衣康酸和衣康酸甲酯生产
发明领域tt
本发明涉及能够生产衣康酸和/或衣康酸甲酯的重组微生物，和利用这tt种细胞生产衣康酸和/或衣康酸甲酯的方法。本发明还涉及发酵液，其包含tt通过这种方法能够获得的衣康酸和/或衣康酸甲酯。tt
发明背景
衣康酸是多种产品(例如，丙烯酸纤维、橡胶、人造钻石和镜头)的tt必须前体，其在化学工业中需求很高。通常，衣康酸分离自丝状真菌ttAspergillus terreus。此外，衣康酸酯可以是商品和专用化学品二者的重要tt中间体。在这方面，衣康酸单甲酯(即，4-甲基衣康酸酯和1-甲基衣康酸tt酯)尤其令人关注。tt
在近期，已通过过表达顺-乌头酸脱羧酶(CAD)和/或推定的衣康酸tt转运体来遗传修饰Aspergillus niger以产生衣康酸(WO2009014437、ttWO2009104958)。然而，Aspergilli不太适合衣康酸的工业生产，因为其tt丝状形态导致大规模生物反应器中的氧传递问题。tt
还已通过过表达CAD联合降低的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性来遗传tt修饰E.coli以产生衣康酸(US2010285546)。然而，这种方法是有问题的，tt因为E.coli和通常的原核生物不耐受低pH。在高pH发酵(例如约pH7，这tt对E.coli是最佳的)中，需要滴定以保持pH恒定，这导致衣康酸盐而非衣tt康酸的形成。这继而导致增加的DSP成本，因为相较于低pH发酵方法(其tt中可通过结晶从发酵液中直接回收酸)，从盐中回收酸更加复杂。tt
在更近期，非丝状酵母Yarrowia lipolytica已被遗传修饰以基于甘油生tt产衣康酸(US20110053232)。然而，经修饰的Y.lipolytica基于糖(可最tt常获得的可再生原料之一)不产生显著量的衣康酸。tt
因此，需要进一步改进基于在低pH下由糖发酵的衣康酸生产方法，从tt而可在工业生物反应器中实现经济上可行的大规模生产。tt
发明概述
本发明基于出乎意料的重组细胞(即遗传修饰的细胞)的鉴定，所述tt细胞可产生衣康酸和/或衣康酸的酯。这些细胞可以是酵母细胞。酵母的优tt点为：它耐受低pH并且不是丝状的，这允许以最佳方法条件产生衣康酸和tt/或衣康酸甲酯。tt
因此，本发明涉及重组细胞，其能够产生4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣tt康酸酯的一种或多种。tt
本发明还涉及重组酵母细胞，其能够产生衣康酸并且其过表达：tt
-编码具有顺乌头酸脱羧酶活性的多肽的核酸；和tt
-编码催化朝向乙酰CoA的反应的多肽的核酸。tt
本发明的重组细胞可被用于生产衣康酸和/或衣康酸的酯的方法中。因tt此，本发明提供：tt
-用于生产4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯的方法，所述方法包括：tt在合适的发酵培养基中发酵根据本发明的重组细胞，其中4-甲基衣tt康酸酯或1-甲基衣康酸酯被生产；tt
-用于生产衣康酸或衣康酸的酯的方法，所述方法包括：在合适的发tt酵培养基中发酵根据本发明的酵母细胞，其中衣康酸或衣康酸的酯tt被生产。tt
衣康酸或衣康酸的酯可被进一步转化成药品、化妆品、食品、饲料或tt化学产品。tt
此外，本发明提供发酵液，其包含通过本发明的方法能够获得的衣康tt酸和/或衣康酸的酯。tt
附图简述
图1a-d展示了允许衣康酸生产的代谢途径。编号的反应展示了如下的tt可被过表达的酶。反应(1)：丙酮酸羧化酶。细胞溶胶丙酮酸(pyruvate)tttttt和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(oxaloacetate)。反应(2)：线粒体草酰tt乙酸转运体。细胞溶胶草酰乙酸转运至线粒体草酰乙酸。反应(3)：线tt粒体膜柠檬酸转运体。线粒体柠檬酸(citrate)转运至细胞溶胶柠檬酸以tt及反之。反应(4)：乌头酸酶。柠檬酸转化为乌头酸(aconitate)。反应tt(5)：顺乌头酸脱羧酶。顺乌头酸转化为衣康酸(itaconate)。反应tt(6)：衣康酸转运体。细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸。反应(7)：tt柠檬酸合酶。细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸。反应(8)：tt乙酰化乙醛脱氢酶(acetylating acetaldehyde dehydrogenase)。细胞溶胶乙tt醛、NAD和辅酶A转化为乙酰辅酶A和NADH。反应(9)：磷酸酮醇酶。tt木酮糖5-磷酸转化为乙酰磷酸(acetyl phosphate)、甘油醛3-磷酸和水；或tt者果糖6-磷酸转化为乙酰磷酸、赤藓糖4-磷酸和水。反应(10)：磷酸乙tt酰转移酶。辅酶A和乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A和磷酸(phosphate)。反tt应(11)：ATP:乙酸磷酸转移酶。乙酸(acetate)和ATP转化为乙酰磷酸tt和ADP。通过较粗箭头强调的反应是预期与从葡萄糖向衣康酸和/或衣康酸tt转化相关的反应。tt
图2展示了允许衣康酸的酯生产的代谢途径。tt
序列表描述
序列描述展示于表4、5和6中。可参考序列表或参考同样在表4、5和6tt中展示的数据库登录号来定义本文中所述序列。tt
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求，词语“包含”、“包括”和“具有”tt以及它们的变体应被解释为包含性的。换言之，当语境允许时，这些词语tt旨在表达可能包含未明确列举的其它要素或整体。tt
本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即，一个/tt种或至少一个/种)语法对象。例如，“要素”可表示一个/种要素或多于tt一个/种要素。tt
在Aspergillus terreus中，从顺-乌头酸(三羧酸循环的中间体)合成衣tttttt康酸。负责将顺-乌头酸转化为衣康酸的酶是顺-乌头酸脱羧酶。我们已经tt展示了：可在重组细胞中过表达这种酶以使通常不产生衣康酸的细胞可产tt生衣康酸。过表达一种或多种催化向乙酰-CoA的反应的酶可以进一步提高tt衣康酸产物的量。此外，这种重组细胞可通过过表达一种或多种导致产生tt衣康酸的酯的酶而产生这种酯。tt
在本发明的语境中，过表达表示：给定的核酸序列和/或氨基酸序列在tt本发明的重组细胞中比在参照细胞中更高程度地表达，其中所述参照细胞tt典型地可为相应的野生型细胞(即，相同物种的野生型细胞)。核酸和/或tt多肽可以是过表达的，在这种意义上，在参照细胞中表达的核酸和/或多肽tt在本发明的重组细胞中更高程度地表达(参照细胞可根本不表达核酸和/或tt多肽)。过表达可例如通过对参照细胞內源的(或同源的)核酸和/或多肽tt的过表达发生。过表达可例如通过对参照细胞外源的(或异源的)核酸和/tt或多肽的过表达发生。换言之，过表达可例如通过天然存在于参照细胞中tt的核酸和/或多肽的过表达发生。过表达可例如通过参照细胞中根本不存在tt或不表达的核酸和/或多肽的过表达发生。tt
本发明的重组细胞可过表达至少一种外源核酸和/或多肽以及过表达至tt少一种内源核酸和/或多肽。tt
除非另外说明，本文中提到羧酸或羧酸酯(例如衣康酸/衣康酸酯)应tt被理解为包括质子化的羧酸(游离酸)、相应的羧酸根(其共轭碱)及其tt盐。tt
因此，根据本发明，提供重组酵母，其包含一种或多种核苷酸序列，tt所述核苷酸序列编码(或者，任选地过表达)：tt
具有顺-乌头酸脱羧酶活性的多肽；和tt
导致向乙酰-CoA的流增加的遗传修饰。tt
根据本发明，通过增加产生一种或多种前体(包括顺乌头酸、柠檬酸、tt草酰乙酸、乙酰辅酶A和乙酰磷酸)的多种代谢反应速率的组合来实现水tt平提高的衣康酸和衣康酸甲酯生产。换言之，编码进行这些反应的多肽的tt核酸序列可被过表达。tt
因此，可将两个或更多个下述反应的组合组织成一个或多个代谢途径tttttt(下述编号遵循图1a-d中所示的)：tt
反应(1)：丙酮酸羧化酶。细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草tt酰乙酸。tt
反应(2)：线粒体草酰乙酸转运体。细胞溶胶草酰乙酸转运至线粒tt体草酰乙酸。tt
反应(3)：线粒体膜柠檬酸转运体。线粒体柠檬酸转运至细胞溶胶tt柠檬酸以及反之。tt
反应(4)：乌头酸酶。柠檬酸转化为乌头酸。tt
反应(5)：顺乌头酸脱羧酶。顺乌头酸转化为衣康酸。tt
反应(6)：衣康酸转运体。细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸。tt
反应(7)：柠檬酸合酶。细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬tt酸。tt
反应(8)：乙酰化乙醛脱氢酶。细胞溶胶乙醛、NAD和辅酶A转化为tt乙酰辅酶A和NADH。tt
反应(9)：磷酸酮醇酶。木酮糖5-磷酸转化为乙酰磷酸、甘油醛3-磷tt酸和水；或者果糖6-磷酸转化为乙酰磷酸、赤藓糖4-磷酸和水。tt
反应(10)：磷酸乙酰转移酶。辅酶A和乙酰磷酸转化为乙酰辅酶Att和磷酸。这种酶可被称为乙酰-CoA:Pi乙酰转移酶或乙酰-CoA:磷酸乙酰转tt移酶。tt
反应(11)：ATP:乙酸磷酸转移酶。乙酸和ATP转化为乙酰磷酸和ttADP。tt
一些优选的组合为：tt
A：反应(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)-参见图1a。tt
B：反应(1)、(8)、(7)、(4)、(5)和(6)-参见图1b。tt
C：反应(1)、(9)、(10)、(7)、(4)、(5)和(6)-参见tt图1c。tt
D：反应(1)、(11)、(10)、(7)、(4)、(5)和(6)-参tt见图1d。tt
编码进行所述反应的多肽的任何合适核酸序列均可被用于本发明中。tttttt一些实例包括：tt
反应(1)：SEQ ID NO:25或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(2)：SEQ ID NO:23或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(3)：SEQ ID NO:21或47或与所述序列中的任何一种的序列同tt一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(4)：SEQ ID NO:15、17或19或与所述序列中的任何一种的序tt列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(5)：SEQ ID NO:7、9、11或13或与所述序列中的任何一种的tt序列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少tt75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(6)：SEQ ID NO:1、3或5或与所述序列中的任何一种的序列tt同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(7)：SEQ ID NO:27、29或31或与所述序列中的任何一种的序tt列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(8)：SEQ ID NO:33或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(9)：SEQ ID NO:35或37或与所述序列中的任何一种的序列同tt一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(10)：SEQ ID NO:41、43或45或与所述序列中的任何一种的tttttt序列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少tt75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(11)：SEQ ID NO:39或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
因此，根据本发明的细胞可表达和/或过表达进行所示反应的多肽。进tt行所示反应的任何多肽都可以是合适的。一些实例包括：tt
反应(1)：SEQ ID NO:26或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(2)：SEQ ID NO:24或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(3)：SEQ ID NO:22或48或与所述序列中的任何一种的序列同tt一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(4)：SEQ ID NO:16、18或20或与所述序列中的任何一种的序tt列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(5)：SEQ ID NO:8、10、12或14或与所述序列中的任何一种tt的序列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至tt少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(6)：SEQ ID NO:2、4或6或与所述序列中的任何一种的序列tt同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(7)：SEQ ID NO:28、30或32或与所述序列中的任何一种的序tt列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(8)：SEQ ID NO:34或与其序列同一性为至少50％(或与其序tttttt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(9)：SEQ ID NO:36或38或与所述序列中的任何一种的序列同tt一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(10)：SEQ ID NO:42、44或46或与所述序列中的任何一种的tt序列同一性为至少50％(或与其序列同一性为至少60％、至少70％、至少tt75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
反应(11)：SEQ ID NO:40或与其序列同一性为至少50％(或与其序tt列同一性为至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％)的序列。tt
如上所述，可将两个或更多个这些反应的组合组织成一个或多个下述tt代谢途径，所述代谢途径包括：tt
途径1包含至少一个或多个下述反应，典型地其中一个或多个被过表tt达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
线粒体柠檬酸转运至细胞溶胶(例如，SEQ ID NO:21或47或与所述tt序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
线粒体草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为线粒体柠檬酸；tt
细胞溶胶草酰乙酸转运至线粒体(例如，SEQ ID NO:23或与其序列tt同一性为至少50％的序列)；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％的序列)。tt
优选地，在途径1中，编码具有下述活性的多肽的核酸在本发明的重tttttt组细胞中过表达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
线粒体柠檬酸转运至细胞溶胶(例如，SEQ ID NO:21或47或与所述tt序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少tt75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸转运至线粒体(例如，SEQ ID NO:23或与其序列tt同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、tt至少95％、至少98％或至少99％的序列)；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少tt80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)。tt
途径2包含至少一个或多个下述反应，典型地其中一个或多个被过表tt达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tttttt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶乙醛、NAD和辅酶A转化为乙酰辅酶A和NADH(例如，SEQ ttID NO:33或与其序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％的序列)。tt
优选地，在途径2中，编码具有下述活性的多肽的核酸在本发明的重tt组细胞中过表达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、tt至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％tt的序列)；tt
细胞溶胶乙醛、NAD和辅酶A转化为乙酰辅酶A和NADH(例如，SEQ ttID NO:33或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、tt至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少tt80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)。tt
途径3包含至少一个或多个下述反应，典型地其中一个或多个被过表tttttt达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A(例如，SEQ ID NO:41、43或45tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
木酮糖-5-磷酸和磷酸转化为乙酰磷酸和甘油醛3-磷酸(例如，SEQ ID ttNO:35或37或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
6-磷酸葡萄糖酸和NADP转化为木酮糖-5-磷酸、NADPH和二氧化碳；tt
葡萄糖-6-磷酸和NADP转化为6-磷酸葡萄糖酸和NADPH；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％的序列)。tt
优选地，在途径3中，编码具有下述活性的多肽的核酸在本发明的重tt组细胞中过表达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、tt至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％tt的序列)；tt
细胞溶胶乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A(例如，SEQ ID NO:41、43或45tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
木酮糖-5-磷酸和磷酸转化为乙酰磷酸和甘油醛3-磷酸(例如，SEQ ID ttNO:35或37或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少tt60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或至少95％、至少98％tt或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少tt80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)。tt
途径4包含至少一个或多个下述反应，典型地其中一个或多个被过表tt达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A(例如，SEQ ID NO:41、43或45tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶乙酸和ATP转化为乙酰磷酸、ADP和磷酸(例如，SEQ ID ttNO:39或与其序列同一性为至少50％的序列)；tt
细胞溶胶丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％的序列)。tt
优选地，在途径4中，编码具有下述活性的多肽的核酸在本发明的重tt组细胞中过表达：tt
细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5或与tt所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶顺乌头酸转化为衣康酸(例如，SEQ ID NO:7、9、11或13tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
细胞溶胶柠檬酸转化为顺乌头酸(例如，SEQ ID NO:15、17或19或tt与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸(例如，SEQ ID NO:27、tt29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、tt至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％tt的序列)；tt
细胞溶胶乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A(例如，SEQ ID NO:41、43或45tt或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少tt70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的tt序列)；tt
细胞溶胶乙酸和ATP转化为乙酰磷酸、ADP和磷酸(例如，SEQ ID ttNO:39或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；和tt
细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸(例如，SEQ ID NO:tt25或与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少tt80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)。tt
可根据过表达的所述多肽限定每种上述途径。因此，可根据由上文所tt限定的核酸编码的多肽(参见表4-6)和与这种多肽的序列同一性为至少tt50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、tt至少98％或至少99％的序列来限定所述途径。tt
因此，根据本发明，提供经遗传修饰的酵母，其包含一个和更多个这tt些代谢途径，其中这些代谢途径中的一种或多种酶的过表达赋予酵母细胞tt产生提高水平的衣康酸的能力。tt
此外，提供能够产生4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯中的一种或多tt种的细胞。典型地，这种重组细胞是其中一种或多种编码以下多肽的核酸tt序列被过表达的细胞，所述多肽能够催化一种或多种下述转化：tt
a.顺乌头酸向衣康酸(例如SEQ ID NO:7、9、11或13或与所述序列中tt的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至tt少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
b.衣康酸向4-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:69或与其序列同一性为tt至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
c.衣康酸向1-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:68或与其序列同一性为tt至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
d.顺乌头酸向反乌头酸(例如SEQ ID NO:70或与其序列同一性为至tt少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、tt至少98％或至少99％的序列)；tt
e.反乌头酸向(E)-3-羧基-2-戊烯二酸5-甲酯(例如SEQ ID NO:69或与tt其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至tt少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
f.反乌头酸向(E)-3-(甲氧羰基)戊-2-烯二酸酯(例如SEQ ID NO:68或tt与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、tt至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
g.(E)-3-羧基-2-戊烯二酸5-甲酯向4-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:7、tttttt9、11或13或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、tt至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％tt的序列)；和tt
h.(E)-3-(甲氧羰基)戊-2-烯二酸酯向1-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:tt7、9、11或13或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少tt60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或tt至少99％的序列)。tt
典型地，这种重组细胞是其中一种或多种多肽被过表达的细胞，所述tt多肽能够催化一种或多种下述转化：tt
a.顺乌头酸向衣康酸(例如SEQ ID NO:8、10、12或14或与所述序列tt中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、tt
至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
b.衣康酸向4-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:66或与其序列同一性为tt至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
c.衣康酸向1-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:65或与其序列同一性为tt至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少tt95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
d.顺乌头酸向反乌头酸(例如SEQ ID NO:67或与其序列同一性为至tt少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、tt至少98％或至少99％的序列)；tt
e.反乌头酸向(E)-3-羧基-2-戊烯二酸5-甲酯(例如SEQ ID NO:66或与tt其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至tt少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
f.反乌头酸向(E)-3-(甲氧羰基)戊-2-烯二酸酯(例如SEQ ID NO:65或tt与其序列同一性为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、tt至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列)；tt
g.(E)-3-羧基-2-戊烯二酸5-甲酯向4-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:8、tt10、12或14或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少tttttt60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或tt至少99％的序列)；和tt
h.(E)-3-(甲氧羰基)戊-2-烯二酸酯向1-甲基衣康酸酯(例如SEQ ID NO:tt8、10、12或14或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少50％、至少tt60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或tt至少99％的序列)。tt
能够产生1-甲基衣康酸酯的本发明的重组细胞可包含一种或多种核酸tt序列，所述核酸序列编码能够催化下述转化的多肽：tt
-a和c；或者tt
-d、f和h。tt
可根据过表达的多肽限定这种重组细胞。因此，可根据由上文所限定tt的核酸编码的多肽(参见表4-6)和与这种多肽的序列同一性为至少50％、tt至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％tt或至少99％的序列来限定所述途径。tt
能够产生4-甲基衣康酸酯的本发明的重组细胞可包含一种或多种核酸tt序列，所述核酸序列编码能够催化下述转化的多肽：tt
-a和b；或者tt
-d、e和g。tt
可根据过表达的多肽限定这种重组细胞。因此，可根据由上文所限定tt的核酸编码的多肽(参见表4-6)和与这种多肽的序列同一性为至少50％、tt至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％tt或至少99％的序列来限定所述途径。tt
参考具体的核酸或多肽来限定上文所鉴定的转化。这些核酸和多肽仅tt以示例性方式给出，其不应被视为限制。可使用任何编码具有期望活性的tt多肽的合适核酸或可使用任何具有期望活性的多肽。与本文中明确列出的tt那些序列相关的序列可被用于本发明中。tt
合适的核酸可编码如上文所鉴定的核酸中的一种编码的多肽或者与本tt文中所鉴定的核酸中的一种编码的多肽享有至少约50％、至少约60％、至tt少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％tttttt的序列同一性的多肽。tt
换言之，适用于本文中的核酸和多肽与本文中具体鉴定的核酸或多肽tt的序列同一性可为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、tt至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％tt至少99％。tt
因此，根据本发明，还提供代谢途径，所述代谢途径包含由表4中列tt出的氨基酸序列催化的反应，其中在经遗传修饰的酵母细胞中过表达一种tt或多种相同代谢途径内的那些氨基酸序列赋予酵母细胞产生提高水平的衣tt康酸或衣康酸的酯的能力。tt
可通过组成型强启动子控制重组细胞中这些氨基酸序列的表达水平，tt赋予重组细胞产生提高水平的衣康酸和/或衣康酸的酯的能力。tt
因此，根据本发明，还提供经遗传修饰的酵母细胞，其包含一种或多tt种如上所述的代谢途径的过表达和丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、异柠檬酸脱tt氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶或琥珀酰-CoA连接酶的缺失，其中所述缺失赋tt予酵母细胞产生提高水平的衣康酸和衣康酸甲酯的能力。tt
当在本文中使用时，根据本发明的重组细胞或重组酵母细胞被限定为tt这样的细胞，其含有一种或多种非天然存在于酵母中的核苷酸序列和/或蛋tt白，或者被一种或多种非天然存在于酵母中的核苷酸序列和/或蛋白转化或tt遗传修饰，或者其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外的一个或多个拷tt贝。野生型细胞或酵母细胞在本文中被限定为重组细胞或酵母细胞的亲本tt细胞或酵母细胞。tt
当使用术语“同源”来表示给定的(重组)核酸或多肽分子以及给定tt的宿主生物体或宿主细胞的关系时，其被理解为表示：所述核酸或多肽分tt子天然地由相同物种的宿主细胞或生物体产生，优选地由相同变种tt(variety)或菌株的宿主细胞或生物体生产。tt
当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用术语“异源”时，其指的是tt这样的核酸或蛋白质，其不作为其所存在的生物体、细胞、基因组或者ttDNA或RNA序列的一部分天然存在，或者其存在于与其天然存在的细胞或tt基因组或DNA或RNA序列位置不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列位tttttt置处。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是获自另一tt细胞或合成生产或重组产生。tt
序列同一性在本文中被限定为通过比较序列所确定的两种或更多种氨tt基酸(多肽或蛋白质)序列或者两种或更多种核酸(多核苷酸)序列之间tt的关系。通常，在被比较序列的全长上比较序列。在本领域，根据具体情tt况，“同一性”还表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，其通过这种tt序列串之间的匹配所确定。tt
本文中所使用的参数“同一性”描述了两种氨基酸序列之间或两种核tt苷酸序列之间的相关性。为了本发明的目的，使用如EMBOSS软件包tt(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套组(The European Molecular Biology ttOpenSoftware Suite)，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277；tthttp://emboss.org)的Needle程序(优选地3.0.0版本或之后的版本)中执行的ttNeedleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-tt453)来确定两种氨基酸序列之间的同一性程度。所用的任选参数为：缺口tt开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的ttEMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-ttnobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：tt
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)tt
编码催化如本文所述的转化的酶的核苷酸序列还可以通过其在中等tt(或者，优选地在严格)杂交条件下与编码能够催化所述反应的酶的核苷tt酸序列杂交的能力来限定。tt
严格杂交条件在本文中被定义为这样的条件，其允许至少约25，优选tt地约50个核苷酸，75或100且最优选地约200或更多个核苷酸的核酸序列在tt约65℃的温度下在包含约1M盐(优选地6×SSC(氯化钠、柠檬酸钠))tt或具有相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，并在65℃下在包含约0.1Mtt盐或更少(优选地0.2×SSC)或具有相当的离子强度的任何其它溶液中洗tt涤。优选地，过夜进行杂交(即至少持续10小时)且优选地，洗涤进行至tt少1小时并至少更换2次洗涤溶液。这些条件通常将允许具有约90％或更高tt序列同一性的序列特异性杂交。tt
中等条件在本文中被定义为这样的条件，其允许至少50个核苷酸，优tt选地约200或更多核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下在包含约1M盐(优tt选地6×SSC)或具有相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，并在室温下tt在包含约1M盐(优选地6×SSC)或具有相当的离子强度的任何其它溶液tt中洗涤。优选地，过夜进行杂交(即至少持续10小时)且优选地，洗涤进tt行至少1小时并至少更换2次洗涤溶液。这些条件通常将允许具有达到50％tt序列同一性的序列特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件tt以特异性鉴定同一性在50％-90％之间变化的序列。tt
当在本文中使用时，术语“基因”指的是含有核酸聚合酶(在真核生tt物中为RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，然后ttmRNA被翻译成蛋白质。tt
当在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核tt苷酸或核糖核苷酸多聚体(即多核苷酸)，除非另有限制，其包括具有天tt然核苷酸本质属性的已知类似物从而它们以类似于天然存在的核苷酸的方tt式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基tt因或调节基因的全长或子序列(subsequence)。除非另有说明，该术语包tt括示出的序列及其互补序列。tt
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，其指的是tt氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的tt天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在tt的氨基酸聚合物。天然存在氨基酸的这种类似物的本质属性为：当被引入tt蛋白质中时，该蛋白质与下述抗体有特异反应性，所述抗体针对相同但是tt完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和tt“蛋白质”还包括下述修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、tt硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。tt
当在本文中使用时，术语“酶”被限定为在细胞(例如酵母细胞)中tt催化(生物)化学反应的蛋白质。tt
为了提高引入的酶在本发明的酵母中以活性形式表达的可能性，可以tt调整相应的编码核苷酸序列，从而针对选择的酵母细胞优化其密码子使用。tttttt用于密码子优化的若干方法是本领域已知的。针对酵母优化核苷酸序列密tt码子使用的一个优选方法是WO2008/000632中公开的密码子对优化技术。tt密码子对优化是用于在宿主细胞中生产多肽的方法，其中修饰了编码多肽tt的核苷酸序列的密码子使用、尤其是使用的密码子对，以获得编码多肽的tt核苷酸序列提高的表达和/或提高的多肽生产。密码子对被定义为编码序列tt中两个相继三联体(密码子)的集合。tt
通常，编码被引入本发明的细胞中的酶的核苷酸序列与引起相应核苷tt酸序列在根据本发明的细胞中充足表达的启动子可操作性连接，从而赋予tt所述细胞所述酶的能力。tt
当在本文中使用时，“可操作性连接”是指处于功能性关系中的多核tt苷酸元件(或编码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被放置为与另一核tt酸序列处于功能性关系时，其是“可操作性连接”的。例如，如果启动子tt或增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作性连接。tt
当在本文中使用时，术语“启动子”指的是下述核酸片段，其发挥控tt制一个或多个基因转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，tt并且在结构上通过DNA-依赖型RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域tt技术人员已知的任何其他DNA序列的存在而被识别。“组成型”启动子是tt在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境tt或发育调控下有活性的启动子。tt
能够用于实现编码酶的核苷酸序列表达的启动子对编码待表达酶的核tt苷酸序列而言可以不是天然的，即，对与之可操作性连接的核苷酸序列(编tt码序列)而言异源的启动子。优选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源的，tt即内源的。tt
在该上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型天然启动子二者以及tt经改造启动子，其是本领域技术人员众所周知的。真核宿主细胞中合适的tt启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、ttPH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。另tt一些合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。tt
通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在细胞中tttttt有功能的任何终止子。优选的终止子获自宿主细胞的天然基因。合适的终tt止子序列在本领域众所周知。优选地，这种终止子与下述突变组合，所述tt突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA降解(nonsense mediated ttmRNA decay)(参见例如：Shirley等，2002，Genetics 161：1465-1482)。tt
在本发明中，编码催化如本文所述转化的酶的核苷酸序列可被过表达，tt从而实现所述酶在根据本发明的重组细胞中提高的生产。tt
本领域存在多种手段用于在本发明的酵母细胞中过表达编码酶的核苷tt酸序列。特别地，可以通过增加细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过tt在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒(centromeric)tt载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因tt的(附加体)表达载体，来过表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成tt型启动子实现编码根据本发明的酶的过表达。tt
核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明tt的酵母可包含单拷贝或多拷贝编码酶的核苷酸序列，所述酶编码给出的转tt化，例如通过多拷贝的核苷酸构建体。tt
核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例tt如常染色体复制序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或ttpKD1质粒(Gleer等人，1991，Biotechnology 9：968-975)或AMA质粒tt(Fierro等人，1995，Curr Genet.29：482-489)。或者，可以将每种核酸构建tt体以一个或多个拷贝整合进酵母细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合tt可以通过非同源重组随机发生，但是优选地，可以如本领域所众所周知的，tt通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中(参见例如ttWO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186)。tt
在本发明中，除了转运体多肽之外，优选地，在本发明的重组细胞中tt表达的一种或多种酶在编码核苷酸序列表达后在细胞溶胶中有活性。对于tt细胞的衣康酸或衣康酸酯高生产力，酶的细胞溶胶活性是优选的。tt
编码催化如本文所述的转化的酶的核苷酸序列可包含过氧化物酶体或tt线粒体靶向信号，例如通过Schlüter等人，Nucleic acid Research 2007，25tt卷，D815-D822所公开的方法所测定。如果酶包含靶向信号，那么可优选tttttt的是：根据本发明的酵母包含截短形式的酶，其中靶向信号被移除。tt
本发明的重组细胞可以是酵母细胞。根据本发明的酵母优选地属于ttSaccharomyces、Pichia、Kluyveromyces或Zygosaccharomyces属中的一种。tt更优选地，酵母细胞可以是Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces ttuvarum、Saccharomyces bayanus、Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、ttK.lactis、K.thermotolerans或Zygosaccharomyces bailii。tt
在一个优选的实施方式中，根据本发明的酵母可以能够在本领域已知tt的任何合适碳源上生长并将它转化为衣康酸或衣康酸酯。酵母可以能够直tt接转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、果糖、tt麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和tt甘油。因此，一个优选的酵母细胞表达将纤维素转化为葡萄糖单体和将半tt纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体所需的酶，例如纤维素酶(内切纤维素酶tt和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，tt能够将果胶转化为葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄tt糖单体的淀粉酶。酵母表达这种酶的能力可天然存在或者可已通过遗传修tt饰酵母获得。优选地，酵母能够转化选自以下的碳源：葡萄糖、果糖、半tt乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和甘油。tt
在另一方面，本发明涉及制备衣康酸或衣康酸酯的方法，所述方法包tt括：在合适的发酵培养基存在下，发酵根据本发明的酵母细胞。合适的发tt酵培养基是本领域技术人员已知的。优选地，根据本发明的方法中产生的tt衣康酸酯是4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯。tt
根据本发明的用于生产衣康酸或衣康酸酯的方法可在1和9之间的任何tt合适pH下进行。优选地，发酵液中的pH在2和7之间，优选地在3和5之间。tt发现能够在低pH下实施根据本发明的方法是有利的，因为这防止细菌污染。tt此外，因为pH在衣康酸生产过程中降低，所以需要较少量的滴定剂以将ttpH保持在期望水平。tt
可以实施根据本发明的方法的合适温度在5℃和60℃之间，优选地在tt10℃和50℃之间，更优选地在15℃和35℃之间，更优选地在18℃和30℃之tt间。本领域技术人员已知用于发酵特定酵母细胞的最佳温度。tt
优选地，通过本领域已知的合适方法(例如通过结晶)从发酵液中回tt收衣康酸或衣康酸酯。tt
优选地，在根据本发明的方法中制备的衣康酸或衣康酸酯被进一步转tt化成期望的产物，例如药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。特别地，tt衣康酸或衣康酸的酯可被进一步转化为聚合物。tt
标准的遗传技术例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或tt杂交技术是本领域已知的方法，例如Sambrook和Russel(2001)″Molecular ttCloning：A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory，ttCold Spring Harbor Laboratory Press或F.Ausubel等人,编,″Current ttprotocols in molecular biology″，Green Publishing and Wiley Interscience，ttNewYork(1987)中所述。用于真菌宿主细胞转化、遗传修饰等等的方法从tt例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、ttWO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中已知。tt
本文中作为现有技术所给出的专利文件或其它材料的引用并不能被认tt为是承认所述文件或材料在任何一项权利要求的优先权日时是已知的，或tt者其所包含的信息是公知常识的一部分。tt
本文中陈述的每个引用的公开内容通过引用以整体并入本文中。tt
通过下述实施例进一步阐释本发明。tt
实施例tt
实施例1：在Saccharomyces cerevisiae中过表达用于衣康酸和衣康酸甲酯生产的不同代谢途径的酶
1.1表达构建体
通过如PCT/EP2007/05594中关于S.cerevisiae所公开的密码子对优化方tt法获得SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、tt27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的核苷酸序列并合成。合tt成SEQ ID NOs 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、tt62、63和64的核苷酸序列。根据共同未决专利申请编号US61/616254和ttWO2013/144257中所述方法，由这些序列(启动子、开放阅读框和终止子)tttttt构建表达盒。使用形成的表达盒(盒117-盒149)作为模板PCR扩增转化中tt使用的DNA片段的。tt
1.2制备和纯化用于转化的PCR片段
根据共同未决专利申请编号US61/616254和WO2013/144257中所述方tt法进行衣康酸途径的组装和整合。利用与接头结合的标准引物组，从质粒tt扩增具有接头序列的表达盒。所述引物在共同未决专利申请号ttUS61/616254和WO2013/144257的SEQ ID NOs:87-110中被展示，并以接头tt和扩增方向来命名。例如“con 5fw”是接头5上的正向引物。该实验中仅tt使用引物的子集。表1展示了与PCR反应中所用的对应PCR模板一起使用的tt引物。利用Phusion聚合酶(Finnzymes)并根据手册进行PCR反应。tt
表1：S.cerevisiae转化中使用的用于产生带有接头的表达盒的所有盒、盒内容和引物组合的总述
使用含有作为模板DNA的片段的标准质粒扩增显性标记KanMX。使tt用CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，通过PCR扩增5’和3’INT1缺失侧tt翼。所使用的显性标记、整合侧翼和引物与共同未决专利申请编号ttUS61/616254和WO2013/144257中所述方法中使用的相同。利用标准的琼tt脂糖电泳技术检查PCR片段的大小。利用Macherey-Nagel的96ttttttPCR磁珠试剂盒并根据手册纯化PCR扩增的DNA片段。使用GC生物科技tt的Trinean96测量DNA浓度。tt
1.3转化片段至S.cerevisiae
如Gietz和Woods(2002；Transformation of the yeast by the LiAc/SS ttcarrier DNA/PEG method.Methods in Enzymology 350:87-96)所述进行S.ttcerevisiae转化。tt
用1μg每种经扩增和纯化的PCR片段转化CEN.PK1137D(MATa URA3 ttHIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2)和PDC1 KO菌株。每种转化将导致带有衣tt康酸盒和KanMX标记的“衣康酸途径”被整合入基因组INT1位点上。将tt转化混合物涂布在含G418(400μg/ml)的YEPhD-琼脂(BBL植物蛋白胨20.0ttg/l，酵母提取物10.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l和2％葡萄糖)上。在30℃tt下孵育3天后，菌落出现在平板上，但阴性对照(即，转化实验中不加入ttDNA)导致空白平板。表2展示了对CEN.PK1137D和PDC1 KO菌株二者进tt行的转化的总述。tt
表2每种转化中被转化的盒的总述
1.4培养转化体
挑取单菌落并转移至含有200μl YEPhD-琼脂(含400μg/ml G418)的ttMTP琼脂孔中。对于每种转化，2-4个菌落被用于进一步分析。在30℃下tt孵育平板3天后，通过用接种针(pin tool)转移一些菌落材料从而将生长tttttt良好的菌落接种在带有标准盖的MTP平板中，所述MTP平板的每个孔中含tt200μL Verduyn培养基(Verduyn等人,Yeast 8:501-517,1992，其中用2g/ltt尿素代替(NH4)2SO4))，所述培养基含有基于淀粉的碳源和在培养期间提tt供葡萄糖释放的酶。在MTP摇床(INFORS HT Multitron)中于30℃、550ttrpm和80％湿度下孵育MTP 72小时。在这种预培养阶段之后，通过转移tt80μl培养液至4ml Verduyn培养基(同样用尿素代替(NH4)2SO4))中来启动tt生产阶段，所述培养基含有基于淀粉的碳源和在培养期间提供葡萄糖释放tt的酶。在摇床中于550rpm、30℃和80％湿度下生长7天后，在Heraeus ttMultifuge 4中于2750rpm下离心平板10分钟。转移上清液至MTP平板中并tt利用下文所述的LC-MS方法测量上清液中的衣康酸水平。tt
1.5检测衣康酸和衣康酸甲酯
UPLC-MS/MS分析方法用于测定衣康酸和克雷布斯(Krebs)循环的tt其它化合物。Waters HSS T3柱1.7μm,100mm*2.1mm被用于分离梯度洗tt脱的衣康酸、琥珀酸、柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸和富马酸，以及可能的tt衣康酸的甲酯和乙酯。洗脱液A由含0.1％甲酸的LC/MS级水组成，洗脱液ttB由含0.1％甲酸的乙腈组成。流速为0.35ml/min，柱温保持恒定为40℃。tt梯度起始于95％A并在10分钟中线性增加至30％B，保持在30％B持续2分tt钟，然后立即至95％A并稳定5分钟。使用的注射体积为2μl。tt
使用多反应监测(MRM)，在负离子模式下以电喷射(ESI)使用ttWaters Xevo API。在流速为500L/hr下，离子源温度被保持在130℃，但去tt溶温度为350℃。tt
对于衣康酸和克雷布斯循环的其它化合物，用10eV使去质子化分子tt片段化，由H2O和CO2的丢失产生特异性片段。空白发酵液中掺入参照化tt合物标准品被分析以确认保留时间，针对各种离子计算响应因子，其被用tt来计算发酵样品的浓度。在洗脱液A中恰当稀释所有样品(5-25倍)以克tt服LC-MS分析期间的离子抑制和基质效应。精确质量分析衣康酸和衣康酸tt的酯。为了确认所分析的化合物的元素组成，利用与上述相同的连接有ttLTQ轨道阱(ThermoFisher)的色谱系统进行精确质量分析。使用NaTFA混合tt物(参照)，以恒速输注模式进行质量校正，从而在实验设置期间，所有tttttt被分析化合物经分析的精确质量可拟合在距离理论质量2ppm之内。tt
1.6衣康酸和衣康酸甲酯浓度
每个途径组和每个菌株组的衣康酸浓度展示于表3中。表中的浓度是tt每个菌株或途径组的中值。LC-MS分析还在样品中检测了4-甲基衣康酸酯tt并利用标准品证实了质量和保留时间。样品中发现的4-甲基衣康酸酯浓度tt在100-200mg/l范围内。tt
表3：衣康酸浓度结果
表4：序列表说明
表5：序列表说明
表6：序列表说明
