HSVI、II型)：t
HSV通常潜伏在神经节。妊娠时母体的生理变化使HSV活化，孕早期感染能破坏胚芽面导致流产，孕中晚期虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。t
TORCH感染与胎儿的先天畸形一直是临床工作者和从事优生优育相关研究人员关注的热点，对病原体的准确检测和正确的诊断方法也是人们研究的重点。ELISA、分子杂交和PCR都曾经在临床检测中广泛应用于优生优育以及降低病残儿的出生率，但这些方法均存在各自 的缺点。t
PCR技术具有灵敏度高以及直接检测病原体基因的优势，但是对于四种病原体需要多管体系相对应，存在操作不便、对操作要求高等特点。ElISA、金标法均不是直接对病原体进行检测，并存在一定的窗口期，可能导致假阴性。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，在一张芯片上一次性完成四种病原体检测，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。t
传统的基因芯片技术的检测，是基于荧光标记探针的荧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。在临床检测应用过程中，由于检测单位需要投资购置激光扫描设备，一方面，显著增加了进行相关检测的投资成本，另一方面，也直接增加了应用成本，限制了该技术的市场应用与推广。t
发明内容t
本发明的目的是为了克服现有技术不足，提供一种快速准确、结果直观的TORCH检测基因芯片和试剂盒。t
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：t
一组用于TORCH检测的探针，包括弓形虫TOX探针、风疹RV探针、巨细胞病毒HCMV探针、巨细胞病毒HCMV探针和单纯疱疹病毒HSV II型探针；所述探针序列为：t
弓形虫TOX探针:SEQ ID NO.1；t
风疹RV探针：SEQ ID NO.2；t
巨细胞病毒CMV探针：SEQ ID NO.3；t
单纯疱疹病毒HSV I型探针：SEQ ID NO.4；t
单纯疱疹病毒HSV II型探针：SEQ ID NO.5。t
进一步地，本发明的内容还包括一种用于TORCH检测的基因芯片，包括固体相和上述探针。t
进一步地，本发明的内容还包括一种用于TORCH检测的基因芯片试剂盒，包括上述的基因芯片。t
进一步地，所述的TORCH检测的基因芯片试剂盒，还包括以下引物对，弓形虫TOX引物对、风疹RV引物对、巨细胞病毒CMV引物对、单纯疱疹病毒HSV引物对，所述引物对的序列分别为：t
弓形虫TOX引物对SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7；t
风疹RV引物对SEQ ID NO.8及SEQ ID NO.9；t
巨细胞病毒CMV引物对SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.11；t
单纯疱疹病毒HSV引物对SEQ ID NO.12及SEQ ID NO.13。t
进一步地，所述引物上含有有生物素标记。t
进一步地，所述的TORCH检测的基因芯片试剂盒还包括PCR反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂交缓冲液、洗涤液、BW反应液和TMB显色液。t
进一步地，所述阴性对照品为生理盐水，所述阳性对照品为含有目的基因的TOXO质粒、RV质粒、CMV质粒、HSVⅠ质粒和HSVⅡ质粒的混合液，所述目的基因分别如序列表SEQ ID NO.14～18所示。t
进一步地，所述杂交缓冲液为柠檬酸三钠0.3M、氯化钠3M、十二烷基硫酸钠0.3M、Triton X–1000.1％水溶液。t
进一步地，所述洗涤液分为洗涤液A和洗涤液B，所述洗涤液A为0.01-0.1N NaOH溶液，所述洗涤液B为0.1×SSC溶液。t
进一步地，所述BW反应液为用20×SSC缓冲液将HRP标记的亲合素稀释到适宜的浓度。t
本发明通过特异性的引物和探针的选择，结合基因芯片技术，不仅提高了检测效率和准确度，满足医院、产前检测等的现场检测的需求。t
本发明通过PCR技术对病原体DNA进行扩增，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过通过生物素标记，显色液进行显色后，直观的表现检测结果。本发明的基因芯片试剂盒，通过生物芯片的可见光光学放大，做到了信号分辨率高，信号可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统荧光标记具有良好的效果。t
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。t
附图说明t
附图1-5为利用本发明的基因芯片检测Torch 5中病原体质粒扩增杂交结果。其中图1A、B、C、D分别为TOX质粒浓度为2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4时，即体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的检测结果，E为阴性对照组。图2A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的RV质粒的检测结果，E为阴性对照组。图3A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的CMV质粒的检测结果，E为阴性对照组。图4A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的HSVI质粒的检测结果，E为阴性对照组。图5A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的HSVⅡ质粒的检测结果，E为阴性对照组。该检测方法，检测灵敏度高，能够检测出2×10-6ng/ul的模板，即检测限为2×10-4ng/ml。t
附图6-10为利用本发明的基因芯片检测多组临床样品的结果。其中，图6为提取6组TOX感染标本DNA，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图7为提取6组RV感染标本DNA，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图8为提取6组CMV感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图9为提取6组HSVI感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图10为提取6组HSVⅡ感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果。t
图11为将五种病原体提取DNA混合后进行扩增，并利用基因芯片进行检测，得到的结果。t
具体实施方式t
【实施例1】目标片段、引物和探针的确定t
根据报道的弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(RubellaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疹病毒I和II型(Herpes VirusI/II)的基因序列，选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列做为检测的靶序列；t
TOX的靶序列选择为弓形虫高度保守的B1基因部分序列(SEQ ID NO.14)，研究表明，人和相关物种中不能检出B1基因，而在21个弓形虫虫株中均能检出B1基因，B1基因具有高度特异性。t
RV病毒的靶序列选择为编码包膜糖蛋白E1的基因(SEQ ID NO.15)，E1基因相对其他片段具有高度保守性。t
CMV的靶序列选择为编码IE1的UL123基因(SEQ ID NO.16)。该基因编码的IE1对病毒的复制和致病能力起着很重要的作用。t
HSVI和HSVII的靶序列选择为编码单纯疱疹病毒DNA多聚酶催化亚单位的UL30基因序列保守区域，分别为(SEQ ID NO.17)和(SEQ ID NO.18)。UL30基因是单纯疱疹病毒的DNA聚合酶基因，在病毒基因组的复制及病毒增殖中起到重要作用。t
根据目标序列，靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计的各病原体引物与探针具体序列如下，为了使芯片结果进行显色液进行显色后，可直接通过肉眼的判读，在R引物5’端用生物素进行标记：t
Toxt
F引物:5’-TTTGCATAGGTTGCAGTCACT(SEQ ID NO.6)t
R引物:5’-biotin-GACCAATCTGCGAATACACCAA(SEQ ID NO.7)t
TOX探针：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCATGAGTATCTGTGCAAC(SEQ ID NO.1) t
RV：t
F引物：5’-GAACACCCGTTCTGCAACACG(SEQ ID NO.8)t
R引物：5’-biotin-ATGGCGTTGGCAAACCGGGGAG(SEQ ID NO.9)t
RV探针：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCGGGAGCCCGAATTGCCACGGC(SEQ ID NO.2) t
CMV:t
F引物：5’-GGAGAGCAGACTCTCAGAGGA(SEQ ID NO.10)t
R引物：5’-biotin-CGCCGCATTGAGGAGATCTC(SEQ ID NO.11)t
CMV探针：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCTTCATGCGACGAGATCTCCTCAAT(SEQ ID NO.3) t
HSV：t
F引物：5’-AGGCGCCCAAGCGTCCGG(SEQ ID NO.12)t
R引物：5’-biotin-GCTGGGGTACAGGCTGGCA(SEQ ID NO.13)t
HSV1探针：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGGGGCGAGCGGGAGCCGGA(SEQ ID NO.4) t
HSV2探针：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGAGGACGGGGACGAGGACGGGGACG(SEQ ID NO.5) t
【实施例2】芯片的制备 t
按真空气相沉淀法镀膜，使用旋转真空镀膜机在厚度约为2.5mm，直径20cm硅片(SiO2)上镀上475埃的氮化硅及135埃的TSPS的薄膜，制备出相应的生物传感器，并覆盖150埃的多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，最后经过1-10uM盐酸琥珀酸酰亚胺基烟酸盐处理20分钟，清水洗净供芯片制作。t
将氨基修饰的探针，按照表1排列分别将探针点样到处理好的芯片上，每组设两个平行点样点：室温下反应，制备出包含探针的基因芯片。t
表1TORCH芯片矩阵t
对照物PolyA探针序列为5’-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA t
按照芯片矩阵将氨基修饰PolyA探针点样到处理好的芯片上，室温下反应，制备出包含探针的基因芯片。t
【实施例3试剂盒的组成和检测方法】t
试剂盒组成： t
1、提取：本发明的试剂盒组成不包含DNA/RNA提取试剂，所用试剂为天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒，货号为DP438。t
2、扩增：PCR体系，组分见表2、表3t
其中CMV、HSV、TOX体系组成如下表2所示：t
表2TOX、CMV、HSVI、HSVⅡ扩增体系组成t
(表中对于TOX检测体系F-引物：TOX-F引物，TOX-R-引物。CMV检测体系F-引物：CMV-F引物，CMV-R-引物。HSV检测体系F-引物：HSV-F引物,HSV-R-引物。)t
RV为反转录病毒，体系配比如下表3所示：t
表3RV风疹病毒扩增体系t
反应体系中加入UNG酶能够去除扩增产物污染，减少假阳性结果；Taq酶、dUTP混合液、反转录扩增试剂、UNG酶购自深圳菲鹏生物股份有限公司。t
3、杂交：t
材料：t
阴性对照品：检测TORCH为阴性的生理盐水)；阳性对照：TORCH基因CMV质粒、HSVⅠ质粒、HSVⅡ质粒、TOXO质粒、RV质粒的混合液，具体为将目的基因片段合成后构建的质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)；杂交缓冲液：柠檬酸三钠0.3M、氯化钠3M、十二烷基硫酸钠0.3M、Triton X–1000.1％水溶液混合液)；洗涤液A(0.01-0.1N NaOH)；洗涤液B(0.1×SSC)；BW反应液：用20×SSC缓冲液将HRP标记的亲合素稀释到适宜的浓度；其中20×SSC：(NaCl:3M,柠檬酸三钠：0.3M)；TMB显色液为(生工生物工程(上海)有限公司购买的W-TMB显色试剂，货号：C510025-0005)；按照实施例2制得的基因芯片t
检测方法： t
①PCR过程：50℃2min；94℃5min；94℃、30s--56℃、30s--72℃、30s，进行40个循环；72℃、10min后备用t
②将PCR扩增产物95℃加热3分钟，新，迅速置于冰上；t
③取10ul PCR扩增产物至所制备生物芯片上；t
④取100ul杂交缓冲液于芯片上，在60℃反应60分钟；t
⑤用预热的洗涤液A溶液洗涤3次，每次5-10s；t
⑥将芯片置于50℃洗涤液B中洗涤1min，空气吹干芯片表面；t
⑦取BW反应液100ul于芯片上，室温反应10分钟；t
⑧用洗涤液B溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面；t
⑨取100ul TMB显色液于芯片表面，反应5分钟；t
⑩用洗涤液B溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面，照相机拍照或肉眼阅t
读信号。t
【实施例4灵敏度分析】 t
1.方法：利用含有目标片段的质粒HSVI质粒，HSVⅡ质粒，CMV质粒，TOXO质粒、RV质粒(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)对实施例2制备的基因芯片进行检验：合成质粒均为2ug，将质粒用1ml TE缓冲液溶解，质粒浓度为2ug/ml即2000ng/ml，将各种高浓度质粒按照10倍进行梯度稀释，稀释得到质粒浓度如下表4所示：t
表4稀释后待检测质粒的组别和浓度t
将不同质粒加入对应体系进行扩增，体系总体积为25ul，加入质粒模板量为2ul。t
按照实施例3的检测过程，利用本发明的基因芯片，对上述不同浓度的质粒的扩增结果进行检测。t
2.结果：图1-5为利用本发明的基因芯片检测Torch5种病原体质粒扩增杂交结果。其中图1A、B、C、D分别为TOX质粒浓度为2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4时，即体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的检测结果，E为阴性对照组。图2A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的RV质粒的检测结果，E为阴性对照组。图3A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的CMV质粒的检测结果，E为阴性对照组。图4A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的HSVI质粒的检测结果，E为阴性对照组。图5A、B、C、D分别为体系中模板含量为4×10-4ng、4×10-5ng、4×10-6ng和×10-7ng时的HSVⅡ质粒的检测结果，E为阴性对照组。该检测方法，检测灵敏度高，能够检测出2×10-6ng/ul的模板，即检测限为2×10-4ng/ml。t
【实施例5检出率分析】 t
1.取样：分别取6组临床感染TOX、RV、CMV、HSVI、HSVⅡ样本，提取DNA，通过PCR扩增后，利用本发明所述的基因芯片进行检测。t
2.结果：如图6-10，利用本发明提供的基因芯片可检出全部36份阳性样本，检出率为100％。其中，图6为提取6组TOX感染标本DNA，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图7为提取6组RV感染标本DNA，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图8为提取6组CMV感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图9为提取6组HSVI感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果；图10为提取6组HSVⅡ感染标本，通过PCR扩增后进行杂交得到结果。t
3.混合检测：将五种病原体提取DNA混合后进行扩增，并利用基因芯片进行检测，得到结果如11图，从结果来看，除了上文中对单独病原体能准确检出外，5种病原体混合存在情况下，也能准确检出。t
综上所述，本发明通过PCR技术对病原体DNA进行扩增，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过通过生物素标记，显色液进行显色后，直观的表现检测结果。本 发明的基因芯片试剂盒，通过生物芯片的可见光光学放大，做到了信号分辨率高，信号可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统荧光标记具有良好的效果。本发明通过特异性的引物和探针的选择，结合基因芯片技术，不仅提高了检测效率和准确度，满足医院、产前检测等的现场检测的需求。t
需要注意的是，上述仅以优选实施例对本发明进行了说明，并不能就此局限本发明的权利范围，因此在不脱离本发明思想的情况下，凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化，均应包含在本发明的权利要求范围内。t
